專利名稱:快速檢測鯊魚弧菌的試劑盒及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種快速檢測鯊魚弧菌的試劑盒，以及使用該試劑盒快速檢測鯊魚弧菌的方法。
背景技術(shù)：
弧菌是海水養(yǎng)殖動物的主要病原，現(xiàn)已查明鯊魚弧菌是引起近江牡蠣大量死亡的病原之一，也能引起海水養(yǎng)殖魚類疾病，該菌亦存在于天然海水中。監(jiān)測養(yǎng)殖動物和海水中的鯊魚弧菌是防治其引起疾病的重要措施。目前鑒定弧菌的技術(shù)有1、經(jīng)典的生理生化鑒定方法，該法繁瑣、耗時、且要求操作人員有良好的專業(yè)素養(yǎng)；2、細(xì)菌快速自動鑒定系統(tǒng)，該法需要昂貴的儀器設(shè)備和技術(shù)熟練的操作人員；3、基于核酸的檢測技術(shù)，包括DNA探針和PCR技術(shù)(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù))，相對上述檢測技術(shù)而言，具有快速、簡捷、靈敏等特點(diǎn)，但目前還未見檢測鯊魚弧菌的PCR技術(shù)及檢測試劑盒專利。

發(fā)明內(nèi)容為了解決現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，本發(fā)明的首要目的在于提供一種快速檢測鯊魚弧菌的試劑盒，特別是提供一對鯊魚弧菌特異性引物VcS和VcA，使用該試劑盒可快速檢測多種樣品中是否存在鯊魚弧菌，從而為健康養(yǎng)殖提供科學(xué)依據(jù)。本發(fā)明建立了快速靈敏準(zhǔn)確檢測鯊魚弧菌的PCR檢測技術(shù)并研制了檢測試劑盒，以滿足生產(chǎn)中簡便、快捷和準(zhǔn)確的需要。
本發(fā)明的另一目的在于提供上述檢測試劑盒檢測鯊魚弧菌的方法。
本發(fā)明的目的是由下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一種快速檢測鯊魚弧菌的試劑盒，包括增菌培養(yǎng)基、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑、電泳和顯色試劑(a)試劑A即增菌培養(yǎng)基含胰化蛋白胨，牛肉膏，酵母提取物和瓊脂粉，其重量比為5∶3∶1∶18。
(b)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑包括反應(yīng)預(yù)混試劑B和試劑C。
試劑B含有10倍聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)緩沖液(含MgCl215mM)、特異引物對VcS和VcA、dNTP(四種脫氧核苷酸的混合物)、小牛血清蛋白和滅菌雙蒸水，含量分別為2.5～5.0μl、0.5～1.0μl(10μM)、0.5～1.0μl(10μM)、0.5～1.0μl(10μMeach)、0.5～1.0μl(5mg/ml)和19.375～38.75μl。
試劑CTaq酶，0.125～0.25μl(5個單位/μl)。
(c)電泳和顯色試劑，包括試劑D、試劑E和試劑F。
試劑D為50倍TAE(電泳緩沖液)，含三羥基甲基氨基甲烷-乙酸和乙二胺四乙酸，濃度分別為0.04M和0.001M；試劑E為凝膠加樣緩沖液，含w/v為40％的蔗糖和0.25％的溴酚藍(lán)和二甲苯青FF；試劑F0.8～2％(W/V)瓊脂糖+0.5～1μg/ml溴化乙錠。
為了更好地實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，所述特異引物對VcS和VcA如下特異引物VcS指5′ATCCGGCAATGCAGTGTTC 3′；特異引物VcA指5′ACCTACCCGCCTCCTTACGC 3′。
所述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑的優(yōu)選組成為試劑B5.0μl10×PCR Buffer，1.0μl VcS，1.0μl VcA，1.0μl dNTP(10mM each)，1.0μl BSA，38.75μl ddH2O；試劑C0.25μl Taq酶。
使用快速檢測鯊魚弧菌的試劑盒檢測鯊魚弧菌的方法，包括如下步驟(a)增菌取2.7g試劑A加過濾海水至100ml，調(diào)PH值為7.2～7.4，121℃滅菌15～20min后按常規(guī)方法制作細(xì)菌培養(yǎng)平板。
無菌操作取0.1～0.5克樣品(待檢水產(chǎn)動物組織或水樣等，要避免污染)，勻漿(需要時)后涂布于用試劑A即增菌培養(yǎng)基所制平板，30℃培養(yǎng)12～18小時。
(b)PCR擴(kuò)增挑取平板上各種菌苔于100μl滅菌蒸餾水中重懸混勻后取1～2μl作為PCR擴(kuò)增的模板；取23.875～47.75μl試劑B與0.125～0.25μl試劑C混合；在熱循環(huán)儀上通過95℃裂解細(xì)菌并解鏈5分鐘；然后用94℃變性30～60秒，55～58℃復(fù)性30～60秒鐘，72℃延伸30～90秒鐘，如此循環(huán)25～35次，最后在72℃保溫8～12分鐘，將鯊魚弧菌的特異片段增加到108mol以上。
(c)電泳和顯色檢測取5～10μl擴(kuò)增后的樣品，與1～2μl試劑F(凝膠加樣緩沖液)混合，W/V為0.8～1.2％的瓊脂糖電泳和顯色，在紫外光下檢測是否有一條470核苷酸對的條帶，如果有一條470bp的條帶，說明樣品中含有鯊魚弧菌，反之則沒有鯊魚弧菌。
本發(fā)明的主要原理為試劑B和C為多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑，通過試劑B中所含鯊魚弧菌DNA片段特異引物和試劑C中的熱聚合酶等成分，對樣品釋放出的DNA進(jìn)行特異性的擴(kuò)增，由于本發(fā)明所設(shè)計引物為鯊魚弧菌特異性引物，因此，如果樣品中含有鯊魚弧菌，那么它的DNA特異片段在經(jīng)過擴(kuò)增后，濃度將達(dá)到108mol(克分子)以上，這樣，在電泳和溴化乙錠染色后，紫外光檢測就可以探測到一定分子量的目的條帶。如果沒有鯊魚弧菌存在，則不能擴(kuò)增到同樣分子量的目的條帶。
本發(fā)明與其它弧菌病原檢測技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點(diǎn)和有益效果(1)本發(fā)明方法檢測方便，省去了通常方法中要提取細(xì)菌DNA的步驟；(2)本發(fā)明方法檢測靈敏度極高，檢測下限低至10～102個細(xì)菌；(3)本發(fā)明提供的引物對于不含鯊魚弧菌的檢測樣本均無擴(kuò)增信號，說明其具有良好的特異性；(4)本發(fā)明可以應(yīng)用于多種樣品的檢測，可以檢測養(yǎng)殖動物受鯊魚弧菌感染情況，也可以監(jiān)測養(yǎng)殖水體環(huán)境中鯊魚弧菌。
圖1為鯊魚弧菌快速檢測試劑盒特征引物特異性檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。
圖2為鯊魚弧菌快速檢測試劑盒靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。
具體實(shí)施方式下面實(shí)施例對進(jìn)一步對本發(fā)明的說明，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。
實(shí)施例1 按以下配方制作快速檢測溶藻弧菌的試劑盒(a)試劑A(增菌培養(yǎng)基)含有胰化蛋白胨，牛肉膏，酵母提取物和瓊脂粉，其重量比為5∶3∶1∶18。
(b)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(25μl體系)試劑包括反應(yīng)預(yù)混試劑B和試劑C，試劑B含有10倍聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)緩沖液(含MgCl215mM)、特異引物對VcS和VcA、dNTP(四種脫氧核苷酸的混合物)、小牛血清蛋白和滅菌雙蒸水，含量分別為2.5μl、0.5μl(10μM)、0.5μl(10μM)、0.5μl(10μM each)、0.5μl(5mg/ml)和19.375μl。
試劑CTaq酶，0.125μl(5個單位/μl)。
(c)電泳和顯色試劑，包括試劑D、試劑E和試劑F。
試劑D為50倍TAE(電泳緩沖液)，含三羥基甲基氨基甲烷-乙酸和乙二胺四乙酸，濃度分別為0.04M和0.001M；試劑E為凝膠加樣緩沖液，含w/v為40％的蔗糖和0.25％的溴酚藍(lán)及二甲苯青FF；試劑F1％(W/V)瓊脂糖+0.5μg/ml溴化乙錠。
按照以下程序快速檢測鯊魚弧菌的方法(a)樣品增菌處理取2.7g試劑A加過濾海水至100ml，調(diào)PH值為7.2～7.4，121℃滅菌20min后按常規(guī)方法制作細(xì)菌培養(yǎng)平板。
無菌操作取近江牡蠣消化盲囊組織約0.1克，勻漿后涂布于所制平板，30℃培養(yǎng)16小時；(b)PCR擴(kuò)增取23.875μl試劑B與0.125μl試劑C混合；用滅菌牙簽挑取平板上各種菌苔于100μl滅菌蒸餾水中重懸混勻，取1μl作為PCR模板加入上述混合液中；在熱循環(huán)儀上對進(jìn)行擴(kuò)增，通過95℃裂解細(xì)菌并解鏈5分鐘，然后用94℃變性20秒，57℃復(fù)性40秒，72℃延伸45秒鐘，如此循環(huán)30次，最后在72℃保溫10分鐘。
(c)電泳和顯色檢測取5μl擴(kuò)增后的樣品，與1μl試劑F(凝膠加樣緩沖液)混合，1％瓊脂糖電泳和顯色，在紫外光下檢測是否有一條470核苷酸對的條帶，如果有一條470bp的條帶，說明樣品中含有鯊魚弧菌，反之則沒有。
實(shí)施例2 按以下配方制作快速檢測溶藻弧菌的試劑盒(a)試劑A(增菌培養(yǎng)基)含有胰化蛋白胨，牛肉膏，酵母提取物和瓊脂粉，其重量比為5∶3∶1∶18。
(b)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(50μl體系)試劑包括反應(yīng)預(yù)混試劑B和試劑C。
試劑B含有10倍聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)緩沖液(含MgCl215mM)、特異引物對VcS和VcA、dNTP(四種脫氧核苷酸的混合物)、小牛血清蛋白和滅菌雙蒸水，含量分別為5.0μl、1.0μl(10μM)、1.0μl(10μM)、1.0μl(10μM each)、1.0μl(5mg/ml)和38.75μl。
試劑CTaq酶，0.25μl(5個單位/μl)。
(c)電泳和顯色試劑，包括試劑D、試劑E和試劑F。
試劑D為50倍TAE(電泳緩沖液)，含三羥基甲基氨基甲烷-乙酸和乙二胺四乙酸，濃度分別為0.04M和0.001M；
試劑E為凝膠加樣緩沖液，含w/v為40％的蔗糖和0.25％的溴酚藍(lán)及二甲苯青FF；試劑F1％(W/V)瓊脂糖+0.5μg/ml溴化乙錠。
按照以下程序快速檢測鯊魚弧菌的方法(a)樣品增菌處理取2.7g試劑A加過濾海水至1L，調(diào)PH值為7.2～7.4，121℃滅菌20min后按常規(guī)方法制作細(xì)菌培養(yǎng)平板。
無菌操作取牡蠣血液約0.1克，涂布于所制平板，30℃培養(yǎng)16小時。
(b)PCR擴(kuò)增取47.75μl試劑B與0.25μl試劑C混合；用滅菌牙簽挑取平板上各種菌苔于100μl滅菌蒸餾水中重懸混勻，取2μl作為PCR模板加入上述混合液中；在熱循環(huán)儀上通過95℃裂解細(xì)菌并解鏈5分鐘；然后用94℃變性30秒，57℃復(fù)性45秒，72℃延伸60秒鐘，如此循環(huán)30次，最后在72℃保溫10分鐘。
(c)電泳和顯色檢測取8μl擴(kuò)增后的樣品，與2μl試劑F(凝膠加樣緩沖液)，1％瓊脂糖電泳和顯色，在紫外光下檢測是否有一條470核苷酸對的條帶，如果有一條470bp的條帶，說明樣品中含有鯊魚弧菌，反之則沒有。
如圖1所示，為鯊魚弧菌快速檢測試劑盒特征引物特異性檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中MDNA marker，1副溶血弧菌，2哈維氏弧菌，3、4、5三株不同來源的溶藻弧菌，6鯊魚弧菌，7解蛋白弧菌，8需鈉弧菌，9坎氏弧菌，10燦爛弧菌，11河流弧菌，12創(chuàng)傷弧菌，圖1顯示鯊魚弧菌快速檢測試劑盒特征引物只能對鯊魚弧菌PCR擴(kuò)增出目的片段，其特異性是非常高的。
如圖2所示，為鯊魚弧菌快速檢測試劑盒靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中MDNAmarker，1～825μl體系PCR結(jié)果，每管加入模板量(鯊魚弧菌數(shù)/管，平板計數(shù)法)；15×107，25×106，35×105，45×104，55×103，65×102，75×101，85×100，圖2顯示鯊魚弧菌快速檢測試劑盒在101級時就可以檢測出結(jié)果，結(jié)合增菌步驟一般在所取檢測樣品中只要含有數(shù)個鯊魚弧菌就可檢出。
SEQUENCE LISTING<110>暨南大學(xué)<120>快速檢測鯊魚弧菌的試劑盒及其檢測方法<130>20<160>2<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>19<212>DNA<213>Artficial sequence<220>
<223>鯊魚弧菌特異引物VcS<400>1atccggcaat gcagtgttc 19<210>2<211>20<212>DNA<213>Artificial sequence<220>
<223>鯊魚弧菌特異引物VcA<400>2acctacccgc ctccttacgc 20
權(quán)利要求
1.一種快速檢測鯊魚弧菌的試劑盒，其特征在于包括增菌培養(yǎng)基、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑、電泳和顯色試劑(a)增菌培養(yǎng)基即試劑A含胰化蛋白胨，牛肉膏，酵母提取物和瓊脂粉，其重量比為5∶3∶1∶18；(b)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑包括反應(yīng)預(yù)混試劑B和試劑C；試劑B含有10倍聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)緩沖液、特異引物對VcS和VcA、dNTP、小牛血清蛋白和滅菌雙蒸水，含量分別為2.5～5.0μl、0.5～1.0μl、0.5～1.0μl、0.5～1.0μl、0.5～1.0μl和19.375～38.75μl；試劑CTaq酶，0.125～0.25μl；(c)電泳和顯色試劑，包括試劑D、試劑E和試劑F；試劑D為50倍TAE，含三羥基甲基氨基甲烷-乙酸和乙二胺四乙酸，濃度分別為0.04M和0.001M；試劑E為凝膠加樣緩沖液，含w/v為40％的蔗糖和0.25％的溴酚藍(lán)和二甲苯青FF；試劑F0.8～2％瓊脂糖+0.5～1μg/ml溴化乙錠。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的一種快速檢測鯊魚弧菌的試劑盒，其特征在于所述特異引物對VcS和VcA如下特異引物VcS指5′ATCCGGCAATGCAGTGTTC 3′；特異引物VcA指5′ACCTACCCGCCTCCTTACGC 3′。
3.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的一種快速檢測鯊魚弧菌的試劑盒，其特征在于所述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑的組成為試劑B5.0μl 10×PCR Buffer，1.0μl VcS，1.0μl VcA，1.0μl dNTP，1.0μl BSA，38.75μl ddH2O；試劑 C0.25μl Taq酶。
4.一種使用快速檢測鯊魚弧菌的試劑盒檢測鯊魚弧菌的方法，其特征在于包括如下步驟(a)增菌取2.7g試劑A加過濾海水至100ml，調(diào)PH值為7.2～7.4，121℃滅菌15～20min后按常規(guī)方法制作細(xì)菌培養(yǎng)平板；無菌操作取0.1～0.5克樣品，勻漿后涂布于用試劑A即增菌培養(yǎng)基所制平板，30℃培養(yǎng)12～18小時；(b)PCR擴(kuò)增挑取平板上各種菌苔于100μl滅菌蒸餾水中重懸混勻后取1～2μl作為PCR擴(kuò)增的模板；取23.875～47.75μl試劑B與0.125～0.25μl試劑C混合；在熱循環(huán)儀上通過95℃裂解細(xì)菌并解鏈5分鐘；然后用94℃變性30～60秒，55～58℃復(fù)性30～60秒鐘，72℃延伸30～90秒鐘，如此循環(huán)25～35次，最后在72℃保溫8～12分鐘，將鯊魚弧菌的特異片段增加到108mol以上；(c)電泳和顯色檢測取5～10μl擴(kuò)增后的樣品，與1～2μl試劑F混合，W/V為0.8～1.2％的瓊脂糖電泳和顯色，在紫外光下檢測是否有一條470核苷酸對的條帶，如果有一條470bp的條帶，說明樣品中含有鯊魚弧菌，反之則沒有鯊角弧菌。
專利摘要
本發(fā)明提供了一種檢測鯊魚弧菌的試劑盒及其檢測方法，該試劑盒包括增菌培養(yǎng)基即試劑A；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑包括反應(yīng)預(yù)混試劑B和試劑C；電泳和顯色試劑，包括試劑D、試劑E和試劑F。本發(fā)明還提供使用這種試劑盒快速檢測鯊魚弧菌的方法，其優(yōu)點(diǎn)是快速，準(zhǔn)確，靈敏度高；本發(fā)明提供的引物對于不含鯊魚弧菌的檢測樣本均無擴(kuò)增信號，說明其具有良好的特異性。本發(fā)明可以應(yīng)用于多種樣品的檢測，可以檢測養(yǎng)殖動物受鯊魚弧菌感染的情況，也可以監(jiān)測養(yǎng)殖水體環(huán)境中病原鯊魚弧菌。
文檔編號G01N21/31GK1995372SQ200610123591
公開日2007年7月11日 申請日期2006年11月16日
發(fā)明者張其中, 張占會 申請人:暨南大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan