專利名稱:優(yōu)化的葡聚糖酶基因及其重組植物表達(dá)載體和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及優(yōu)化的葡聚糖酶基因以及含有該優(yōu)化基因的重組植物表達(dá)載體，本發(fā)明進(jìn)一步涉及它們在制備表達(dá)葡聚糖酶轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用，屬于轉(zhuǎn)葡聚糖酶基因植物領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
β-葡聚糖(β-glucans)又稱β _ (1，3)β -葡聚糖屬于非淀粉多糖(NSP)，是動物飼料中重要的抗?fàn)I養(yǎng)因子，其具有一定的粘性、持水性和表面活性。反芻動物能夠借助瘤胃微生物產(chǎn)生的葡聚糖酶消化利用β -葡聚糖，而單胃動物不具備合成葡聚糖酶的微生物和分解葡聚糖的酶系，使食糜進(jìn)入腸道后具有較高的粘度，從而阻止了腸道消化液，內(nèi)源酶等與食糜的充分混合，限制了營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收，最終使飼料的轉(zhuǎn)化率降低(Morgan A J, etal.Proc Aust PoultSym, 1995，7:109-115)。針對這類物質(zhì)對養(yǎng)分吸收的不利作用，近年來推出了一些消除飼料中NSP類物質(zhì)抗?fàn)I養(yǎng)作用、改善飼料營養(yǎng)價值的方法，包括水處理、添加抗生素、添加酶制劑等。這其中最直接也最有效的手段就是在動物飼料中添加外源酶制劑，其意義在于降解NSP類抗?fàn)I養(yǎng)因子，消除其所導(dǎo)致的內(nèi)源酶、微生物區(qū)系等的不利變化，而且能夠提高細(xì)胞壁碳水化合物的營養(yǎng)利用率。
葡聚糖酶(Glucanase)是能夠降解β -糖苷鍵鏈成葡萄糖聚合物的一類水解酶，可以水解β_葡聚糖，使其分解為低分子量片段，失去親水性和粘性，消除β_葡聚糖的抗?fàn)I養(yǎng)作用。有研究結(jié)果表明，以β_葡聚糖酶為主要酶系的復(fù)合酶制劑添加在飼料中，就可以消除葡聚糖的抗?fàn)I養(yǎng)作用，提高動物采食量、增重和飼料轉(zhuǎn)化率(Mathlouthi N, etal.Anim res，2002，51:395-406)。為擴(kuò)大谷物等β _葡聚糖含量豐富的飼料的應(yīng)用開辟了一條具有重要經(jīng)濟(jì)價值的新途徑。常用于飼料工業(yè)的幾種商業(yè)酶中，β_葡聚糖酶是最常用而且最重要的品種之一，列入中國農(nóng)業(yè)部制定的《允許使用的飼料和飼料添加劑品種目錄》上的酶制劑。β -葡聚糖酶應(yīng)用于飼料中可提高飼料營養(yǎng)價值，突破飼料資源開發(fā)利用的局限，增強(qiáng)動物的生產(chǎn)與抗病能力，減少動物排泄物造成的污染，作為環(huán)保型添加劑，在發(fā)展環(huán)保型畜牧業(yè)中具有十分重要的意義與價值。
植物和微生物都能產(chǎn)生葡聚糖酶，生產(chǎn)中應(yīng)用較多的是微生物所產(chǎn)的葡聚糖酶，包括細(xì)菌，真菌和瘤胃微生物，已經(jīng)有多種不同來源的葡聚糖酶基因被克隆并表達(dá)。目前飼料用途的葡聚糖酶主要通過微生物發(fā)酵的方法生產(chǎn)，但其具有發(fā)酵過程耗能高，生產(chǎn)門檻高和成本高等缺點(diǎn)。而利用 轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)葡聚糖酶能夠很好的解決如上問題，因而是進(jìn)一步的發(fā)展方向，基因工程研究領(lǐng)域的進(jìn)展使利用植物表達(dá)葡聚糖酶用于飼料工業(yè)成為可倉泛。[0006]利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)飼用葡聚糖酶，其優(yōu)勢在于:1)轉(zhuǎn)基因植物尤其是轉(zhuǎn)基因玉米用作飼料原料，可以直接飼喂，而省去目前酶制劑的發(fā)酵生產(chǎn)和添加過程；2)生產(chǎn)規(guī)模不受限制，成本比較低。農(nóng)作物的生產(chǎn)、運(yùn)輸、加工和貯藏等各種基礎(chǔ)設(shè)施及技術(shù)早已具備，轉(zhuǎn)基因植物高水平表達(dá)生產(chǎn)重組蛋白可以通過大規(guī)模種植來完成；3)目前初步的研究發(fā)現(xiàn)，在植物，尤其是種子中表達(dá)的非淀粉多糖酶具有更好的貯存穩(wěn)定性和抗逆性；4)安全性好，用微生物發(fā)酵生產(chǎn)酶制劑，細(xì)胞培養(yǎng)過程中污染極其普遍，但在植物表達(dá)系統(tǒng)中沒有這種污染。另外，玉米為“飼料之王”，其用量占配合飼料的60-70%，是動物飼料中最主要的成分，也是畜禽生產(chǎn)肉、蛋、奶的主要能量來源。在作為生物反應(yīng)器這一層面上，與其它飼料作物相比，轉(zhuǎn)基因玉米有更好的經(jīng)濟(jì)效益和應(yīng)用前景。
針對葡聚糖酶的轉(zhuǎn)基因植物研究早在上世紀(jì)九十年代就已開始，主要研究集中于作物抵抗真菌病方面，如煙草(Libantova, J, et al.Biologia, 1998, 53:739-748)、水稻(Nishizawa, Y, et al.Plant Mol Biol, 2003，51:143-152)、油菜(藍(lán)海燕，等.生物工程學(xué)報，2000，16:142-146)、小麥(邢全華等.遺傳學(xué)報，2003，30:717-722)、棉花(程紅梅等.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005，38:1160-1166)和花生(Sundaresha, S，et al.Eur J PlantPathol, 2010, 126:497-508)等，并獲得了轉(zhuǎn)基因植株。而利用轉(zhuǎn)基因植物作為生物反應(yīng)器大規(guī)模表達(dá)葡聚糖酶的研究仍然極為有限，如馬鈴薯(Armstrong, JD, et al.Am J PotatoRes, 2002，79:39-48)和水稻(Zhang, Q, et al.Protein Expr Purif, 2012, 82:279-283) Gadab C 將來源于 Acidothermus cellulo/yticus 的葡聚糖酶轉(zhuǎn)入玉米(Gadab C，etal.Plant Sci，2006，171:617_623)，但是該研究存在的問題是轉(zhuǎn)葡聚糖酶植物的活性較低，而且沒有定位到合適的細(xì)胞器中，難以適應(yīng)飼料行業(yè)的需要，因此，獲得新型具有優(yōu)良特性葡聚糖酶的研究有重大意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是將來自嗜酸真菌Bispora sp.MEY-1的葡聚糖酶基因glu7a進(jìn)行優(yōu)化獲得能夠在玉米等農(nóng)作物中高效表達(dá)的葡聚糖酶基因；
本發(fā)明的目的 之二是提供含有葡聚糖酶基因或優(yōu)化的葡聚糖酶基因的重組植物表達(dá)載體；
本發(fā)明的目的之三是提供一種在作物種子中定點(diǎn)表達(dá)葡聚糖酶轉(zhuǎn)基因植物的構(gòu)建方法。
本發(fā)明的上述目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的:
為了提高葡聚糖酶基因在作物(尤其是玉米)中的表達(dá)效率，在不改變葡聚糖酶氨基酸序列的前提下，本發(fā)明將來源于Bispora sp.MEY-1的glu7a基因(核苷酸序列為SEQID N0.1所示，其中該序列中第596-655位的堿基為內(nèi)含子序列；SEQ ID N0.1所編碼的氨基酸序列為SEQ ID N0.3所示)(GenBank登錄號FJ695140)進(jìn)行密碼子優(yōu)化。經(jīng)密碼子優(yōu)化后，各氨基酸對應(yīng)的密碼子與玉米最適密碼子更加匹配，GC含量由優(yōu)化前的49.6%提高到優(yōu)化后的67% ;密碼子適應(yīng)指數(shù)(Codon Adaptation Index, CAI)由優(yōu)化前的0.715提高到優(yōu)化后的0.937,更多的使用了玉米中最優(yōu)的密碼子；密碼子有效數(shù)(effective numberof codons, Ne)則由優(yōu)化前的50.3縮減為優(yōu)化后的29.5 ;優(yōu)化前的葡聚糖酶基因(glu7a)中存在3個負(fù)順式元件(negative CISelements),經(jīng)優(yōu)化后全部去除。利用Centroidfold軟件分析密碼子優(yōu)化前后mRNA的穩(wěn)定性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，優(yōu)化前葡聚糖酶基因(glu7a)折疊自由能為-295.lOKcal/mol，優(yōu)化后為-337.05Kcal/mol，表明優(yōu)化后的葡聚糖酶基因mRNA的
穩(wěn)定性有顯著提高。
通過采用上述一系列的優(yōu)化手段使優(yōu)化后的葡聚糖酶基因glu7am的密碼子使用頻率更加符合玉米中高表達(dá)基因的情況，而且去除了可能影響基因轉(zhuǎn)錄翻譯的負(fù)面因素，最終得到SEQ ID N0.2所示的glu7am基因，密碼子優(yōu)化過程中沒有改變?nèi)鏢EQ IDN0.3所示的葡聚糖酶氨基酸序列。
本發(fā)明的另一目的是提供一種含有葡聚糖酶基因的重組植物表達(dá)載體，該重組植物表達(dá)載體包括:啟動子序列，葡聚糖酶基因，信號肽和蛋白體定位序列以及終止子序列。
其中所述的啟動子可以為單子葉植物組成型啟動子，如Ubi啟動子或CaMV35S啟動子，也可以是單子葉植物誘導(dǎo)型啟動子，還可以是單子葉植物組織特異性啟動子；所述的玉米胚特異表達(dá)的啟動子和終止子可分別根據(jù)GenBank登記號L22344和L22345設(shè)計引物，分別擴(kuò)增得到來自于玉米基因組DNA中玉米胚芽蛋白的啟動子和終止子片段。所述的玉米胚乳特異表達(dá)的啟動子和終止子序列可根據(jù)文獻(xiàn)(Woo, et al.2001，Plant cell.0ct.13(10):2297-317)來設(shè)計引物分離得到。優(yōu)選的，所述的啟動子序列可以是專利申請公開號為CN 101153285A (發(fā)明名稱為“一種表達(dá)植酸酶的轉(zhuǎn)基因植物的制備方法”)的中國發(fā)明專利申請文件中所公開的SEQ ID N0.3或SEQ ID N0.5所示的核苷酸序列。
所述的葡聚糖酶基因可以為SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列，優(yōu)選為SEQ ID N0.2所示的優(yōu)化的葡聚糖酶基因。
所述的信號肽和蛋白體定位序列可以是專利申請公開號為CN 101153285A (發(fā)明名稱為“一種表達(dá)植酸酶的轉(zhuǎn)基因植物的制備方法”)的中國發(fā)明專利申請文件中所公開的SEQ ID N0.9所示的核苷酸序列(引導(dǎo)基因產(chǎn)物分泌和定位的信號肽序列，控制基因產(chǎn)物的定位，該信號肽和蛋白體定位序列可以引導(dǎo)植酸酶定位到細(xì)胞的蛋白體中)。
所述的終止子序列可以是專利申請公開號為CN 101153285A(發(fā)明名稱為“一種表達(dá)植酸酶的轉(zhuǎn)基因植物的制備方法”)的中國發(fā)明專利申請文件中所公開的SEQ IDN0.4或SEQ ID N0.6所示的序列。
本發(fā)明的再一目的是提供一種表達(dá)轉(zhuǎn)葡聚糖酶基因植物的構(gòu)建方法，該方法能夠在作物種子中高效、定點(diǎn)表達(dá)葡聚糖酶，該方法包括以下步驟:
(I)構(gòu)建含有SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.2所示葡聚糖酶基因的重組植物表達(dá)載體；
(2)將所構(gòu)建的重組植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到受體農(nóng)作物中，篩選獲得高效表達(dá)葡聚糖酶的轉(zhuǎn)基因植物。
優(yōu)選的，步驟(I)中所述的重組植物表達(dá)載體的構(gòu)建方法包括:將信號肽和蛋白體定位序列，葡聚糖酶基因和終止子序列連接在一起后，可操作的連接到啟動子序列之后。
作為一個具體的實(shí)施方案，可以將SEQ ID N0.2所示的葡聚糖酶基因可操作的與植物表達(dá)載體PHP20754連接，即得到能在玉米等植物器官(種子)中高效、定點(diǎn)表達(dá)葡聚糖酶的重組植物表達(dá)載體；其中，所述植物表達(dá)載體PHP20754的構(gòu)建方法已在專利申請公開號為CN 101153285 A (發(fā)明名稱為“一種表達(dá)植酸酶的轉(zhuǎn)基因植物的制備方法”)的中國發(fā)明專利申請文件中詳細(xì)公開。[0024]其中，所述“可操作的連接”是指兩個或更多個元件之間功能性的連接，可操作連接的元件可為鄰接或非鄰接的；所述的植物表達(dá)載體可以由Y端非編碼區(qū)，SEQ IDN0.1或SEQ ID N0.2所示的核苷酸和3'非編碼區(qū)組成，其中，所述的5'端非編碼區(qū)可以包括啟動子序列、增強(qiáng)子序列或/和翻譯增強(qiáng)序列；所述的啟動子可以是組成性啟動子、誘導(dǎo)型啟動子、組織或器官特異性啟動子；所述的3'非編碼區(qū)可以包含終止子序列、mRNA切割序列等。合適的終止子序列可取自根癌農(nóng)桿菌的T1-質(zhì)粒，例如章魚堿合成酶和胭脂堿合成酶終止區(qū)。
所述的植物重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化受體農(nóng)作物的方法可為植物工程領(lǐng)域常規(guī)轉(zhuǎn)化方法，如農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法、PEG介導(dǎo)法、種質(zhì)系統(tǒng)介導(dǎo)法、電擊穿孔法或微注射法，本發(fā)明優(yōu)選為農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法或基因槍法，最優(yōu)選為基因槍法；
所述的受體農(nóng)作物優(yōu)選為油菜、玉米、大豆或小麥，更優(yōu)選為玉米。
本發(fā)明所述的植物外植體優(yōu)選為玉米幼胚或幼胚誘導(dǎo)的愈傷組織。
