專利名稱:一種具半乳甘露聚糖降解能力的嗜酸α-半乳糖苷酶AgalB及其基因和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種具半乳甘露聚糖降解能力的嗜酸α-半乳糖苷酶AgalB及其基因和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
α-半乳糖苷酶或蜜二糖酶(a-galactosidase，α -D-galactoside galactohydrolase, EC 3. 2. 1. 22)是一種外切型糖苷酶，它能從各種半乳糖苷上將非還原性末端的α-(1，6)鍵連接的半乳糖基催化水解下來。這類糖苷包括半乳糖寡糖(如蜜二糖、棉子糖和水蘇糖)、分支多糖(如半乳甘露聚糖)和半乳糖脂(Margolles-Clark Ε, et al.Eur J Biochem，1996，240 (1) :104-11.)。
α -半乳糖苷酶作為一種新型飼用酶制劑在飼料工業(yè)中得到了廣泛的應(yīng)用。豆粕是飼料中用量最大的蛋白質(zhì)原料，在大豆粕中棉子糖和水蘇糖的含量約為7%，它們不能被動物消化道的內(nèi)源酶降解，只有經(jīng)過消化道微生物發(fā)酵以后才能被利用，發(fā)酵過程中產(chǎn)生的C02，CH4和H2等氣體使機體出現(xiàn)一系列的脹氣惡心等癥狀。通過添加α-半乳糖苷酶不僅可以降解不溶性的低聚糖提高豆粕的代謝能，同時還可以消除腸道的脹氣現(xiàn)象增加動物的采食量(Brenes,A. Poultry Science，1993，72 :2281_2四3)。在食品工業(yè)中α-半乳糖苷酶可用于豆奶的發(fā)酵水解豆奶中易使胃脹氣的蜜三糖和水蘇糖，從而獲得低α-半乳糖基寡聚糖含量的豆奶制品有利于人體消化(Cruz R，et al. Journal of Food Science，1981， 46:1196-1200)。除此以外，利用α -半乳糖苷酶的轉(zhuǎn)移酶活性可改造環(huán)糊精改變藥物的理化性質(zhì)，增加藥物的穩(wěn)定性，從而延長藥效。α-半乳糖苷酶在臨床醫(yī)學(xué)上可用于治療法布里病及 B-O 型血的轉(zhuǎn)換(Zhu A, et al. ArchBiochem Biophys, 1996,327(2) :324-329)
瓜爾豆膠(guar gum)中含有38% 40%的α -半乳糖，半乳糖是以殘基的形式連接在以甘露糖為主鏈的聚糖鏈上。由于α-半乳糖側(cè)鏈的存在對甘露聚糖的特性有很大影響，瓜爾豆膠凝膠能力和它在水中的溶解度決定于其側(cè)鏈的多少和位置。用α-半乳糖苷酶來處理，適量除去其側(cè)鏈的半乳糖苷殘基而不使甘露聚糖主鏈斷裂，可提高其水溶性， 也可大幅度提高瓜爾豆膠的高凝膠能力，從而提高它的商品性能。利用酶法(α-半乳糖和甘露聚糖酶的共同作用)改良瓜爾豆膠可以進一步提高其利用范圍。有報道，經(jīng)酶解后的改性瓜爾豆膠被用作口服的結(jié)腸定向給藥載體，在胃腸道中控制藥物釋放，以及在結(jié)直腸癌的治療上載運結(jié)腸靶向藥物(Burke MD, et al. Journal ofControlled Release, 2005, 104 :141-153)。
α-半乳糖苷酶廣泛存在于微生物、植物、動物和人體內(nèi)。不同來源的微生物 α-半乳糖苷酶這根據(jù)其性質(zhì)特性的不同被應(yīng)用于不同的領(lǐng)域。而在食品及飼料工業(yè)中則要求添加的α-半乳糖苷酶對各種α-半乳糖苷類寡糖都要具有較高的水解能力，而以前報道的α -半乳糖苷酶其底物特異性不能水解多種底物，在應(yīng)用上各具有其局限性。
本發(fā)明得到了一個新的α-半乳糖苷酶基因，其編碼的α-半乳糖苷酶具有耐酸性，作用PH范圍較廣，較好的耐熱性，極好的抗蛋白酶能力，較好的水解各種底物的能力， 其對半乳甘露聚糖支鏈的降解可顯著促進甘露聚糖酶對底物主鏈的降解能力，該酶作為一種新型的酶制劑，可廣泛的應(yīng)用于飼料、食品、醫(yī)藥等行業(yè)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種具半乳甘露聚糖降解能力的嗜酸α-半乳糖苷酶 AgalB0
本發(fā)明的再一目的是提供編碼上述α -半乳糖苷酶的基因。
本發(fā)明的再一目的是提供包含上述α -半乳糖苷酶基因的重組載體。
本發(fā)明的再一目的是提供包含上述α -半乳糖苷酶基因的重組菌株。
本發(fā)明的再一目的是提供一種制備上述嗜酸α -半乳糖苷酶AgalB的基因工程方法。
本發(fā)明的再一目的是提供上述嗜酸α-半乳糖苷酶的應(yīng)用。
本發(fā)明從嗜酸真菌Bispora sp. MEY-I獲得了一種具半乳甘露聚糖降解能力的嗜酸α -半乳糖苷酶AgalB，所述嗜酸真菌Bispora sp在公開號為CN101457207的專利申請文獻中公開，其保藏號為CGMCC 2500，于2008年5月19日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所，100101)。
根據(jù)本發(fā)明的具半乳甘露聚糖降解能力的嗜酸α-半乳糖苷酶AgalB，其氨基酸序列如 SEQ ID NO. 1 所示MAILFACFAT LVGHSIALNN GVGKVPPMGY DTFNAYGCDY NASSVLAQGEAMKRTGLVDA 60GYNIFILDDC YALKERNATG YMVADPKKFP NGIPALSKQM NDLGISLAAYGDNGYYTCAG 120YPGSYGHEMK DLETffHSffGM SYLKYDNCYI PADNITQENM FGRYTRMSDAIAAFAAKIHR 180PPFIFYLCEW GffQQPffIffGR RISQGffRIDG DIKPYffSAIA SI IDQASFQYffASDFYGRND 240MDILEVGNTG QGTPPGNLTY EESKTHFTAff ALMKSPLIIG TDLTNATQETIDILGNRDLI 300KINQDPHVGE SISPFRffGVN PDYVSNPDHP AEYffSGNSSY GVVFMIINSQNTEQTMFFNL 360TESWAIRAGR QYSVYDMffTH TYEGVAVffNL TFSLPPHGVR ALLLNDAGPQPANLDGTCAF 420YYQCSV 426
其中，該酶全長4 個氨基酸，N端17個氨基酸為其預(yù)測的信號肽序列 "MAILFACFATLVGHSIA" (SEQ ID NO. 2)。
因此，成熟的嗜酸α -半乳糖苷酶的理論分子量為46. SkDa,其氨基酸序列如 SEQID NO. 3 所示LNNGVGKVPP MGYDTFNAYG CDYNASSVLA QGEAMKRTGL VDAGYNIFILDDCYALKERN 60ATGYMVADPK KFPNGIPALS KQMNDLGISL AAYGDNGYYT CAGYPGSYGHEMKDLETffHS 120WGMSYLKYDN CYIPADNITQ ENMFGRYTRM SDAIAAFAAK IHRPPFIFYLCEffGffQQPffI 180WGRRISQGffR IDGDIKPYffS AIASIIDQAS FQYffASDFYG RNDMDILEVGNTGQGTPPGN 240LTYEESKTHF TAffALMKSPL IIGTDLTNAT QETIDILGNR DLIKINQDPHVGESISPFRff 300GVNPDYVSNP DHPAEYffSGN SSYGVVFMI I NSQNTEQTMF FNLTESffAIRAGRQYSVYDM 360WTHTYEGVAV WNLTFSLPPH GVRALLLNDA GPQPANLDGT CAFYYQCSV 409
根據(jù)本發(fā)明的α -半乳糖苷酶AgaB，最適ρΗ為3. 5，最適溫度為55 °C，具有很好的胃蛋白酶和胰蛋白酶抗性，具多種底物降解能力。[0018] 本發(fā)明還提供了編碼上述嗜酸α-半乳糖苷酶的基因。該酶的全基因序列如SEQID NO.,4 所示ATGGCGATAC TTTTTGCTTG CTTTGCGACG CTTGTGGGCCACTCGATCGCCTTGAACAAT60GGCGTGGGCAAAGTCCCTCCAATGGGCTACGACACATTCAATGCGTACGGTTGCGATTAC120AATGCTAGCAGTGTTCTCGCGCAAGGCGAGGCAATGAAACGAACAGGCCTAGTTGACGCC180GGTTATAACATTTTCATTTTAGACGATTGTTATGCCTTGAAGGAGCGTAATGCTACCGGC240TACATGGTTGCTGATCCAAAGAAATTTCCGAATGGTATTCCGGCTCTATCTAAGCAAATG300AATGATCTCGGAATTAGCCTTGCTGCGTATGGTGACAATGGTTATTATACATGCGCCGGC360TATCCAGGCTCTTATGGCCATGAGATGAAGGACTTGGAGGTAGGGCGAACCCGTCGATTA420ACGGAACGGTGGCTGATTCCTTCGACAGACCTGGCATTCTTGGGGCATGTCTTACCTGAA480GTATGACAACTGCTGTGAGTTCCAAGTCCCTAATCGATTCTGCTGCATCCTCACATGGGA540ATCGTCAAGATATACCGGCCGACAACATTACTCAAGAGAACATGTTCGGTCGGTACACTC600GCATGTCGGACGCAATCGCGGCCTTTGCGGCCAAGATTCATCGACCGCCGTTCATCTTCT660ACCTTTGCGAATGGGGCTGGCAGCAACCTTGGATCTGGGGTCGCCGGATTTCCCAAGGTT720GGCGTATTGATGGTGACATCAAGCCATATTGGAGCGCGATCGCCTCTATTATTGATCAGG780CGTCATTCCAGTACTGGGCTTCCGACTTCTACGGACGCAATGACATGGACATCCTCGAGG840TTGGAAACACCGGACAAGGCACTCCGCCGGGGAACCTAACGTACGAAGAATCTAAGACTC900ATTTCACAGCCTGGGCGTTGATGAAAAGTCCACTGATCATCGGCACTGATCTTACGAACG960CAACGCAGGAGACGATCGACATCCTCGGCAACCGAGACTTGATCAAAATCAATCAGGACC1020CTCATGTTGGTGAGTCGATTTCCCCTTTTCGATGGGGAGTTAATCCAGACTATGTCTCTA1080ATCCGGACCATCCCGCCGAGTACTGGTCGGGCAACTCTAGCTACGGAGTAGTGTTTATGA1140TTATTAATAGCCAAAACACCGAGCAAACCATGTTCTTCAATTTGACGGAGAGTTGGGCTA1200TTCGAGCTGGCAGGCAGTATTCCGTGTATGACATGTGGACACATACGTATGAAGGGGTGG1260CAGTCTGGTAAGTCGACTGATCACACAGCTTCTGAGTCTGAATACGATATCGGAGAGGGT1320GACATTGATGCCGTGATCGCTCAGGAACCTAACATTCTCGCTGCCTCCACACGGCGTCCG1380CGCACTCTTACTGAACGACGCGGGTCCACAACCTGCAAATCTGGATGGCACATGCGCCTT 1440CTACTATCAA TGTTCGGTAT GA 1462
本發(fā)明通過EST表達序列標(biāo)簽和Tail-PCR的方法分離克隆了這一 α -半乳糖苷酶基因AgalB，DNA全序列分析結(jié)果表明，α -半乳糖苷酶AgalB結(jié)構(gòu)基因AgalB全長1462bp，含有3個內(nèi)含子，+400 +448bp、+495 M9bp、+1269 l!345bp為其內(nèi)含子序列，cDNA 長 U81bp，其 cDNA 序列如 SEQ ID NO. 5 所示。ATGGCGATAC TTTTTGCTTG CTTTGCGACG CTTGTGGGCC ACTCGATCGCCTTGAACAAT 60GGCGTGGGCA AAGTCCCTCC AATGGGCTAC GACACATTCA ATGCGTACGGTTGCGATTAC 120AATGCTAGCA GTGTTCTCGC GCAAGGCGAG GCAATGAAAC GAACAGGCCTAGTTGACGCC 180GGTTATAACA TTTTCATTTT AGACGATTGT TATGCCTTGA AGGAGCGTAATGCTACCGGC 240TACATGGTTG CTGATCCAAA GAAATTTCCG AATGGTATTC CGGCTCTATCTAAGCAAATG 300AATGATCTCG GAATTAGCCT TGCTGCGTAT GGTGACAATG GTTATTATACATGCGCCGGC 360TATCCAGGCT CTTATGGCCA TGAGATGAAG GACTTGGAGA CCTGGCATTCTTGGGGCATG 420TCTTACCTGA AGTATGACAA CTGCTATATA CCGGCCGACA ACATTACTCAAGAGMCATG 480TTCGGTCGGT ACACTCGCAT GTCGGACGCA ATCGCGGCCT TTGCGGCCAAGATTCATCGA 540CCGCCGTTCA TCTTCTACCT TTGCGAATGG GGCTGGCAGCAACCTTGGATCTGGGGTCGC600CGGATTTCCCAAGGTTGGCGTATTGATGGTGACATCAAGCCATATTGGAGCGCGATCGCC660TCTATTATTGATCAGGCGTCATTCCAGTACTGGGCTTCCGACTTCTACGGACGCAATGAC720ATGGACATCCTCGAGGTTGGAAACACCGGACAAGGCACTCCGCCGGGGAACCTAACGTAC780GAAGAATCTAAGACTCATTTCACAGCCTGGGCGTTGATGAAAAGTCCACTGATCATCGGC840ACTGATCTTACGAACGCAACGCAGGAGACGATCGACATCCTCGGCAACCGAGACTTGATC900AAAATCAATCAGGACCCTCATGTTGGTGAGTCGATTTCCCCTTTTCGATGGGGAGTTAAT960CCAGACTATGTCTCTAATCCGGACCATCCCGCCGAGTACTGGTCGGGCAACTCTAGCTAC1020GGAGTAGTGTTTATGATTATTAATAGCCAAAACACCGAGCAAACCATGTTCTTCAATTTG1080ACGGAGAGTTGGGCTATTCGAGCTGGCAGGCAGTATTCCGTGTATGACATGTGGACACAT1140ACGTATGAAGGGGTGGCAGTCTGGAACCTAACATTCTCGCTGCCTCCACACGGCGTCCGC1200GCACTCTTACTGAACGACGCGGGTCCACAACCTGCAAATC
TGGATGGCACATGCGCCTTC 1260TACTATCAAT GTTCGGTATG A 1281
其中，信號肽的堿基序列為ATGGCGATACTTTTTGCTTG CTTTGCGACGCTTGTGGGCC ACTCGATCGC C(SEQ ID NO. 4)。
成熟蛋白理論分子量為46. 8kDa，該酶屬于糖基水解酶第27家族。將α -半乳糖苷酶基因AgalB cDNA序列及推導(dǎo)出的氨基酸序列在GenBank中進行BLAST比對發(fā)現(xiàn)，該基因與來源于Postiaplacenta Mad-698-R的假使蛋白有最高的核苷酸一致性為M%，與 Laccaria bicolor S238N-H82來源的屬于27家族的糖苷水解酶蛋白的核苷酸序列一致性為47. 1%，與Penicillium simplicissimum驗證活性α -半乳糖苷酶核苷酸序列一致性為 36%，氨基酸序列一致性為35%。說明AgalB是一種新的α -半乳糖苷酶。
本發(fā)明還提供了包含上述α-半乳糖苷酶基因AgalB的重組載體，優(yōu)選為 pPIC9-AgalB。
本發(fā)明還提供了包含上述α -半乳糖苷酶基因AgalB的重組菌株，優(yōu)選所述宿主細(xì)胞為畢赤酵母細(xì)胞、啤酒酵母細(xì)胞或多型遜酵母細(xì)胞，優(yōu)選將重組酵母表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化畢赤酵母細(xì)胞(Pichic pastoris)GS115，得到優(yōu)選重組菌株GS115/AgalB。
本發(fā)明還提供了一種制備嗜酸α -半乳糖苷酶的方法，包括以下步驟
1)用權(quán)利要求
重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得重組菌株；
2)培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)重組α -半乳糖苷酶的表達；以及
3)回收并純化所表達的α -半乳糖苷酶AgalB。
本發(fā)明還提供了上述嗜酸α -半乳糖苷酶的應(yīng)用。
本發(fā)明提供了一個新的α -半乳糖苷酶基因，其編碼的α -半乳糖苷酶具嗜酸性， 作用PH范圍廣，較好的耐熱性，較強的蛋白酶抗性和較好的水解各種底物的能力，可應(yīng)用于飼料、食品、醫(yī)藥等工業(yè)。根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案就可以實現(xiàn)利用基因工程手段生產(chǎn)具半乳甘露聚糖降解能力的嗜酸α-半乳糖苷酶。


圖1顯示在畢赤酵母中表達的α -半乳糖苷酶AgalB的SDS-PAGE分析，1 純化的重組α -半乳糖苷酶AgalB ；2 脫糖基化AgalB ；3 低分子量Marker。
圖2顯示本發(fā)明重組α-半乳糖苷酶的最適pH值。[0032]圖3顯示本發(fā)明α -半乳糖苷酶的ρΗ穩(wěn)定性。
圖4顯示本發(fā)明α -半乳糖苷酶最適反應(yīng)溫度。
圖5顯示本發(fā)明α -半乳糖苷酶熱穩(wěn)定性。
圖6顯示α -半乳糖苷酶對蛋白酶抗性分析。
具體實施方式
試驗材料和試劑
1、菌株及載體=Bispora sp. MEY-I由本實驗室分離獲得，在公開號為 CN101457207的專利申請文獻中公開，其保藏號為CGMCC 2500，于2008年5月19日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所，100101)，畢赤酵母表達載體pPIC9及菌株GSl 15購自于hvitrogen公司。
2、酶類及其它生化試劑內(nèi)切酶購自TaKaRa公司，連接酶購自Ivitrogen公司。對硝基苯-α -D-吡喃半乳糖苷，蜜二糖、棉子糖，水蘇糖，角豆膠和瓜爾豆膠均購自Sigma公司，其它都為國產(chǎn)試劑(均可從普通生化試劑公司購買得到)。
3、培養(yǎng)基
(I)Bispora sp. MEY-I培養(yǎng)基為馬鈴薯汁培養(yǎng)基1000mL馬鈴薯汁，IOg葡萄糖， 25g 瓊脂，pH2. 5。
(2)大腸桿菌培養(yǎng)基LB (1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、NaCl，pH7.0)。
(3) BMGY 培養(yǎng)基1 %酵母提取物，2 % 蛋白胨，1. 34% YNB, 0. 00004% Biotin, 1 % 甘油(V/V)。
(4)BMMY培養(yǎng)基除以0. 5%甲醇代替甘油，其余成份均與BMGY相同，pH4. 0。
說明以下實施例中未作具體說明的分子生物學(xué)實驗方法，均參照《分子克隆實驗指南》(第三版)J-薩姆布魯克一書中所列的具體方法進行，或者按照試劑盒和產(chǎn)品說明書進行。
實施例1嗜酸真菌Bispora sp. MEY-I α -半乳糖苷酶編碼基因AgalB的克隆
提取嗜酸真菌Bispora sp. MEY-I基因組DNA
將液體培養(yǎng)3天的菌絲體用無菌濾紙過濾放入研缽中，加入2mL提取液，研磨 5min，然后將研磨液置于50mL離心管中，65°C水浴鍋裂解20min，每隔IOmin混勻一次，在 4°C下IOOOOrpm離心5min。取上清于酚/氯仿中抽提除去雜蛋白，再取上清加入等體積異丙醇，于室溫靜置5min后，4°C下IOOOOrpm離心lOmin。棄上清，沉淀用70%的乙醇洗滌兩次，真空干燥，加入適量TE溶解，置于-20°C備用。
通過cDNA文庫的構(gòu)建和EST測序及Blast比對，得到編碼α -半乳糖苷酶3’端的部分核苷酸序列，根據(jù)測序得到的核甘酸序列設(shè)計TAIL-PCR引物USpl、USp2、USp3 (見表 1)。以Bispora sp. MEY-I基因組DNA為模板，通過TAIL-PCR得到已知基因序列的5，端側(cè)翼序列，將擴增產(chǎn)物回收后送上海生工測序。測序正確的片斷經(jīng)拼接后獲得全長基因。
表1.半乳糖苷酶基因克隆TAIL-PCR特異性引物
7
權(quán)利要求
1.一種具半乳甘露聚糖降解能力的嗜酸α-半乳糖苷酶AgalB，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的α-半乳糖苷酶AgalB，其特征在于，所述α_半乳糖苷酶 AgalB的信號肽序列如SEQ ID NO. 2所示。
3.一種具半乳甘露聚糖降解能力的嗜酸α-半乳糖苷酶AgalB，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示。
4.一種嗜酸α-半乳糖苷酶基因，其特征在于，編碼權(quán)利要求
1或3所述的α-半乳糖苷酶。
5.如權(quán)利要求
4所述的α-半乳糖苷酶基因，其特征在于，其堿基序列如SEQIDN0. 4 所示。
6.如權(quán)利要求
5所述的α-半乳糖苷酶基因，其特征在于，所述α-半乳糖苷酶基因編碼信號肽的核苷酸如SEQ ID NO. 5所示。
7.如權(quán)利要求
4所述的α-半乳糖苷酶基因，其特征在于，其堿基序列如SEQIDN0. 6 所示。
8.包含權(quán)利要求
4所述α-半乳糖苷酶基因的重組載體。
9.包含權(quán)利要求
4所述α-半乳糖苷酶基因的重組菌株。
10.權(quán)利要求
1或3所述的嗜酸α-半乳糖苷酶用于降解半乳甘露聚糖的應(yīng)用。
專利摘要
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種具半乳甘露聚糖降解能力的嗜酸α-半乳糖苷酶AgalB及其基因和應(yīng)用。根據(jù)本發(fā)明的α-半乳糖苷酶AgalB，其具有如SEQ ID NO.1或3所示的氨基酸序列，編碼上述α-半乳糖苷酶有如SEQ IDNO.4或6所示的核苷酸序列。本發(fā)明提供了一個新的α-半乳糖苷酶基因，其編碼的α-半乳糖苷酶具嗜酸性，作用pH范圍廣，較好的耐熱性，較強的蛋白酶抗性和較好的水解各種底物的能力，可應(yīng)用于飼料、食品、醫(yī)藥等工業(yè)。根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案就可以實現(xiàn)利用基因工程手段生產(chǎn)具半乳甘露聚糖降解能力的嗜酸α-半乳糖苷酶。
文檔編號C12R1/645GKCN101818135 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請?zhí)朇N 201010100294
公開日2011年12月28日 申請日期2010年1月22日
發(fā)明者姚斌, 孟昆, 楊培龍, 柏映國, 王亞茹, 王慧, 石鵬君, 羅會穎, 袁鐵錚, 黃火清 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (2), 非專利引用 (1),