專利名稱:一種生物拆分l-薄荷醇反應(yīng)中提高底物濃度的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種生物拆分L-薄荷醇反應(yīng)中提高底物濃度的方法，屬于生物法拆分外消 旋化合物技術(shù)領(lǐng)域：
。
技術(shù)背景
薄荷醇是目前最有工業(yè)價(jià)值的手性化合物之一，分別在醫(yī)藥、食品、化妝 品和手性試劑制備等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。開展薄荷醇的拆分方法的研究極有意義。
天然薄荷醇受天氣、地域等影響，產(chǎn)量和質(zhì)量波動(dòng)較大，合成薄荷醇則可 以解決以上問(wèn)題。近年來(lái)，生物學(xué)拆分方法已成為手性拆分的主流趨勢(shì)。
目前本研究室已經(jīng)從華根霉(i /^c;p^ c/n'"m^) CCTCC M201021，米根霉 wy加e) AS 3.41，近平滑假絲酵母CICC 1676，洋蔥布克氏菌 (5wrA:/ oAien'a cepa",a)ATCC 25416， 熒光假單胞菌(尸sew(iomowas /7womscmy)AS 1.823、熒光假單胞菌(Psewcfowowas/Jworescews)AS 1.55中篩選出能夠不對(duì)稱拆分 DL-乙酸薄荷酯的菌種，但其存在較強(qiáng)的產(chǎn)物抑制作用，使得轉(zhuǎn)化的底物濃度過(guò) 低，15g/L干菌體濃度，單批次轉(zhuǎn)化底物濃度最高為1%。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種生物拆分L-薄荷醇反應(yīng)中提高底物濃度的方法， 能夠提高單批次轉(zhuǎn)化底物濃度，提高產(chǎn)物L(fēng)-薄荷醇的產(chǎn)率。
本發(fā)明的技術(shù)方案 一種生物拆分L-薄荷醇反應(yīng)屮提高底物濃度的方法， 其特征是在不對(duì)稱拆分底物DL-乙酸薄荷酯反應(yīng)體系中，轉(zhuǎn)化菌株在華根霉 (J /n!zopw c/n'"era/" CCTCC M201021 (公開號(hào)CN1443841A已報(bào)道，2003年9 月24日公開)，米根霉(i /n'zqpwsoo^ae)AS3.41,近平滑假絲酵母CICC 1676， 洋蔥布克氏菌(Bwr狄o/^r/"cepw》)ATCC 25416，熒光假單胞菌(尸化w^W2朋ay / Morcscera)AS 1.823、或熒光假單胞菌(尸seMctomowas^/Jworesce"s)AS 1.55中獲得， 添加樹脂HZ-801、 HZ-816、 D誦315、 D-202、 D-406、 HD-81、 NKA-II、 DA-201 之一種，底物質(zhì)量濃度5%-6%，樹脂添加量為底物DL-乙酸薄荷酯等質(zhì)量，體 系pH 5.0-8.0，控制溫度25~35°C，樹脂在反應(yīng)開始2~4h后加入，搖床反應(yīng) 12~48h，轉(zhuǎn)化率達(dá)45% 48%， L-薄荷醇的光學(xué)純度為92%ee 100%ee。
本發(fā)明從篩選樹脂出發(fā)，篩選出能以一定速率吸附和釋放產(chǎn)物，降低產(chǎn)物 對(duì)反應(yīng)的抑制作用，提高菌種單批次轉(zhuǎn)化效率的樹脂。在此基礎(chǔ)上，對(duì)該樹脂 的添加量、添加時(shí)間，轉(zhuǎn)化反應(yīng)時(shí)間等條件進(jìn)行優(yōu)化。
主要試劑DL-乙酸薄荷酯，L-薄荷醇，D-薄荷醇， DL-薄荷醇購(gòu)于美國(guó)Sigma-Aldrich公司
DA-201江蘇蘇青污水處理有限公司
NKA-II、 D-406天津海光化工有限公司
HD-81、 HZ-801、 HZ-816、 D國(guó)315、 D-202華東理工大學(xué)上海華震科技有限公司
DL-薄荷醇和DL-乙酸薄荷酯分析方法的確定
L-薄荷醇、D-薄荷醇、L-乙酸薄荷酯、D-乙酸薄荷酯標(biāo)樣在P-DEX-120色 譜柱(購(gòu)于美國(guó)Supelco公司)上，通過(guò)帶有FID檢測(cè)器的手性氣相色譜(Varian 3900)進(jìn)行分析。L-乙酸薄荷酯的保留時(shí)間為19.6min， D-乙酸薄荷酯的保留時(shí) 間為20.6min， D-薄荷醇的保留時(shí)間為20.8min， L-薄荷醇的保留時(shí)間為21.1min。 確定具體色譜條件手性柱卩-DEX-120 (25mx0.25mmx0.25 (im);分流比 1 : 100;進(jìn)樣口溫度25(TC;檢測(cè)器溫度30(TC;載氣H2;載氣流量2.5mL/min; 柱升溫度程序?yàn)?0'C保持4min， 2'C/min升溫至120°C,保持lmin。在該條件 下L-薄荷醇、D-薄荷醇、L-乙酸薄荷酯、D-乙酸薄荷酯均可以達(dá)到基線分離。 產(chǎn)物的光學(xué)純度通過(guò)對(duì)映過(guò)量值(％ee)來(lái)評(píng)價(jià)。 反應(yīng)后產(chǎn)物eep值 ％eep=[(SL—SD)/(SL+SD)] X 100%
反應(yīng)后底物eej直 ％ees=[(SD — SL')/(SL'+SD')] X 100%
反應(yīng)轉(zhuǎn)化率 轉(zhuǎn)化率(％) = [(ees +ee。)/( ees + eep)] X 100%
SL:反應(yīng)后L-薄荷醇的峰面積；SD:反應(yīng)后D-薄荷醇的峰面積；
SL':反應(yīng)后L-乙酸薄荷酯的峰面積；SD':反應(yīng)后D-乙酸薄荷醇的峰面積；
eeo:反應(yīng)起始時(shí)底物ee值。
一、 樹脂的確定經(jīng)過(guò)從各公司購(gòu)買的樹脂進(jìn)行篩選，從解決減少產(chǎn)物抑
制作用來(lái)提高底物濃度角度和保證轉(zhuǎn)化效果兩個(gè)方面考慮，選擇添加樹脂后，
轉(zhuǎn)化底物濃度大于5%，光學(xué)純度為92。/。ee 98。/。ee。，轉(zhuǎn)化率45% 48%。
二、 樹脂條件和底物濃度的優(yōu)化分別考察了樹脂添加量、添加時(shí)間，菌 體添加量，反應(yīng)時(shí)間，底物濃度的影響。最終確定轉(zhuǎn)化條件底物質(zhì)量濃度
5%-6%，控制溫度25 35"C，反應(yīng)2 4h后添加樹脂，樹脂添加量與底物質(zhì)量相 同，轉(zhuǎn)化時(shí)間12~48h。優(yōu)化后生物不對(duì)稱拆分產(chǎn)物L(fēng)-薄荷醇的光學(xué)純度為 95%ee~100%ee。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明通過(guò)添加樹脂提高了底物的濃度。在轉(zhuǎn)化過(guò)程 中加入一定量的樹脂，能夠明顯減少產(chǎn)物薄荷醇對(duì)反應(yīng)的抑制作用，從而提高 了單批次轉(zhuǎn)化的底物濃度。通過(guò)條件優(yōu)化，將轉(zhuǎn)化的底物濃度從1%提高到6%，
提高了6倍。
本發(fā)明有助于進(jìn)一步了解減少產(chǎn)物抑制的方法，對(duì)今后轉(zhuǎn)化過(guò)程中通過(guò)減 少產(chǎn)物抑制來(lái)提高底物濃度提供了參考價(jià)值。并為生物法手性化合物生產(chǎn)實(shí)現(xiàn)規(guī)?；峁┝怂悸?。
具體實(shí)施方式
為了更好的理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明的內(nèi)容，但本 發(fā)明的內(nèi)容不僅僅局限于下面的實(shí)施例。 實(shí)施例1
在5mL、 50mmol/L的Na2HP04-KH2P04緩沖液中(pH7.0)，加入0.8g華根 霉(/ /^c;pz^c/2/"m^) CCTCCM201021轉(zhuǎn)化菌體細(xì)胞和0.25g DL-乙酸薄荷酉旨， 于3(TC的恒溫?fù)u床上振蕩反應(yīng)，211后添加0.25§樹脂112-816，整個(gè)過(guò)程24h， 反應(yīng)后，混合物離心，取上清用乙酸乙酯萃取產(chǎn)物和底物，手性氣相色譜分析 產(chǎn)物，產(chǎn)物L(fēng)-薄荷醇光學(xué)純度98% ee，轉(zhuǎn)化率46.7%。
實(shí)施例2
在5mL、 50mmol/L的Na2HP04-KH2P04緩沖液中(pH6.0)，加入0.8g近平 滑假絲酵母CICC 1676轉(zhuǎn)化菌體細(xì)胞和0.3gDL-乙酸薄荷酯，于30'C的恒溫?fù)u 床上振蕩反應(yīng)，2h后添加0.3g樹脂D-202,整個(gè)過(guò)程24h，反應(yīng)后，混合物離 心，取上清用乙酸乙酯萃取產(chǎn)物和底物，手性氣相色譜分析產(chǎn)物，產(chǎn)物L(fēng)-薄荷 醇光學(xué)純度97.3。/。ee，轉(zhuǎn)化率46.3%。
對(duì)照實(shí)施例
不添加樹脂，其他操作同實(shí)施例1，底物濃度最高為1%。若底物濃度為6%， 產(chǎn)物L(fēng)-薄荷醇光學(xué)純度為92.1% ee，轉(zhuǎn)化率為33.1%。
權(quán)利要求
1、一種生物拆分L-薄荷醇反應(yīng)中提高底物濃度的方法，其特征是在不對(duì)稱拆分底物DL-乙酸薄荷酯反應(yīng)體系中，轉(zhuǎn)化菌株在華根霉(Rhizopus chinensis)CCTCC M201021，米根霉(Rhizopus oryzae)AS 3.41，近平滑假絲酵母CICC1676，洋蔥布克氏菌(Burkholderia cepacia)ATCC 25416，熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)AS 1.823、或熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)AS 1.55中獲得，底物質(zhì)量濃度5％-6％，添加樹脂HZ-801、HZ-816、D-315、D-202、D-406、HD-81、NKA-II、DA-201之一種，樹脂添加量為底物DL-乙酸薄荷酯等質(zhì)量，體系pH5.0～8.0，控制溫度25～35℃，樹脂在反應(yīng)開始2～4h后加入，搖床反應(yīng)12～48h，轉(zhuǎn)化率達(dá)45％～48％，L-薄荷醇的光學(xué)純度為92％ee～100％ee。
專利摘要
一種生物拆分L-薄荷醇反應(yīng)中提高底物濃度的方法，屬于生物法拆分外消旋化合物技術(shù)領(lǐng)域：
。本發(fā)明為在不對(duì)稱拆分DL-乙酸薄荷酯反應(yīng)體系中，控制體系pH值在5.0～8.0，轉(zhuǎn)化菌株在華根霉(Rhizopus chinensis)CCTCC M201021，米根霉(Rhizopus oryzae)AS 3.41，近平滑假絲酵母CICC 1676，洋蔥布克氏菌(Burkholderia cepacia)ATCC 25416，熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)AS1.823、或熒光假單胞菌(Pseudomonas.fluorescens)AS 1.55中獲得，添加樹脂HZ-801、HZ-816、D-315、D-202、HD-81、NKA-II、D-406、DA-201之一種，提高單批次轉(zhuǎn)化底物DL-乙酸薄荷酯的濃度達(dá)6倍。
文檔編號(hào)C12R1/72GKCN101545002SQ200910026722
公開日2009年9月30日 申請(qǐng)日期2009年4月28日
發(fā)明者喻曉蔚, 巖 徐, 鴻 顧 申請(qǐng)人:江南大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan