專利名稱:防治植物真菌病害的多粘類芽孢桿菌及其生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物 農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域：
。 技術(shù)背景
根據(jù)味精生產(chǎn)過(guò)程中廢水所含污染物情況可分成三類一是高濃度高酸度有機(jī) 廢水即離交尾液；二是其它中高濃度有機(jī)廢水；三是不需處理直接外排的冷卻降溫水。 離交尾液是通過(guò)離子交換法提取谷氨酸后剩余的“廢液”，它既含有豐富的有機(jī)質(zhì)，還 含有N、P、K等少量無(wú)機(jī)鹽及其它微量元素，這些物質(zhì)都可為微生物生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)。 其它中高濃度有機(jī)廢水包括淀粉廢水、制糖廢水、發(fā)酵洗灌廢水、精制廢水等。淀粉 廢水和制糖廢水除了含有一定的有機(jī)污染物質(zhì)外，還有一些懸浮物質(zhì)；發(fā)酵洗灌廢水與 離交尾液所含成分基本相同，只是含量較低；精制廢水有時(shí)呈酸性，有時(shí)呈堿性，有機(jī) 物污染物質(zhì)含量較高，這些有機(jī)廢水也是微生物資源開發(fā)比較理想的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源之一。但 是，這些廢水如果得不到合理利用，不僅會(huì)對(duì)環(huán)境造成嚴(yán)重污染，而且使資源白白浪費(fèi) 掉。
文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)味精廢水造成較大環(huán)境污染，如中國(guó)環(huán)境生態(tài)網(wǎng)上指出2005年全國(guó) 味精生產(chǎn)廠家230余家，年排放廢水17萬(wàn)噸，絕大多數(shù)未經(jīng)治理盲接排放(http://WWW. eedu.org.cn/Article/es/envir/ptheorv/water/200511/6456.html)。中國(guó)專禾Ij (公開號(hào)CN 1916155A)中公開了一種利用味精廢水制備發(fā)酵培養(yǎng)基及生產(chǎn)生物農(nóng)藥灰色鏈霉菌的方 法，目前，眾多味精廢水處理技術(shù)大致分為兩步，一是提取廢水中的谷氨酸菌體單細(xì)胞 蛋白，通過(guò)此步分離菌體，約可除去30%左右的COD，常用物化方法進(jìn)行處理(如絮 凝、離心等方法)；二是提取菌體后廢液的處理，使其達(dá)到排放標(biāo)準(zhǔn)或處理后用于工廠 回用，這也是眾多味精廢水處理技術(shù)所面臨的關(guān)鍵問(wèn)題，常采用生物處理方法(如厭氧 發(fā)酵、生物膜法，SBR法等)。
多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)在自然界中分布廣泛，是一種重要的
生防菌，對(duì)多種植物真菌、細(xì)菌病害均有較好的防治作用。王智文等報(bào)道了一株多粘 類芽孢桿菌Cp-S316菌株對(duì)動(dòng)植物真菌、細(xì)菌病原物具有廣譜抗性，利用大孔吸附樹脂 對(duì)多粘類孢桿菌Cp-S316產(chǎn)生的抗真菌活性物質(zhì)的吸附、解吸性能，篩選出其最佳解吸 齊U，該活性物質(zhì)對(duì)熱、紫外線穩(wěn)定，對(duì)胰蛋白酶、蛋白酶K有一定的耐受性，對(duì)氯仿部 分敏感，對(duì)酸穩(wěn)定，對(duì)堿敏感(王智文，袁士濤，何亮等，多粘類芽孢桿菌Cp-S316抗真 菌活性物質(zhì)的提取及其部分性質(zhì)研究，農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2007，26(4) 1464-1468)。 中國(guó)專利(授權(quán)公告號(hào)CN 1169942C)中報(bào)導(dǎo)培養(yǎng)的Paenibacillus polymyxa HY96-2及 其發(fā)酵上清液可以用來(lái)防止植物細(xì)菌性青枯病，而且還可用來(lái)防治植物苗期立枯病，猝 倒病，以及黃瓜枯萎病，番茄枯萎病，茄子枯萎病，大豆根腐病，并且對(duì)植物具有十分 明顯的促進(jìn)生長(zhǎng)作用。中國(guó)專利(授權(quán)公告號(hào)CN 1186441C)中公開了 Paenibacillus polymyxa可以作為微生物肥料菌劑中的一種成分分解秸稈，有效解決農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中一方面 農(nóng)業(yè)垃圾過(guò)多，污染水體和環(huán)境，處理困難，另一方面化肥，農(nóng)藥使用過(guò)多，土壤惡化的矛盾。中國(guó)專利(授權(quán)公告號(hào)CN 1325635C)中公開了 Paenibacillus polymyxa Jaas cd
可以在較低的濃度下進(jìn)入植物體內(nèi)，并能在植物體內(nèi)定植，繁殖和傳導(dǎo)；對(duì)植物同時(shí)具 有促進(jìn)生長(zhǎng)，提高產(chǎn)量，防病抗病的作用，特別是對(duì)土傳維管束病害具有良好的防治效
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多粘類芽孢桿菌生防劑的生產(chǎn)方法有多種，如；中國(guó)專利(公開號(hào)CN 1844360A)中公開了一種多粘類芽孢桿菌的生產(chǎn)方法，其培養(yǎng)基為豆渣。中國(guó)專利(授 權(quán)公告號(hào)CN1186441C)中使用庖肉培養(yǎng)基作為多粘類芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基。以味精廢 水為培養(yǎng)基生產(chǎn)多粘類芽孢桿菌生防劑的方法未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種能夠在植物葉際與根際定植，并且對(duì)多種病原菌具有 拮抗作用的生防菌——多粘類芽孢桿菌EBL-06菌株，同時(shí)提供一種利用味精廢水生產(chǎn)該 生防菌劑的方法。
本發(fā)明所提供的生防菌株是由我們實(shí)驗(yàn)室從小麥的葉面上分離篩選出來(lái)的。將 其編號(hào)為EBL-06，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏日期為 二零零八年二月二十六日，分類命名為多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)。保藏 編號(hào)為CGMCC No.2377。該菌株具有下列性質(zhì)
1菌落形態(tài)特征
該菌株在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，單個(gè)菌落呈半玻璃珠狀，邊緣整齊，表面粘 稠，與培養(yǎng)基結(jié)合緊密，菌落中心乳黃色。
2菌體形態(tài)特征
菌體桿狀，革蘭氏染色顯陽(yáng)性，芽孢端生，包囊膨大。
3碳源利用能力
可以利用碳源α-環(huán)式糊精；肝糖；D-葡糖胺酸；衣康酸；D-半乳糖酸 Y-內(nèi)酯；D-半乳糖醛酸；2-羥基苯甲酸；4-羥基苯甲酸；L-精氨酸；L-天門冬酰 胺；L-絲氨酸；甘氨酰-L-谷氨酸；D-木糖；D-甘露醇；苯乙胺。
不可利用碳源丙酮酸甲酯；D-纖維二糖；β-甲基-D-葡萄糖苷；i_赤蘚糖 醇；N-乙酰-D葡萄糖氨；D，L-Ci-磷酸甘油；α-丁酮酸；Y -羥丁酸；L-苯丙氨 酸；L-蘇氨酸；腐胺。
4對(duì)真菌拮抗能力
菌株在PDA固體培養(yǎng)基上表現(xiàn)出對(duì)灰葡萄孢霉、黃瓜黑星病的病原菌原菌、木 霉菌等的高效拮抗效果。
516SrDNA 基因序列
用27f與1492r為引物進(jìn)行擴(kuò)增出的該菌株的16SrDNA基因的部分序列，測(cè)序結(jié) 果遞交到 GenBank，登錄號(hào)為 EF545556。在 http://www.ncbi.nlm.nih gov/ 網(wǎng)站上用 blast
程序與已登陸細(xì)菌菌株的16SrDNA基因序列進(jìn)行比較，結(jié)果表明與多粘類芽孢桿菌的相 似性最高，達(dá)到99%以上。
本發(fā)明所述的多粘類芽孢桿菌生防劑的生產(chǎn)方法如下
1、味精廢水預(yù)處理味精廢水pH較低約3.0，先用水稀釋5-15倍，用碳酸鈣或氫氧化鈉將pH調(diào)至5-7，高壓滅菌。
2、液體種子制備向高壓滅菌的土豆液體培養(yǎng)基中，接種多粘類芽孢桿菌，于 25-35°C, 200r/min培養(yǎng)，得到液體種子。
4、液態(tài)發(fā)酵向經(jīng)過(guò)預(yù)處理的廢水中接種5% (體積)的液體種子，于 25-35°C,通無(wú)菌空氣培養(yǎng)24-72小時(shí)。
5、后處理培養(yǎng)好的發(fā)酵液經(jīng)細(xì)菌計(jì)數(shù)后，調(diào)節(jié)至IO8-IOiciceIlAnl,包裝使用。
具體實(shí)施方式
由本發(fā)明技術(shù)方案生產(chǎn)的多粘類芽孢桿菌生防劑能夠高效防治多種真菌類植物 病害，而且無(wú)公害，生產(chǎn)成本低，并且有效地利用了味精廢水。以下通過(guò)具體實(shí)施例詳 細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施，目的在于幫助讀者更好地理解本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)，但不作為對(duì)本 發(fā)明實(shí)施范圍的限定。
實(shí)施例1 多粘類芽孢桿菌生物農(nóng)藥制備
種子培養(yǎng)基制備稱取200g 土豆，切碎，于IL自來(lái)水中煮沸30分鐘，過(guò)濾除 去殘?jiān)尤?0g葡萄糖，定容至1L，即得土豆培養(yǎng)基。分裝入5個(gè)IL的三角瓶中， 121°C 滅菌 20min。
發(fā)酵培養(yǎng)基制備經(jīng)過(guò)絮凝除去細(xì)菌蛋白的味精廢水IL加入9L自來(lái)水稀釋， 并用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至6.0。
液體種子制備向土豆液體培養(yǎng)基中接種多粘類芽孢桿菌，于30°C，搖瓶200r/ min,恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)24小時(shí)，得到液體種子。
發(fā)酵產(chǎn)品將上述發(fā)酵培養(yǎng)基裝罐到IOL的發(fā)酵罐中，121°C滅菌15min，按照 5%的接種量接種液體種子，在30°C恒溫，通無(wú)菌空氣的條件下，發(fā)酵2至3天，取樣計(jì) 數(shù)后，無(wú)菌條件下分裝。
實(shí)施例2 對(duì)多種病原真菌的拮抗作用
菌株在PDA固體培養(yǎng)基平板中心處接種直徑為Icm的病原真菌，在距離病原真 菌菌落邊緣2cm處接種(點(diǎn)接)活化好的多粘類芽孢桿菌，第6天觀察抑菌圈大小，發(fā)現(xiàn) 對(duì)病原真菌灰葡萄孢霉(Botrytis cinerea)、黃瓜黑星病的病原菌(Cladosporium sp.)和木霉 (Trichoderma sp.)等都具有顯著的拮抗作用。
實(shí)施例3 對(duì)黃瓜黑星病防治效果
溫室盆缽中的黃瓜苗長(zhǎng) 至四片真葉時(shí)，用107ml多粘類芽孢桿菌菌液噴霧處理 葉片一次，間隔1天后接種黑星病原菌，再間隔1天后噴施107ml多粘類芽孢桿菌菌液 一次，以清水代替多粘類芽孢桿菌菌液噴霧的黃瓜苗為對(duì)照，連續(xù)調(diào)查黃瓜苗的病情， 發(fā)現(xiàn)多粘類芽孢桿菌處理對(duì)黃瓜黑星病有明顯的防治效果。
權(quán)利要求
1.一株具有防治植物病害作用的多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)，其特征在 于該多粘類芽孢桿菌保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編 號(hào)CGMCC No.2377。
2.權(quán)利要求
1所述的多粘類芽孢桿菌，其特征在于該菌株在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良 好，單個(gè)菌落呈半玻璃珠狀，邊緣整齊，表面粘稠，與培養(yǎng)基結(jié)合緊密，菌落中心乳黃 色，菌體桿狀，革蘭氏染色顯陽(yáng)性，芽孢端生，包囊膨大；該菌株的16SrDNA基因的部 分序列已遞交到GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，登錄號(hào)為EF545556。
3.用權(quán)利要求
1所述多粘類芽孢桿菌來(lái)制備抗植物病害生防劑的生產(chǎn)方法，其特征在 于在主要成分為味精廢水的培養(yǎng)基中接種權(quán)利要求
1所述的多粘類芽孢桿菌。
4.權(quán)利要求
3所述的生產(chǎn)方法，其特征在于將味精廢水用水稀釋5-15倍，調(diào)節(jié)pH 為5-7，高壓滅菌，接種權(quán)利要求
1所述的多粘類芽孢桿菌，于25-35°C，通無(wú)菌空氣培 養(yǎng)24-72小時(shí)。
專利摘要
本發(fā)明涉及一株防治植物真菌病害的多粘類芽孢桿菌及其生產(chǎn)方法，屬于生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域：
。本發(fā)明采用的菌株是多粘類芽孢桿菌EBL-O6菌株，分離自小麥葉面，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)CGMCC No.2377。該菌株可以防治植物多種真菌病害，提高作物產(chǎn)量。本發(fā)明利用味精廢水來(lái)發(fā)酵多粘類芽孢桿菌，制備生防菌劑，該工藝生產(chǎn)的多粘類芽孢桿菌生防劑能有效防治多種植物真菌病害，并且生產(chǎn)成本低廉，操作簡(jiǎn)單，還可以有效利用味精廢水，減少環(huán)境污染。
文檔編號(hào)C02F3/34GKCN101519639 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請(qǐng)?zhí)朇N 200810100963
公開日2011年4月13日 申請(qǐng)日期2008年2月27日
發(fā)明者莊國(guó)強(qiáng), 張建云, 張洪勛, 王微, 白志輝, 谷立坤 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (2), 非專利引用 (2),