為了便于篩選陽性植株同時為了確保安全性的要求，本發(fā)明同時選用了植物選擇標(biāo)記基因的表達(dá)載體。將本發(fā)明的重組植物表達(dá)載體與植物選擇標(biāo)記基因表達(dá)載體共同轉(zhuǎn)化受體作物，選育得到表達(dá)葡聚糖酶而不含篩選標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因作物。通過共轉(zhuǎn)化策略，將抗性選擇基因和葡聚糖酶分別構(gòu)建于不同的表達(dá)載體上。在轉(zhuǎn)基因植物的后代選育中，可以利用后代分離得到表 達(dá)葡聚糖酶且不含篩選標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因植物。
優(yōu)選的，本發(fā)明所述的選擇標(biāo)記基因表達(dá)載體為pHP17042Bar ;所述選擇標(biāo)記基因表達(dá)載體pHP17042Bar的構(gòu)建方法已在專利申請公開號為CN 101153285A (發(fā)明名稱為“一種表達(dá)植酸酶的轉(zhuǎn)基因植物的制備方法”)的中國發(fā)明專利申請文件中詳細(xì)公開。
本發(fā)明將來源于Bispora sp.MEY-1的glu7a基因通過一系列的優(yōu)化手段得到能夠在玉米等作物中進(jìn)行高效表達(dá)SEQ ID N0.2所示的優(yōu)化的葡聚糖酶基因，優(yōu)化后的葡聚糖酶基因各氨基酸對應(yīng)的密碼子與玉米最適密碼子更加匹配，GC含量與密碼子適應(yīng)指數(shù)較優(yōu)化前有顯著提升，縮減了密碼子有效數(shù)，優(yōu)化后的葡聚糖酶基因mRNA的穩(wěn)定性也有顯著提聞。
本發(fā)明進(jìn)一步構(gòu)建了能夠在玉米等農(nóng)作物的種子等器官中高效、定點(diǎn)表達(dá)葡聚糖酶的重組植物表達(dá)載體并將其轉(zhuǎn)化到玉米中，通過PCR、Southern blot、Westernblot等方法篩選得到陽性轉(zhuǎn)葡聚糖酶基因植株。所得到的轉(zhuǎn)葡聚糖酶基因玉米植物可以在種子等器官中高效表達(dá)葡聚糖酶。優(yōu)化后的glu7am基因在玉米種子中的葡聚糖酶活力顯著高于未經(jīng)優(yōu)化的glu7a基因。飼料制粒穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在玉米中所表達(dá)的葡聚糖酶GLU7AM有良好的穩(wěn)定性，能夠在進(jìn)一步的飼料加工過程中保持其生物學(xué)活力。
本發(fā)明所涉及到的術(shù)語定義
除非另外定義，否則本文所用的所有技術(shù)及科學(xué)術(shù)語都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所了解相同的含義。雖然在本發(fā)明的實(shí)踐或測試中可使用與本文所述者類似或等效的任何方法、裝置和材料，但現(xiàn)在描述優(yōu)選方法、裝置和材料。
術(shù)語“基因” “核苷酸”或“多核苷酸”意指單股或雙股形式的脫氧核糖核苷酸、脫氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否則所述術(shù)語涵蓋含有天然核苷酸的已知類似物的核酸，所述類似物具有類似于參考核酸的結(jié)合特性并以類似于天然產(chǎn)生的核苷酸的方式進(jìn)行代謝。除非另外特定限制，否則所述術(shù)語也意指寡核苷酸類似物，其包括PNA (肽核酸)、在反義技術(shù)中所用的DNA類似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等)。除非另外指定，否則特定核酸序列也隱含地涵蓋其保守修飾的變異體(包括(但不限于)簡并密碼子取代)和互補(bǔ)序列以及明確指定的序列。特定而言，可通過產(chǎn)生其中一個或一個以上所選(或所有)密碼子的第3位經(jīng)混合堿基和/或脫氧肌苷殘基取代的序列來實(shí)現(xiàn)簡并密碼子取代(Batzer 等人,Nucleic Acid Res.19:5081 (1991) ; Ohtsuka 等人，J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985);和 Cassol 等人，(1992) ; Rossolini 等人，Mol Cell.Probes8:91-98(1994))。
術(shù)語“表達(dá)”指外源基因在宿主細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。
術(shù)語“轉(zhuǎn)化”指將外源基因引入到宿主細(xì)胞中的方法。


圖1葡聚糖酶基因優(yōu)化前、后密碼子使用頻率的比較;A葡聚糖酶基因glu7a (優(yōu)化前)的密碼子使用頻率；B葡聚糖酶基因glu7am (優(yōu)化后)的密碼子使用頻率。
圖2葡聚糖酶基因優(yōu)化前、后堿基組成的比較。
圖3密碼子優(yōu)化前、后參數(shù)比較；A:基因glu7a的密碼子使用頻率分布；B:基因glu7am的密碼子使用頻率分布；C:基因glu7a的GC含量分布；D:基因glu7am的GC含量分布；E:基因glu7a的密碼子頻率百分比；F:基因glu7am的密碼子頻率百分比；G:基因優(yōu)化前后參數(shù)比較，CAI (密碼子適應(yīng)指數(shù)(Codon Adaptationlndex), Negative CISelements (負(fù)順式元件)，Negative repeat elements (負(fù)重復(fù)原件);H:基因優(yōu)化前后Ne(密碼子有效數(shù)，effective number of codons)比較。
圖4密碼子優(yōu)化前、后mRNA 二級結(jié)構(gòu)的比較；A葡聚糖酶glu7a基因mRNA 二級結(jié)構(gòu)預(yù)測；B葡聚糖酶gl u7am基因mRNA 二級結(jié)構(gòu)預(yù)測。
圖5 葡聚糖酶植物重組表達(dá)載體 pHP20754-glu7a 或 pHP20754-glu7am(A)，glu7a或glu7am的表達(dá)盒(B)示意圖。
圖6轉(zhuǎn)基因玉米中葡聚糖酶基因的PCR分析；M:DNA分子量Marker ；1:陰性對照；
2:陽性對照；3-23:不同轉(zhuǎn)基因植株。箭頭所示為葡聚糖酶基因擴(kuò)增產(chǎn)物。
圖7轉(zhuǎn)基因玉米中葡聚糖酶的ELISA檢測結(jié)果。
圖8轉(zhuǎn)基因玉米表達(dá)葡聚糖酶的Western Blot檢測結(jié)果；M:蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；鄭58:輪回親本Z58的種子；1，2，3，4:含有葡聚糖酶基因的玉米種子；箭頭所示為葡聚糖酶蛋白條帶。
圖9葡聚糖酶GLU7AM的最適pH值(A)和pH穩(wěn)定性(B)。
圖10葡聚糖酶GLU7AM的最適溫度(A)和熱穩(wěn)定性(B)。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
試驗(yàn)材料[0049](I)載體及菌株:植物表達(dá)載體pHP20754和選擇標(biāo)記基因表達(dá)載體pHP17042bar的構(gòu)建方法已在專利申請公開號為CN 101153285A (發(fā)明名稱為“一種表達(dá)植酸酶的轉(zhuǎn)基因植物的制備方法”)的中國發(fā)明專利申請文件中詳細(xì)公開。PUC19載體購自生工生物工程(上海)有限公司；pEASY-T3載體和大腸桿菌(Escherichia coli)T0P10購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。
(2)葡聚糖酶基因:glu7a基因連接pEASY-T3載體并保存于大腸桿菌Τ0Ρ10中，合成的glu7am基因連接PUC19載體并保存于大腸桿菌T0P10中。
(3)酶類及其它生化試劑:內(nèi)切酶購自TaKaRa公司；連接酶購自NewEnglandBiolabs公司；葡聚糖和培養(yǎng)基鹽購自Sigma公司。
(4)抗血清和免疫檢測試劑:葡聚糖酶經(jīng)純化，溶于PBS緩沖液，經(jīng)過Bradford法定量，取4mg蛋白進(jìn)行免疫試驗(yàn)，得到兔抗葡聚糖酶血清；堿性磷酸酶標(biāo)記羊抗兔IgG以及BCIP/NBT檢測試劑盒購自康為世紀(jì)公司。
(5)培養(yǎng)基:大腸桿菌培養(yǎng)基為LB(1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、l%NaCl，pH7.0)，含lOOug/ml的氨芐青霉素鈉。
實(shí)施例1含有葡聚糖酶基因的植物重組表達(dá)載體的構(gòu)建
(I)葡聚糖酶基因glu7a植物重組表達(dá)載體的構(gòu)建:
菌株來源:Bispora sp.MEY-1 (雙孢菌屬),其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物保藏中心的保藏號為CGMCC N0.2500。
基因來源:來源于Bispora sp.MEY-1 的 glu7a基因(GenBank 登錄號 FJ695140,核苷酸序列為SEQ ID N0.1所示)連接于PEASY-T3載體中(基因上游引入Bam HI酶切位點(diǎn)，基因下游引入Xma I酶切位點(diǎn))，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌T0P10，得到含有重組質(zhì)粒PEASY_T3_glu7a的重組大腸桿菌菌株。
載體構(gòu)建:PEASY-T3_glu7a質(zhì)粒用Bam HI和Xms I酶切后與經(jīng)過同樣酶切處理得到的表達(dá)載體PHP20754相連接，得到葡聚糖酶重組表達(dá)載體pHP20754-glu7a。該重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌T0P10，得到含有重組表達(dá)載體pHP20754-glu7a的重組大腸桿菌菌株。
載體處理:從含有pHP20754_glu7a的大腸桿菌菌株中大量提取pHP20754_glu7a質(zhì)粒(圖5A)，經(jīng)Pvu II酶切線性化得到葡聚糖酶基因表達(dá)盒(圖5B)。含有選擇標(biāo)記基因的載體pHP17042Bar經(jīng)Hind ΙΙΙ/Xho I/Sac I酶切線性化得到Bar基因表達(dá)盒。線性化后的兩種表達(dá)盒按照1:1的摩爾比進(jìn)行混合。
(2)葡聚糖酶基因glu7am植物重組表達(dá)載體的構(gòu)建:
菌株來源:Bispora sp.MEY-1 (雙孢菌屬)，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物保藏中心的保藏號為CGMCC N0.2500。
基因改造:將來源于Bisporasp.MEY-1 的 glu7a基因(GenBank登錄號 FJ695140)進(jìn)行密碼子優(yōu)化。優(yōu)化結(jié)果表明，經(jīng)密碼子優(yōu)化后，各氨基酸對應(yīng)的密碼子與玉米最適密碼子更加匹配((圖1) ；GC含量由優(yōu)化前glu7a的49.6%提高至Ij glu7am的67%(圖2，圖3C，圖 3D);密碼子適應(yīng)指數(shù)(Codon Adaptation Index, CAI)由 glu7a 的 0.715 提高到 glu7am的0.937，更多的使用了玉米中最優(yōu)的密碼子(圖3A，圖3B，圖3E，圖3F，圖3G);而密碼子有效數(shù)(effective number of codons, Ne)則由 glu7a 的 50.3% 降低到 glu7am 的 29.5%(圖3H), glu7a基因中存在3個negative CIS elements,經(jīng)優(yōu)化后全部去除(圖3G)。這些結(jié)果表明經(jīng)密碼子優(yōu)化后，glu7am基因的密碼子使用頻率更加符合玉米高表達(dá)基因的情況，而且全面去除了影響基因轉(zhuǎn)錄翻譯的負(fù)面因素。
利用Centroidfold軟件分析密碼子優(yōu)化前后mRNA的穩(wěn)定性(圖4)。優(yōu)化前折疊自由能為-295.lOKcal/mol，優(yōu)化后為-337.05Kcal/mol，表明優(yōu)化后的葡聚糖酶基因mRNA的穩(wěn)定性有顯著提高，密碼子優(yōu)化得到SEQ ID如.2所示的81117&111基因。密碼子優(yōu)化過程中并未改變?nèi)鏢EQ ID N0.3所示的葡聚糖酶氨基酸序列。該基因人工合成并連接于TOC19載體中(基因上游引入Bam HI酶切位點(diǎn)，基因下游引入Xma I酶切位點(diǎn))，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌T0P10，得到含有重組質(zhì)粒PUC19-glu7am的重組大腸桿菌菌株。
載體構(gòu)建:PUC19_glu7am質(zhì)粒用Bam HI和Xma I酶切后與經(jīng)過同樣酶切處理得到的表達(dá)載體PHP20754相連接，得到葡聚糖酶重組表達(dá)載體pHP20754-glu7am。該重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌T0P10，得到含有重組表達(dá)載體PHP20754-glu7am的重組大腸桿菌菌株。
載體處理:從含有PHP20754_glu7am的大腸桿菌菌株中大量提取pHP20754-glu7am質(zhì)粒(圖5A)，pHP20754_glu7am經(jīng)Pvu II酶切線性化得到葡聚糖酶基因表達(dá)盒(圖5B)。含有選擇標(biāo)記基因的載體pHP17042Bar經(jīng)Hind ΙΙΙ/Xho I/Sac I酶切線性化得到Ba r基因表達(dá)盒。線性化后的兩種表達(dá)盒按照1:1的摩爾比進(jìn)行混合。
實(shí)施例2玉米的遺傳轉(zhuǎn)化
pHP20754-glu7a、pHP20754-glu7am 以及選擇標(biāo)記基因表達(dá)載體 pHP17042Bar 去除細(xì)菌骨架DNA后，分別得到glu7a基因表達(dá)盒，glu7am基因表達(dá)盒以及Bar基因的表達(dá)盒。將glu7a基因表達(dá)盒與Bar基因表達(dá)盒1:1等摩爾比混合、將glu7am基因表達(dá)盒與Bar基因表達(dá)盒1:1等摩爾比混合，用于基因槍微彈制備，轉(zhuǎn)化玉米外植體。所述外植體優(yōu)選為玉米幼胚或幼胚誘導(dǎo)形成的愈傷組織。
基因槍介導(dǎo)的玉米轉(zhuǎn)化:
培養(yǎng)基的配制和玉米基因槍轉(zhuǎn)化方法參照《植物細(xì)胞，組織和器官培養(yǎng):基本方法〉〉(Plant Cell, Tissue and Organ Culture-fundamental methods/0.L.Gamborg, G.C.Phillips eds., Springer) 一書中的方法進(jìn)行。
基因槍轉(zhuǎn)化:將鎢粉，葡聚糖酶基因glu7a表達(dá)盒和Bar基因的表達(dá)盒混合制備DNA微彈，通過基因槍設(shè)備轉(zhuǎn)化進(jìn)入玉米愈傷組織中；將鎢粉，葡聚糖酶基因glu7am表達(dá)盒和Bar基因的表達(dá)盒混合制備DNA微彈，通過基因槍設(shè)備轉(zhuǎn)化進(jìn)入玉米愈傷組織中。
選擇培養(yǎng):保持愈傷的培養(yǎng)基中加入3mmol/L的BASTA作為選擇壓力，對被轉(zhuǎn)化的材料進(jìn)行篩選培養(yǎng)，每兩周繼代一次。
再生:經(jīng)過兩個月的選擇培養(yǎng)后，抗性愈傷在選擇性培養(yǎng)基上生長迅速，顏色新鮮。將抗性愈傷轉(zhuǎn)到再生培養(yǎng)基上，兩到三周后，即可得到成熟的胚狀體。
分化成苗:將胚狀體放到MS培養(yǎng)基上生根，即得到再生玉米苗。緩和一周后移栽至溫室或大田管理，至收獲Tl代種子。
實(shí)施例3轉(zhuǎn)基因再生植株中葡聚糖酶基因的PCR分析
植株葉片基因組DNA的提取
a取0.1-0.2g植株葉片，液氮研磨，轉(zhuǎn)移至1.5mI的Eppendorf管中，加入0.6ml預(yù)熱的CTAB(Tris IOOmM, 1.4M NaCl, 20mM EDTA，2%CTAB，0.2%巰基乙醇)，充分混合，65° C裂解lh，期間每IOmin輕柔顛倒混合一次。
b加入等體積氯仿:異戍醇，輕柔混勻2min, 12，OOOrpm離心IOmin,吸取上清液置于新的1.5ml Eppendorf管中。
c加入等體積異丙醇，輕柔顛倒混勻，于室溫中靜置5min,然后12，OOOrpm離心IOmin,棄上清。
d加入0.5ml的70%乙醇,輕柔旋轉(zhuǎn)，清洗沉淀表面，8，OOOrpm離心5min,棄上清。
e沉淀自然風(fēng)干，加入50 μ I的超純水溶解沉淀。
葡聚糖酶基因的PCR分析:
利用引物glu7aF: 5 ’ -CAGCAGATTGGTCGCATACCAGAAG-3 ’ 和 glu7aR: 5 ’ -CTAATTCCAACCGCCAGAGCCAGA-3 ’ PCR擴(kuò)增葡聚糖酶glu7a轉(zhuǎn)基因植物；利用弓丨物glu7amF: 5 ’ -CTAGGATCCCAGCAGATCGGCCGCATCC-3’ 和 glu7amR: 5’ -TAACCCGGGCTAGTTCCACCCGCCGGAGC-3’ PCR 擴(kuò)增葡聚糖酶glu7am轉(zhuǎn)基因植物。反應(yīng)體系:再生植株DNA 1μ I (20-50ng)；10 μ I 2xTaq mix ；上下游引物各lumol/1，加無菌水至20μ I。反應(yīng)條件:94°C，5分鐘；94°C，30s，55°C，30s，72°C，lmin30s，32個循環(huán)；72°C延伸5分鐘。根據(jù)PCR結(jié)果篩選出陽性植株，圖6表示部分再生植株的PCR結(jié)果，證明葡聚糖酶基因(glu7a或glu7am)已經(jīng)整合在植物的基因組中。
實(shí)施例4轉(zhuǎn)基因植物中葡聚糖酶的ELISA檢測
取轉(zhuǎn)葡聚糖酶基因(glu7am)玉米種子室溫研磨成粉末,稱取30mg粉末加入朽1檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液(PH4.0) 300ul，置于30°C搖床中200rpm震蕩60min，然后IOOOOr/min，4°C離心5min，取上清液200 μ I包被ELISA反應(yīng)板，4°C過夜，PBS+0.l%Tween20洗板3次，每次2min ;加入1%BSA封閉液，37°C反應(yīng)lh, PBS+0.l%Tween20洗板3次，每次2min ；加入兔抗血清2000倍稀釋液，37°C反應(yīng)2h，PBS+0.l%Tween20洗板3次，每次2min ;再加入1000倍稀釋的堿性磷酸酶標(biāo)記羊抗兔IgG，37°C反應(yīng)lh，PBS+0.l%Tween20洗板3次，每次2min,去離子水洗板2次，每次2min ;加入底物pNPP顯色，用酶標(biāo)儀測定495nm吸收值。由圖7結(jié)果可見，轉(zhuǎn)葡聚糖酶基因(glu7am)玉米植株中的葡聚糖酶與對應(yīng)的抗血清具有明顯的特異性免疫反應(yīng)。
實(shí)施例5轉(zhuǎn)基因植物中葡聚糖酶的SDS-PAGE和Western blot檢測
提取ELISA反應(yīng)值高的轉(zhuǎn)葡聚糖酶基因(glu7a、glu7am)玉米蛋白粗提液，提取方法同實(shí)施例4。取20 μ I蛋白粗提液上清進(jìn)行SDS-PAGE分析。SDS-PAGE和Westernblot具體方法按照SambiOOk J等編著的《分子克隆試驗(yàn)手冊》進(jìn)行。
進(jìn)一步的Western Blot實(shí)驗(yàn)證明轉(zhuǎn)葡聚糖酶基因玉米中所提取的葡聚糖酶蛋白具有正常的免疫活性，圖8表示W(wǎng)estern Blot的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。以未轉(zhuǎn)基因的輪回親本玉米鄭58作為陰性對照。為了檢測該葡 聚糖酶植物重組表達(dá)載體啟動子的組織特異性，取陽性植株的根、莖和葉的抽提液同時進(jìn)行Western blot分析。由圖8結(jié)果可知，本發(fā)明所構(gòu)建的轉(zhuǎn)葡聚糖酶基因(glu7a、glu7am)玉米的根、莖和葉部位沒有葡聚糖酶蛋白表達(dá)，但在種子中可以明顯看到葡聚糖酶的表達(dá)；輪回親本鄭58的玉米種子沒有葡聚糖酶的蛋白表達(dá)，說明本發(fā)明轉(zhuǎn)葡聚糖酶基因(glu7a、glu7am)玉米的葡聚糖酶表達(dá)定位于玉米種子中，具有組織特異性。
實(shí)施例6轉(zhuǎn)基因植物中葡聚糖酶的活性分析
按照實(shí)施例4的方法提取轉(zhuǎn)葡聚糖酶基因(glu7a、glu7am)植物中的蛋白粗提液，用檸檬酸緩沖液稀釋至合適的濃度。
取20ml磨沙口帶塞子的試管按下面的反應(yīng)順序進(jìn)行操作，每個樣品作3個平行樣。在反應(yīng)過程中，從加入底物開始，向每支試管中加入試劑的時間間隔要絕對一致，60°C水解lOmin。反應(yīng)步驟及試劑、溶液用量見表I。
表I葡聚糖酶活力測定反應(yīng)體系
權(quán)利要求
1.優(yōu)化的葡聚糖酶基因，其特征在于:其核苷酸序列為SEQID N0.2所示。
2.含有權(quán)利要求
1所述優(yōu)化的葡聚糖酶基因的重組表達(dá)載體。
3.按照權(quán)利要求
2所述的重組表達(dá)載體，其特征在于:所述重組表達(dá)載體是重組植物表達(dá)載體。
4.一種重組植物表達(dá)載體，其特征在于，包括:啟動子序列，葡聚糖酶基因，信號肽和蛋白體定位序列以及終止子序列；所述的葡聚糖酶基因的核苷酸序列為SEQ ID N0.2所
5.按照權(quán)利要求
4所述的重組植物表達(dá)載體，其特征在于:所述的啟動子為單子葉植物組成型啟動子、單子葉植物誘導(dǎo)型啟動子或單子葉植物組織特異性啟動子。
6.一種構(gòu)建權(quán)利要求
4所述重組植物表達(dá)載體的方法，包括:將信號肽和蛋白體定位序列，葡聚糖酶基因和終止子序列連接在一起后可操作的連接到啟動子序列之后。
7.—種構(gòu)建表達(dá)葡聚糖酶的轉(zhuǎn)基因植物的方法，該方法包括以下步驟: (O構(gòu)建含有葡聚糖酶基因的重組植物表達(dá)載體；所述的葡聚糖酶基因的核苷酸序列為 SEQ ID N0.2 所示； (2)將所構(gòu)建的重組植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到受體農(nóng)作物中，篩選獲得表達(dá)葡聚糖酶的轉(zhuǎn)基因植物。
8.按照權(quán)利要求
7所述的方法，其特征在于:將所構(gòu)建的重組植物表達(dá)載體與植物選擇標(biāo)記基因表達(dá)載體共同轉(zhuǎn)化受體作物，選育得到表達(dá)葡聚糖酶而不含篩選標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因作物；所述的選擇標(biāo)記基因表達(dá)載體為pHP17042Bar。
9.按照權(quán)利要求
7所述的方法，其特征在于，所述的重組植物表達(dá)載體的構(gòu)建方法包括:將信號肽和蛋白體定位序列，葡聚糖酶基因和終止子序列連接在一起后可操作的連接到啟動子序列之后；所述的啟動子為單子葉植物組成型啟動子、單子葉植物誘導(dǎo)型啟動子或單子葉植物組織特異性啟動子。
10.按照權(quán)利要求
7或8所述的方法，其特征在于:所述的受體農(nóng)作物為玉米、油菜、大豆或小麥。
專利摘要
本發(fā)明公開了優(yōu)化的葡聚糖酶基因及其重組植物表達(dá)載體和應(yīng)用。本發(fā)明將來源于Bispora sp.MEY-1的葡聚糖酶基因通過一系列的優(yōu)化手段得到SEQ ID NO.2所示的優(yōu)化的葡聚糖酶基因；本發(fā)明進(jìn)一步構(gòu)建了能夠在作物種子中定點(diǎn)表達(dá)葡聚糖酶的重組植物表達(dá)載體，在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明提供了一種在作物種子中定點(diǎn)表達(dá)葡聚糖酶的轉(zhuǎn)基因植物的構(gòu)建方法。本發(fā)明方法能夠?qū)⑵暇厶敲冈谟衩椎茸魑锓N子中進(jìn)行定點(diǎn)高效的表達(dá)，優(yōu)化后的葡聚糖酶基因在玉米種子所表達(dá)的葡聚糖酶的酶活及表達(dá)量較優(yōu)化前有顯著提升，并且在進(jìn)一步的飼料加工過程以及在動物胃內(nèi)可以保持較高的穩(wěn)定性。
文檔編號C12N15/66GKCN102876694 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請?zhí)朇N 201210431520
公開日2013年8月28日 申請日期2012年11月1日
發(fā)明者張宇宏, 張偉, 陳茹梅, 姚斌, 楊培龍, 袁建華, 徐曉露, 孟昆, 孟慶長 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan