專利名稱：在植物體細胞胚胎發(fā)生中從多孔基材除去液體的方法
在植物體細胞胚胎發(fā)生中從多孔基材除去液體的方法
背景技術(shù)：
現(xiàn)代育林往往需要種植大量已經(jīng)選定的、在基因上相同的植物以具有有益的特性。通過有性繁殖產(chǎn)生新植物，這生長出植物種子，通常是不可行的。通過培養(yǎng)體細胞或合子胚胎的無性繁殖已被證明針對ー些物種生長出大量的在基因上相同的胚胎，每ー個胚胎均有能力發(fā)育成為正常的植物。體細胞克隆是除雄雌交配以外的從植物組織創(chuàng)造在基因上相同的植物的方法。在體細胞克隆的方法之一中，在包含諸如生長素和/或細胞分裂素的激素的初始培養(yǎng)基中培養(yǎng)植物組織，以開始形成能夠發(fā)育成體細胞胚胎的諸如胚性胚柄團的胚性組織。然后在促進胚性組織的定居和増殖的増殖培養(yǎng)基中進ー步培養(yǎng)胚性組織以形成子葉前期胚胎(即， 不具備子葉的胚胎)。然后在促進子葉體細胞胚胎的發(fā)育和成熟的發(fā)育培養(yǎng)基中培養(yǎng)子葉前期胚胎，所述子葉體細胞胚胎能夠例如被放置在萌芽培養(yǎng)基上以生芽，并且隨后被轉(zhuǎn)移到土壌中進ー步生長，或者可替代地，放置到加工的種子中并播種到土壌里，種子在土壌中發(fā)芽以生長出籽苗。例如在美國專利No. 5，564，224、No. 5，687，504、No. 5，701，699、和 No. 6，119，395中描述了加工的種子。體細胞胚胎發(fā)生過程通常是費カ且無效率的。例如，在過程中步驟中的一個步驟涉及從液體増殖培養(yǎng)基中移動胚性組織以及隨后在用于胚胎發(fā)育和成熟的半固體培養(yǎng)基表面上以低密度接種。該步驟通常由熟練的技術(shù)人員人工地使用移液管將胚性細胞和液體培養(yǎng)基的混合物分配到發(fā)育培養(yǎng)基上來完成。胚胎形成過程中的另ー個勞動密集型步驟是從發(fā)育培養(yǎng)基選擇性地收獲適合于萌芽的単獨的胚胎。在發(fā)育階段結(jié)束吋，胚胎可能會呈現(xiàn)在成熟和發(fā)育的多個階段中。使用多種視覺評估篩選標(biāo)準優(yōu)選地選定那些最可能成功地生長成正常植物的胚胎，并且使用一對鑷子人工地將胚胎拔出發(fā)育培養(yǎng)基，所述篩選標(biāo)準諸如胚胎的大小、形狀(例如，軸對稱)、子葉發(fā)育、表面紋理、顏色等。然后小心地布置選定的理想胚胎，并將它們相互分離用于進一歩處理。這是ー項技術(shù)精湛而繁瑣的工作，是費時且昂貴的。此外，當(dāng)最終期望的產(chǎn)量是數(shù)以百萬計的植物吋，該步驟遇到重大的生產(chǎn)瓶頸。已經(jīng)對使體細胞胚胎發(fā)生過程自動化做出了努力。擴大規(guī)模和使體細胞胚胎發(fā)生技術(shù)自動化可能涉及為了稀釋和/或?qū)ξ闯墒炫咛ズ统墒炫咛サ那袉?singulation)的目的使用大量的液體培養(yǎng)基或水，以便移動和放置胚胎用于隨后的處理步驟。例如，在增殖階段結(jié)束時可能會稀釋懸浮培養(yǎng)液以便促進將子葉前期胚胎均勻接種在發(fā)育培養(yǎng)基上。使用大量的液體的另ー個例子是在切單步驟中。切單是發(fā)生在發(fā)育和成熟期結(jié)束時的加工步驟，在該步驟中，使胚胎物理地相互分離并且在進ー步加工之前將胚胎放在胚形胚柄團(ESM)下面，所述進一歩加工例如插入到已加工的種子中、或在插入到已加工的種子中之前放置到萌芽培養(yǎng)基或萌芽前期培養(yǎng)基上用于進ー步處理。切單可以通過如下步驟來完成用液體噴灑胚胎和附著的ESM以將胚胎和附著的ESM從發(fā)育培養(yǎng)基除去；使用一系列篩子將胚胎和殘余ESM相互分離；將胚胎放置到大量液體中；隨后將單獨的胚胎放置到多孔基材上。
在接種步驟和/或切單步驟中，在其上布置有胚胎的基材上出現(xiàn)過多液體可能是有問題的。在凝膠-細胞界面處避免過度潮濕和液體培養(yǎng)基激素殘留物的截留對優(yōu)質(zhì)胚胎發(fā)育是至關(guān)重要的。此外，在其上布置有胚胎的基材上出現(xiàn)液體會對萌芽有顯著的負面影響。因此，需要在不損害胚胎或不干擾胚胎在基材上的位置的情況下，從胚胎表面和其上布置有胚胎的基材除去液體的方法。本發(fā)明解決這些和其它需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了從其上布置有植物胚胎的多孔基材除去液體的方法。本發(fā)明的方法包括如下步驟(a)提供具有頂表面和底表面的多孔基材；(b)將植物胚胎布置到多孔基材的頂表面上；(c)提供與真空源相連通的進氣ロ，其中進氣ロ的橫截面面積小于多孔基材的底表面面積；(d)在進氣ロ與真空源相連通吋，使進氣口和多孔基材的底表面的一部分彼此接近，所述多孔基材具有布置在相應(yīng)的頂表面上的植物胚胎，從而對接近進氣ロ的多孔基材的底表面的所述部分施加真空；以及(e)在進氣ロ與真空源相連通的同吋，使進氣口和多孔基材的底表面彼此相對移動，直到基本上多孔基材的底表面的所有的期望區(qū)域已經(jīng)接近進氣ロ為止，從而從其上布置有植物胚胎的多孔基材的期望區(qū)域除去液體。


當(dāng)結(jié)合附圖時，通過參考下列詳細描述，本發(fā)明的上述方面和許多所附優(yōu)勢將變得更容易理解，其中圖1示意性地示出用于在根據(jù)本發(fā)明的方法的實施例中使用的示例性真空系統(tǒng)； 以及圖2示意性地示出本發(fā)明的方法的實施例，在該實施例中，多孔基材被移動越過真空殼體中的開ロ，其中胚胎布置在多孔基材的頂表面上。
具體實施例方式此處所使用的術(shù)語“胚性胚柄團”(ESM)是指在萌芽和卵裂繁殖過程中的早期階段胚胎。此處所使用的術(shù)語“胚性組織”是指形成胚形胚柄團的數(shù)十到數(shù)百個胚性細胞的總稱。此處所使用的術(shù)語“植物胚胎”是指合子植物胚胎或體細胞植物胚胎。合子植物胚胎是在通過有性繁殖產(chǎn)生的植物種子內(nèi)部發(fā)現(xiàn)的胚胎。體細胞植物胚胎能夠通過標(biāo)準方法在實驗室條件下通過培養(yǎng)胚性組織而產(chǎn)生，在所述實驗室條件中，使包括組織的細胞相互分離并且促使它們發(fā)育成微小完整的胚胎。此處所使用的術(shù)語“植物胚胎”包括處于各種發(fā)育階段的胚胎并且包括子葉前期胚胎和子葉胚胎。此處所使用的術(shù)語“子葉前期胚胎”是指尚不具備任何子葉的胚胎。此處所使用的術(shù)語“子葉胚胎”是指具備ー個或多個子葉的胚胎。此處所使用的術(shù)語“液體”是指在胚胎形成過程中所使用的任何液體，包括但不限于水、等滲溶液、或培養(yǎng)基。
此處所使用的術(shù)語“接種”是指將胚形胚柄團和/或胚胎分配到表面上的過程。此處所使用的術(shù)語“切単”是指將子葉胚胎從胚形胚柄團及其它胚胎分離以產(chǎn)生単獨的胚胎的過程。體細胞胚胎發(fā)生過程是在試管內(nèi)使植物胚胎發(fā)育的過程。生產(chǎn)植物體細胞胚的方法在本領(lǐng)域中是已知的并且先前已經(jīng)描述過(例如參見美國專利No. 4，957，866、 No. 5，034，326、No. 5，036，007、No. 5，041，382、No. 5，236，841、No. 5，294，549、 No. 5，482，857、No. 5，563，061、以及No. 5，821，126)。一般地，體細胞胚胎發(fā)生過程包括如下步驟(1)引發(fā)或誘導(dǎo)，引發(fā)形成諸如胚形胚柄團(ESM)的胚性組織，所述胚形胚柄團是包括早期胚胎的白色粘液團，所述早期胚胎具有長的薄壁胚柄，所述薄壁胚柄與帶有稠密細胞質(zhì)和大細胞核的小頭連在一起；(2)増殖，有時也被稱為維護，使胚性組織定居并繁殖以形成子葉前期胚胎，所述子葉前期胚胎的特征在于具有平滑的胚胎頭；C3)發(fā)育，發(fā)育并形成成熟的子葉體細胞胚；以及(4)后期發(fā)育步驟，諸如切單、層積、萌芽、放置到已加工的種子中、以及轉(zhuǎn)移到土壤用于進ー步生長和發(fā)育。正如先前在背景技術(shù)部分所述的，體細胞胚胎發(fā)生過程是勞動密集型的。已經(jīng)對自動化和規(guī)模化過程作出努力以促進成百上千的植物胚胎的生產(chǎn)。例如，能夠在商業(yè)規(guī)模的液體生物反應(yīng)器中執(zhí)行増殖步驟。在増殖步驟結(jié)束吋，可以將子葉前期胚胎轉(zhuǎn)移到發(fā)育
土ロ養(yǎng)基。美國專利No. 7，785，884中描述了將子葉前期胚胎轉(zhuǎn)移到發(fā)育培養(yǎng)基的方法。轉(zhuǎn)移步驟可以通過例如如下程序來執(zhí)行從生物反應(yīng)器除去一定體積的懸浮培養(yǎng)液；允許細胞沉積并測量沉積的細胞體積；用無菌稀釋培養(yǎng)基稀釋沉積的細胞體積；將細胞和稀釋培養(yǎng)基以期望的密度均勻分散到多孔基材上，所述多孔基材布置在非多孔表面上；從多孔基材除去無菌稀釋培養(yǎng)基除去，從而將均勻分散的子葉前期胚胎捕集到多孔基材上；以及將布置有子葉前期胚胎的多孔基材轉(zhuǎn)移到發(fā)育培養(yǎng)基。無菌稀釋培養(yǎng)基可以通過多種方法從多孔基材除去。例如，可以將多孔基材附接到包括手把的接種框架上，并且可以使用任何適當(dāng)?shù)氖侄瓮ㄟ^手把將多孔基材豎直地抬起，諸如人工地或通過機器人手段。無菌稀釋培養(yǎng)基也可以使用避免干擾已接種的細胞的分布的任何方法除去，所述方法諸如對無菌稀釋培養(yǎng)基進行吸入、排水、傾斜、或吸干。上述方法是勞動密集型的，并且涉及轉(zhuǎn)移多孔基材和將細胞布置到數(shù)個表面，所述數(shù)個表面僅被使用一次或需要被經(jīng)常操縱以準備被使用額外的次數(shù)。在接種和除去液體之后，可以將子葉前期胚胎放置在發(fā)育培養(yǎng)基上一段時間以發(fā)育成子葉胚胎。在發(fā)育期結(jié)束吋，子葉胚胎連同未完全發(fā)育的胚胎、異常形成的胚胎、尺寸不足的或過大的胚胎、以及其它種類的非胚胎植物材料不同程度地附接到胚柄組織和殘余未發(fā)育的ESM和其它胚胎并嵌入胚柄組織和殘余未發(fā)育的ESM和其它胚胎內(nèi)。對于隨后的正常萌芽來說將胚胎從胚柄團和其它胚胎分離以產(chǎn)生的単獨的胚胎是重要的。這個分離過程被稱為“切単”。至于接種エ藝，切單是勞動密集型的。通常，手工挑選胚胎并使用鑷子將胚胎轉(zhuǎn)移到干濾紙或培養(yǎng)基上。自動化切單步驟對于胚胎形成過程的商業(yè)規(guī)模化以及生產(chǎn)率和工人福利來說是重要的。在自動切單期間，可以采用諸如水或等滲營養(yǎng)液的水性液體將胚胎從發(fā)育培養(yǎng)基洗掉，并使胚胎通過一系列篩子。在篩選期間，可以用水性液體進ー步噴灑胚胎以促進除去和洗去任何不期望的材料，諸如尺寸不足的胚胎、組織、以及殘余胚柄團。隨后可以將已切單的單獨胚胎放置在多孔基材上用于進一歩處理。在自動化切單過程結(jié)束吋，在胚胎和多孔基材兩者的表面上均有自由液體。除去殘余液體防止其與胚胎接觸是重要的，因為液體接觸胚胎會對胚胎的滲透壓和水勢有深遠的有害影響。例如，如果殘留液體與胚胎接觸，則胚胎的水勢產(chǎn)生的變化能夠?qū)е虏黄谕倪^早綠化和伸長。如上所述，對于將子葉前期胚胎接種到發(fā)育培養(yǎng)基上的步驟，以及對子葉胚胎切單的步驟來說，從布置的胚胎的表面和其上布置有胚胎的多孔基材除去自由液體是重要的。本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)從植物胚胎的表面和從其上布置有植物胚胎的多孔基材除去液體的方法，該方法致使與本領(lǐng)域中已知的方法(例如，使用布氏漏斗、抽吸、排水、吸干等)相比更徹底且更一致地除去液體。本發(fā)明提供從其上布置有植物胚胎的多孔基材除去液體的方法。本發(fā)明的方法包括如下步驟(a)提供具有頂表面和底表面的多孔基材；(b)將植物胚胎布置到多孔基材的頂表面上；(c)提供與真空源相連通的進氣ロ，其中進氣ロ的橫截面面積小于多孔基材的底表面面積；(d)當(dāng)進氣ロ與真空源相連通吋，使進氣口和多孔基材的底表面的一部分彼此接近，所述多孔基材具有布置在相應(yīng)的頂表面上的植物胚胎，從而對接近進氣ロ的多孔基材的底表面部分施加真空；以及(e)在進氣ロ與真空源相連通的同吋，使進氣口和多孔基材的底表面相對于彼此移動，直到多孔基材的底表面的基本上所有的期望區(qū)域已經(jīng)接近進氣ロ為止，從而從其上布置有植物胚胎的多孔基材的期望區(qū)域除去液體。在一個實施例中，本發(fā)明的方法進ー步包括當(dāng)進氣ロ與真空源相連通吋，重復(fù)步驟⑷和(e)直到多孔基材的基本上所有的底表面已經(jīng)接近進氣ロ為止。在一個實施例中，當(dāng)進氣口和多孔基材的底表面相對于彼此移動時，進氣ロ持續(xù)地與真空源相連通。在一個實施例中，當(dāng)進氣口和多孔基材的底表面相對于彼此移動時，進氣ロ間歇地與真空源相連通。在一個實施例中，進氣ロ保持靜止，并且移動多孔基材越過進氣ロ。在一個實施例中，多孔基材保持靜止，并且移動進氣ロ越過多孔基材的底表面。在一個實施例中，進氣ロ 基本上接觸多孔基材的底表面。在一個實施例中，本發(fā)明的方法進ー步包括如下步驟在進氣ロ與真空源相連通的同吋，在進氣口和多孔膜的底表面相對于彼此移動時，在布置在多孔基材的頂表面上的胚胎上和在布置在多孔基材的頂表面上的胚胎周圍引起空氣對流，從而通過蒸發(fā)促進從布置的胚胎的表面除去液體。在本發(fā)明的實踐中有用的多孔基材具有范圍從約5微米到約1200微米的孔隙直徑，諸如從約50微米至約500微米、諸如從約70微米至約150微米、諸如約100。多孔基材可以具有任何期望的形狀和尺寸。為了便于操作并且適合于進一歩處理已布置的胚胎，選擇多孔基材的形狀和尺寸。適當(dāng)?shù)男螤畎ㄕ叫?、矩形、或圓形形狀。示例性尺寸是從約 4平方英寸至觀平方英寸或更大的表面面積，諸如50平方英寸、100平方英寸直至500平方英寸或更大。優(yōu)選的多孔基材是可消毒的并且強度足以抵抗撕裂。有用的多孔基材的例子包括膜、尼龍纖維、編織網(wǎng)(例如，尼龍、不銹鋼或塑料)、自然纖維(例如，棉花)、紙和聚合纖維。在一個實施例中，多孔基材是聚合膜。在一個實施例中，多孔基材是尼龍膜。
為了促進操作和提供支撐，多孔基材可以被安裝在框架中。所述框架可以是諸如塑料或金屬的任何適當(dāng)?shù)牟牧?。在一個實施例中，多孔基材是尼龍膜并且被鋁框住。具有開ロ的進氣ロ可以用任何適當(dāng)?shù)拇笮『托螤畹臍んw覆蓋，所述殼體諸如具有細長開ロ或噴嘴的矩形殼體。在一個實施例中，在殼體中的開ロ的長度基本上等于ー個尺寸，例如多孔基材的長度或?qū)挾取Ｍǔんw中的開ロ的寬度范圍可以從約0.001英寸至一英寸或更大，諸如從約0. 001英寸至約0. 1英寸、諸如從約0. 001英寸至約0. 01英寸。在一個實施例中，殼體是矩形結(jié)構(gòu)，該矩形結(jié)構(gòu)具有長度約5. 25英寸和寬度約0. 002英寸的細長開ロ。取決于多孔基材的尺寸，在殼體中的開ロ的其它寬度可以是合適。植物胚胎可以以任何排列布置在多孔基材上并且可以分布在多孔基材的任何數(shù)量的表面面積上。通常，植物胚胎可以分布在多孔基材的表面面積的從約30%至約90%或更大的面積上，諸如在多孔基材的表面面積的從約55%至約85%的面積上。圖1中示出在實踐本發(fā)明的方法中有用的自動化系統(tǒng)的典型實例。參照圖1，自動化系統(tǒng)10包括平臺20，該平臺被劃分為兩段；多孔基材30，該多孔基材被周圍框架支撐，基材30具有頂表面以及底表面，在頂表面上布置有胚胎；機械滑動臂40，該機械滑動臂由馬達(未示出)驅(qū)動以推擠基材框架的鄰接側(cè)；真空殼體50，該真空殼體位于平臺20的兩段之間，所述真空殼體50具有狹窄細長的開ロ 60 ；真空發(fā)生器或泵70，所述真空發(fā)生器或泵經(jīng)由管子80連接到真空殼體50 ；以及控制器90。在實踐本發(fā)明的方法的實施例中，將多孔基材30放置到平臺20的一段上。在將多孔基材30放置到平臺20上之前或在將多孔基材30放置到平臺20上之后可以將植物胚胎分配到多孔基材30上。機械滑動臂40推動多孔基材30橫跨真空殼體50。當(dāng)移動多孔基材30橫跨真空殼體50吋，多孔基材30的底表面接觸真空殼體50的開ロ 60，同時開ロ 60與真空70相連通，致使從多孔基材30除去液體并且在胚胎的上方和周圍引起空氣并且穿過多孔基材30，所述胚胎被布置在多孔基材30的頂表面上。圖2示意性地示出將多孔基材30從平臺20的一段橫跨真空殼體50的開ロ 60移動到在平臺20的另ー側(cè)上的段。在一些實施例中，由在本發(fā)明的實踐中所使用的真空泵所產(chǎn)生的負壓范圍可以從約-0. 5psi至約_15psi，諸如從約-5psi至約_12psi。在一個實施例中，負壓是約-IOpsi。 在一些實施例中，當(dāng)進氣ロ與真空源相連通吋，由真空源所產(chǎn)生的負壓是常量。在一些實施例中，當(dāng)進氣ロ與真空源相連通吋，由真空源所產(chǎn)生的負壓變化。在一些實施例中，多孔基材和進氣ロ以在從約1毫米每秒至約45毫米每秒的范圍內(nèi)的速度相對于彼此移動，諸如從約1毫米每秒至約10毫米每秒。在一個實施例中，多孔基材和進氣ロ以約3毫米每秒的速度相對于彼此移動。在一個實施例中，帶有細長開ロ 60的真空殼體50的形狀為矩形(例如棒形)并且取決于多孔基材的大小被設(shè)計大小，使得當(dāng)在本發(fā)明方法中使用帶有細長開ロ 60的真空殼體50吋，帶有細長開ロ 60的真空殼體50將接觸多孔基材的橫截面的基本上所有的面積，但是在任何時候不會接觸多孔基材的整個面積。在一個實施例中，帶有細長開ロ 60的真空殼體50的大小和形狀被設(shè)計為使得當(dāng)在本發(fā)明的方法中使用帶有細長開ロ 60的真空殼體時，帶有細長開ロ 60的真空殼體在任何時候?qū)⒔佑|小于多孔基材的整個面積的1%， 諸如從約0. 01%至約0. 1%、諸如約0. 02%至約0. 05%、諸如約0. 04%
本發(fā)明的方法密切地關(guān)注真空和在多孔基材的特定面積上的相關(guān)的氣流，當(dāng)開ロ 與真空源相連通吋，多孔基材的特定面積接近或基本上接觸在進氣口中的開ロ。當(dāng)進氣ロ 和多孔基材相對于彼此移動直到基本上所有的多孔基材已經(jīng)接觸進氣口和真空為止時，密切地關(guān)注多孔基材的狹窄區(qū)域或狹窄帶上的真空致使橫跨多孔基材的整個表面更加一致地除去液體。此外，本發(fā)明的方法在不移動胚胎的位置的情況下從其上布置有植物胚胎的多孔基材除去液體。本發(fā)明的方法與經(jīng)由真空系統(tǒng)從其上布置有胚胎的多孔基材除去液體的諸如使用布氏漏斗的其它方法形成對照，其它方法的操作使得液體同時被吸引穿過整個多孔面積的孔，這可能導(dǎo)致橫跨多孔面積的不均勻的液體除去和/或胚胎的位移。而且，與以前的方法相比，本發(fā)明允許更快速地從多孔基材和已布置的胚胎的表面除去液體。例如，以前的方法需要1. 5分鐘至7分鐘來充分地除去每個多孔基材的表面液體，而使用本發(fā)明的方法能夠在不到一分鐘中除去每個多孔基材的表面液體。考慮到對用以處理成千上萬的胚胎的生產(chǎn)裝置的要求，當(dāng)前方法產(chǎn)生在效率上的顯著提高。此外，雖然使用本發(fā)明的方法可以從已布置的胚胎的表面除去液體，但是，重要地，本發(fā)明的方法基本上不影響已布置的胚胎的水分含量或水勢。一旦已經(jīng)從其上布置有胚胎的多孔基材上除去殘余液體，胚胎就可以經(jīng)受進ー步的處理或處置。在一個實施例中，植物胚胎是子葉前期胚胎。在一個實施例中，本發(fā)明的方法包括如下步驟(a)在増殖培養(yǎng)基之內(nèi)或増殖培養(yǎng)基之上培養(yǎng)胚性胚柄團以形成子葉前期胚胎；(b)提供具有頂表面和底表面的多孔基材；(c)將在步驟(a)中形成的子葉前期胚胎分配到多孔基材的頂表面上；(d)提供與真空源相連通的進氣ロ，其中進氣ロ的橫截面面積小于多孔基材的底表面面積；(e)當(dāng)進氣ロ與真空源相連通吋，使進氣口和多孔基材的底表面的一部分彼此接近，子葉前期胚胎被布置在多孔基材的相應(yīng)的頂表面上，從而對接近進氣ロ的多孔基材的底表面部分施加真空；以及(f)在進氣ロ與真空源相連通的同吋，使進氣口和多孔基材的底表面相對于彼此移動，直到多孔基材的底表面的基本上所有的期望區(qū)域已經(jīng)接近進氣ロ為止，從而從其上布置有子葉前期胚胎的多孔基材的期望區(qū)域除去液體。在一個實施例中，本發(fā)明的方法進ー步包括將布置在已經(jīng)根據(jù)步驟(f)除去液體的多孔基材上的子葉前期胚胎轉(zhuǎn)移到發(fā)育培養(yǎng)基的步驟。 在一個實施例中，植物胚胎是子葉胚胎。在一個實施例中，本發(fā)明的方法包括如下步驟(a)在發(fā)育培養(yǎng)基之內(nèi)或發(fā)育培養(yǎng)基之上培養(yǎng)子葉前期胚胎以形成子葉胚胎；(b)對在步驟(a)中產(chǎn)生的子葉胚胎進行切単；(c)提供具有頂表面和底表面的多孔基材；(d)將在步驟(b)中切單的子葉胚胎分配到多孔基材的頂表面上；(e)提供與真空源相連通的進氣ロ，其中進氣ロ的橫截面面積小于多孔基材的底表面面積；(f)當(dāng)進氣ロ與真空源相連通吋，使進氣口和多孔基材的底表面的一部分彼此接近，子葉前期胚胎布置在多孔基材的相應(yīng)的頂表面上，從而對接近進氣ロ的多孔基材的底表面部分施加真空；以及(g)在進氣 ロ與真空源相連通的同吋，使進氣口和多孔基材的底表面相對于彼此移動，直到多孔基材的底表面的基本上所有的期望區(qū)域已經(jīng)接近進氣ロ為止，從而從其上布置有子葉前期胚胎的多孔基材的期望區(qū)域除去液體。
在一個實施例中，本發(fā)明的方法進ー步包括如下步驟使布置在已經(jīng)根據(jù)步驟 (g)除去液體的多孔基材上的子葉胚胎經(jīng)受ー項或多項進ー步處理，諸如層積、放置到已加 エ的種子中、以及萌芽。發(fā)育、層積、和萌芽的在體細胞胚胎發(fā)生過程中的步驟是本領(lǐng)域已知的。例如在美國專利No. 7，785，884中公開了用于每個步驟的示例性培養(yǎng)基和條件。本發(fā)明的方法能夠用于需要從胚胎和/或從其上布置有胚胎的多孔基材除去表面液體的體細胞胚胎發(fā)生過程中的任何步驟。適合于在本發(fā)明的方法中使用的植物胚胎可以來自于任何植物物種，諸如雙子葉植物類或單子葉植物類、裸子植物內(nèi)等。松柏科植物胚胎適合于在本發(fā)明的方法中使用并且松柏科植物胚胎可以來自于任何松柏科植物物種，包括但不限于火炬松和花旗松。雖然已經(jīng)示出并描述了例證性實施例，但是應(yīng)了解，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的情況下，能夠做出各種改變。
權(quán)利要求
1.ー種用于從多孔基材除去液體的方法，植物胚胎布置在所述多孔基材上，所述方法包括如下步驟(a)提供具有頂表面和底表面的多孔基材；(b)將植物胚胎布置到所述多孔基材的頂表面上；(c)提供與真空源相連通的進氣ロ，其中所述進氣ロ的橫截面面積小于所述多孔基材的底表面面積；(d)在所述進氣ロ與所述真空源相連通吋，使所述進氣口和所述多孔基材的底表面的一部分彼此接近，所述多孔基材具有布置在相應(yīng)的頂表面上的植物胚胎，從而對接近所述進氣ロ的所述多孔基材的底表面的所述部分施加真空；以及(e)在所述進氣ロ與所述真空源相連通的同吋，使所述進氣口和所述多孔基材的底表面彼此相對移動，直到基本上所述多孔基材的底表面的所有期望區(qū)域已經(jīng)接近所述進氣ロ 為止，從而從布置有植物胚胎的所述多孔基材的期望區(qū)域除去液體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中在所述進氣ロ與所述真空源相連通吋，所述進氣 ロ基本上接觸具有布置在相應(yīng)的頂表面上的植物胚胎的所述多孔基材的底表面的所述部分。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，進ー步包括在所述進氣ロ與所述真空源相連通時重復(fù)步驟(d)和(e)，直到基本上所述多孔基材的所有的底表面已經(jīng)接近所述進氣ロ為止。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中在所述進氣口和所述多孔基材的底表面彼此相對移動時，所述進氣ロ持續(xù)地與所述真空源相連通。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中在所述進氣口和所述多孔基材的底表面彼此相對移動時，所述進氣ロ間歇地與所述真空源相連通。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述進氣ロ保持靜止，并且所述多孔基材被移動越過所述進氣ロ。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述多孔基材保持靜止，并且所述進氣ロ被移動越過所述多孔基材的底表面。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，進ー步包括如下步驟在所述進氣ロ與所述真空源相連通吋，在所述進氣口和所述多孔膜的底表面彼此相對移動吋，在被布置在所述多孔基材的頂表面上的胚胎上和在該胚胎周圍引起空氣對流，從而促進通過蒸發(fā)從布置的胚胎的表面除去液體。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述進氣ロ由具有開ロ的殼體覆蓋。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中在所述殼體中的所述開ロ具有從約0.001英寸至約0.01英寸的寬度。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述進氣ロ與具有從約-0.5psi至約-15psi的范圍內(nèi)的負壓的真空源相連通。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中在所述進氣ロ與所述真空源相連通時，所述真空源的負壓是恒定的。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中在所述進氣ロ與所述真空源相連通時，所述真空源的負壓變化。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述進氣口和所述多孔基材以從約1毫米每秒至約45毫米每秒的速度彼此相對移動。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述多孔基材是聚合膜。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述聚合膜是尼龍膜。
17.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述植物胚胎是子葉前期胚胎。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，進ー步包括將所述子葉前期胚胎轉(zhuǎn)移到發(fā)育培養(yǎng)
19.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述植物胚胎是子葉胚胎。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，進ー步包括使所述子葉胚胎經(jīng)受層積、插入到加工的種子中以及萌芽處理中的ー個或多個。
全文摘要
本發(fā)明涉及在植物體細胞胚胎發(fā)生中從多孔基材除去液體的方法。本發(fā)明提供了從多孔基材除去液體的方法，植物胚胎布置在所述多孔基材上。
文檔編號C12N5/04GK102559574SQ20111045369
公開日2012年7月11日 申請日期2011年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月30日
發(fā)明者帕特里克·M·布勞內(nèi)爾, 拉蒙·C·德祖特, 羅伯特·A·斯塔爾 申請人:韋爾豪澤Nr公司