專利名稱:一種殼聚糖微球固定化胰蛋白酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種殼聚糖固定化酶的方法，特別是一種殼聚糖微球固定化胰蛋白方
法，屬于食品加工技術(shù)領(lǐng)域：
。
技術(shù)背景
胰蛋白酶是食品工業(yè)中常用的一種蛋白酶，如在牛乳蛋白的改性，魚蝦、動物蛋白 的酶法水解回收蛋白中均有應(yīng)用。但是酶制劑通常比較昂貴，且使用過程中酶容易失活且 通常無法再回收利用，因此往往導(dǎo)致生產(chǎn)成本的提高；另外由于酶的不可回收性，也導(dǎo)致在 食品中引入外來物質(zhì)的風(fēng)險。而固定化酶能夠提高酶的穩(wěn)定性，能夠在較長的時間里保持 活力，并且通過固定化以后能夠?qū)崿F(xiàn)回收利用，大大降低了酶的使用成本，因此固定化胰蛋 白酶具有很重要的現(xiàn)實意義。殼聚糖(chitosan)是甲殼素脫乙?；漠a(chǎn)物，是一種堿性陽 離子多糖，殼聚糖具有很好的成膠性質(zhì)，易于形成膜、多孔微球、凝膠，可加工成粉、納米粒 子等多種形態(tài)，同時殼聚糖易于進行化學(xué)改性，引入新的功能團，如可發(fā)生?；?、羧基化、 醚化、Schiff反應(yīng)、N-烷基化、酯化、氧化、鹵化、接枝共聚等反應(yīng)，從而制得各種系列衍生
物，作為一種天然高分子生物材料。此外，殼聚糖具有良好的機械性能、耐熱性、抗菌性以及 生物相容性和生物降解性，安全可靠，對人類無害并且對環(huán)境無污染。因此，殼聚糖及其衍 生物是一類性能優(yōu)良的固定化酶載體。Krajewska研究了過去十年中殼聚糖在固定化酶方 面的應(yīng)用，以多種形態(tài)的殼聚糖作為載體，已經(jīng)用于63種酶的固定化。國內(nèi)已有很多關(guān)于 殼聚糖固定化酶的報道，如公開號CN1285403A公布了一種殼聚糖微球固定化木瓜蛋白酶 的方法，公開號CN101113433的專利公開了一種殼聚糖微球固定化脂肪酶制備工藝，公開 號CN101285060A則公布了一種殼聚糖_精氨酸陰離子樹脂固定化胰凝乳蛋白酶的方法。 關(guān)于用殼聚糖固定化胰蛋白酶國內(nèi)外已有報道，但固定化采用的方法各不相同，如采用殼 聚糖吸附戊二醛交聯(lián)的方法固定胰蛋白酶，還有采用采用交聯(lián)-吸附法對胰蛋白酶的固定 化。正如公開號CN101285060A專利中所提到的，先前的一些研究大多存在一些缺陷，如得 到的產(chǎn)品雜質(zhì)多、活力低等。有利于降低生產(chǎn)成本。殼聚糖是一種天然高分子生物材料，具 有良好的生物相容性和生物降解性，安全可靠，對人類無害并且對環(huán)境無污染，用其固定化 胰蛋白酶，無殘留、安全性高。本發(fā)明提供了一種殼聚糖微球固定化胰蛋白酶的方法，使胰 蛋白酶可以重復(fù)使用，提高了胰蛋白酶的利用效率，降低了蛋白質(zhì)水解過程中酶的用量和 生產(chǎn)成本，可廣泛應(yīng)用于牛乳、肉類、水產(chǎn)等蛋白質(zhì)的水解過程與改性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的提供了一種殼聚糖微球固定化胰蛋白酶的方法，通過殼聚糖固定 化胰蛋白酶，使胰蛋白酶可以重復(fù)使用，提高胰蛋白酶的利用效率，降低蛋白質(zhì)水解過程中 酶的用量和生產(chǎn)成本，同時增大殼聚糖的應(yīng)用范圍，為殼聚糖資源的推廣應(yīng)用提供依據(jù)。
本發(fā)明的技術(shù)方案一種殼聚糖微球固定化胰蛋白酶的方法，是以殼聚糖為固定 化載體，將殼聚糖在醋酸溶液中溶解后，利用反相懸浮法制備殼聚糖微球，然后利用戊二醛
3為交聯(lián)劑對殼聚糖微球進行交聯(lián)活化，將交聯(lián)活化后的殼聚糖微球與胰蛋白酶溶液混合進 行固定化，制得固定化胰蛋白酶。具體制備方法如下
(1)殼聚糖微球的制備及活化稱取一定量的殼聚糖溶于質(zhì)量濃度1% _3%的醋 酸溶液中，制得質(zhì)量濃度為2% _4%的殼聚糖溶液。接著加入液體石蠟和span-80和致孔 劑乙酸乙酯，高速攪拌的情況下緩慢加入殼聚糖溶液，保持高速攪拌40-100min，使殼聚糖 液滴均勻分散，得到懸浮的乳狀液，然后緩慢往乳狀液中加入戊二醛溶液，使乳狀液中戊二 醛的質(zhì)量濃度達到2% _6%，在4-451:下交聯(lián)活化l-10h，靜置冷卻后，將所得乳狀液倒入 等體積的NaOH/乙醇混合液中，充分混合振蕩，而后靜置，棄去油層和水層，最后用去離子 水反復(fù)洗滌抽濾至中性，得到活化的殼聚糖微球；
(2)固定化酶的制備用pH6. 0-7. 0的磷酸鹽緩沖溶液溶解胰蛋白酶，然后按胰蛋 白酶/殼聚糖微球為0. 5mg/g-4mg/g的比例將胰蛋白酶溶液與殼聚糖微球混合，攪拌均勻 后于4t:冰箱中靜置5-24h，用pH6. 0-7. 0的緩沖液抽洗至濾液中檢測不到蛋白質(zhì)存在即得 到固定化胰蛋白酶。
所述的span-80用量為石蠟質(zhì)量的0. 1% _1 % ，致孔劑乙酸乙酯的用量為石蠟質(zhì) 量的0.01%-0. 1%，殼聚糖溶液/石蠟質(zhì)量比為1 : 1.5-1 : 3。
所述的NaOH/乙醇混合液為l_2mol/L的NaOH溶液與乙醇按照體積比1 : 1混合
而成的混合液。
本發(fā)明的有益效果
殼聚糖(chitosan)是一種天然高分子生物材料，具有良好的生物相容性和生物 降解性，安全可靠，用其固定化胰蛋白酶，安全性高，無殘留，對人類無害并且對環(huán)境無污染 本發(fā)明提供了一種殼聚糖微球固定化胰蛋白酶的方法。本發(fā)明通過殼聚糖固定化 胰蛋白酶，使胰蛋白酶可以重復(fù)使用，提高了胰蛋白酶的利用效率，降低了蛋白質(zhì)水解過程 中酶的用量和生產(chǎn)成本，可廣泛應(yīng)用于牛乳、肉類、水產(chǎn)等蛋白質(zhì)的水解過程與改性。 本發(fā)明得到的固定化胰蛋白酶活力高，酶活回收率高達到73.32%，操作穩(wěn)定性 好，連續(xù)操作7批，活力保持80%以上。
具體實施方式
實施例1
(1)殼聚糖微球的制備稱取一定量的殼聚糖溶于質(zhì)量濃度1%的醋酸溶液中，制 得質(zhì)量濃度為2%的殼聚糖溶液。在容器中加入液體石蠟、span-80和致孔劑乙酸乙酯， span-80用量為石蠟質(zhì)量的0. 5%，致孔劑乙酸乙酯用量為石蠟質(zhì)量的0. 01% ;高速攪拌的 情況下緩慢加入殼聚糖溶液，殼聚糖溶液/石蠟質(zhì)量比為l : 1.5，保持高速攪拌40min，使 殼聚糖液滴均勻分散，得到懸浮的乳狀液；然后在攪拌的情況下往乳狀液中緩慢加入戊二 醛溶液，使乳狀液中戊二醛質(zhì)量濃度達到1%，在45t:下反應(yīng)lh。靜置冷卻后，將所得乳狀 液倒入等體積的NaOH/乙醇混合液中，充分混合振蕩，而后靜置，棄去油層和水層，最后用 去離子水反復(fù)洗滌抽濾至中性，得到活化的殼聚糖微球。所用NaOH/乙醇混合液為lmol/L 的NaOH溶液與乙醇按照體積比1 : l混合而成的混合液。
(2)固定化酶的制備用pH6. 0的磷酸鹽緩沖溶液溶解胰蛋白酶，然后按胰蛋白酶 /殼聚糖微球0. 5mg/g的比例將胰蛋白酶溶液與殼聚糖微球混合，攪拌均勻后于4t:冰箱中
4靜置5h，用pH6. 0的緩沖液抽洗至濾液中檢測不到蛋白質(zhì)存在即得到固定化胰蛋白酶。 實施例2
(1)殼聚糖微球的制備稱取一定量的殼聚糖溶于質(zhì)量濃度2%的醋酸溶液中，制 得質(zhì)量濃度為3%的殼聚糖溶液。在容器中加入液體石蠟、span-80和致孔劑乙酸乙酯， span-80用量為石蠟質(zhì)量的0. 1 %，致孔劑乙酸乙酯用量為石蠟質(zhì)量的0. 05% ;高速攪拌的 情況下緩慢加入殼聚糖溶液，殼聚糖溶液/石蠟質(zhì)量比為l : 2，保持高速攪拌60min，使殼 聚糖液滴均勻分散，得到懸浮的乳狀液；然后在攪拌的情況下往乳狀液中緩慢加入戊二醛 溶液，使乳狀液中戊二醛質(zhì)量濃度達到6%，在fC下反應(yīng)10h。靜置冷卻后，將所得乳狀液 倒入等體積的NaOH/乙醇混合液中，充分混合振蕩，而后靜置，棄去油層和水層，最后用去 離子水反復(fù)洗滌抽濾至中性，得到活化的殼聚糖微球。所用NaOH/乙醇混合液為2mol/L的 NaOH溶液與乙醇按照體積比1 : l混合而成的混合液。
(2)固定化酶的制備用pH7. 0的磷酸鹽緩沖溶液溶解胰蛋白酶，然后按胰蛋白酶 /殼聚糖微球2mg/g的比例將胰蛋白酶溶液與殼聚糖微球混合，攪拌均勻后于4t:冰箱中靜 置24h，用pH7. 0的緩沖液抽洗至濾液中檢測不到蛋白質(zhì)存在即得到固定化胰蛋白酶。 實施例3
(1)殼聚糖微球的制備稱取一定量的殼聚糖溶于質(zhì)量濃度3%的醋酸溶液中，制 得質(zhì)量濃度為4%的殼聚糖溶液。在容器中加入液體石蠟、span-80和致孔劑乙酸乙酯， span-80用量為石蠟質(zhì)量的1 % ，致孔劑乙酸乙酯用量為石蠟質(zhì)量的0. 1% ;高速攪拌的情 況下緩慢加入殼聚糖溶液，殼聚糖溶液/石蠟質(zhì)量比為1 : 3，保持高速攪拌100min，使殼 聚糖液滴均勻分散，得到懸浮的乳狀液；然后在攪拌的情況下往乳狀液中緩慢加入戊二醛 溶液，使乳狀液中戊二醛質(zhì)量濃度達到3%，在3(TC下反應(yīng)4h。靜置冷卻后，將所得乳狀液 倒入等體積的NaOH/乙醇混合液中，充分混合振蕩，而后靜置，棄去油層和水層，最后用去 離子水反復(fù)洗滌抽濾至中性，得到活化的殼聚糖微球。所用NaOH/乙醇混合液為1. 5mol/L 的NaOH溶液與乙醇按照體積比1 : l混合而成的混合液。
(2)固定化酶的制備用pH6. 6的磷酸鹽緩沖溶液溶解胰蛋白酶，然后按胰蛋白酶 /殼聚糖微球4mg/g的比例將胰蛋白酶溶液與殼聚糖微球混合，攪拌均勻后于4t:冰箱中靜 置10h，用p朋.6的緩沖液抽洗至濾液中檢測不到蛋白質(zhì)存在即得到固定化胰蛋白酶。
5
權(quán)利要求
一種殼聚糖微球固定化胰蛋白酶的方法，其特征是以殼聚糖為固定化載體，將殼聚糖在醋酸溶液中溶解后，利用反相懸浮法制備殼聚糖微球，然后利用戊二醛為交聯(lián)劑對殼聚糖微球進行交聯(lián)活化，將交聯(lián)活化后的殼聚糖微球與胰蛋白酶溶液混合進行固定化，制得固定化胰蛋白酶；所述的殼聚糖微球的制備及活化稱取一定量的殼聚糖溶于質(zhì)量濃度1％-3％的醋酸溶液中，制得質(zhì)量濃度為2％-4％的殼聚糖溶液，在容器中加入液體石蠟和span-80和致孔劑乙酸乙酯，高速攪拌的情況下緩慢加入殼聚糖溶液，保持高速攪拌40-100min，使殼聚糖液滴均勻分散，得到懸浮的乳狀液。然后緩慢往乳狀液中加入戊二醛溶液，使乳狀液中戊二醛的質(zhì)量濃度達到2％-6％，在4-45℃下交聯(lián)活化1-10h，靜置冷卻后，將所得乳狀液倒入等體積的NaOH/乙醇混合液中，充分混合振蕩，而后靜置，棄去油層和水層，最后用去離子水反復(fù)洗滌抽濾至中性，得到活化的殼聚糖微球；所述的固定化酶的制備用pH6.0-7.0的磷酸鹽緩沖溶液溶解胰蛋白酶，然后按胰蛋白酶/殼聚糖微球為0.5mg/g-4mg/g的比例將胰蛋白酶溶液與殼聚糖微球混合，攪拌均勻后于4℃冰箱中靜置5-24h，用pH6.0-7.0的緩沖液抽洗至濾液中檢測不到蛋白質(zhì)存在即得到固定化胰蛋白酶。
2. 根據(jù)權(quán)利要求
l所述的一種殼聚糖微球固定化胰蛋白酶的方法，其特征是所 述的span-80用量為石蠟質(zhì)量的O. 1% -1%，致孔劑乙酸乙酯的用量為石蠟質(zhì)量的 0.01%-0. 1%，殼聚糖溶液/石蠟質(zhì)量比為1 : 1.5-1 : 3。
3. 根據(jù)權(quán)利要求
1所述的一種殼聚糖微球固定化胰蛋白酶的方法，其特征是所述的 NaOH/乙醇混合液為l-2mol/L的NaOH溶液與乙醇按照體積比1 : 1混合而成的混合液。
專利摘要
本發(fā)明提供了一種殼聚糖微球固定化胰蛋白酶的方法，屬于食品加工技術(shù)領(lǐng)域：
。本發(fā)明以殼聚糖為固定化載體，將殼聚糖在醋酸溶液中溶解后，利用反相懸浮法制備殼聚糖微球，然后利用戊二醛為交聯(lián)劑對殼聚糖微球進行交聯(lián)活化，將交聯(lián)活化后的殼聚糖微球與胰蛋白酶溶液混合進行固定化，制得固定化胰蛋白酶。胰蛋白酶是食品工業(yè)中蛋白質(zhì)改性、水解最常用的酶制劑之一，本發(fā)明通過殼聚糖固定化胰蛋白酶，使胰蛋白酶可以重復(fù)使用，提高了胰蛋白酶的利用效率，降低了蛋白質(zhì)水解過程中酶的用量和生產(chǎn)成本，可廣泛應(yīng)用于牛乳、肉類、水產(chǎn)等蛋白質(zhì)的水解過程與改性。
文檔編號C12N11/10GKCN101775386SQ201010103862
公開日2010年7月14日 申請日期2010年1月26日
發(fā)明者夏文水, 姜啟興, 譚麗 申請人:武漢工業(yè)學(xué)院導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan