專利名稱：致病桿菌抗菌肽及其在抑制病原真菌和細菌生長中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種含有不多于20個氨基酸的肽段。
背景技術(shù)：
抗菌肽是一類具有抗菌活性的多肽類物質(zhì)，其分子量通常在幾百到一萬道爾頓之間，氨基酸個數(shù)從幾個到幾十個不等。因為其具有性質(zhì)穩(wěn)定、廣譜抗菌、且不易產(chǎn)生耐受菌株等諸多優(yōu)點而備受青睞。另有報道，抗菌肽是先天免疫反應(yīng)中進化比較保守的一種產(chǎn)物， 幾乎所有生物都存在抗菌肽。申請人從昆蟲病原線蟲共生菌中挖掘新結(jié)構(gòu)的抗菌肽，不僅可以提供寶貴的抗菌資源，而且為共生菌的開發(fā)利用開辟了新的途徑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種能抑制病原真菌和細菌生長的致病桿菌 (Xenorhabdus budapestensis NMC-10)抗菌肽及其應(yīng)用。一種致病桿菌抗菌肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示。本發(fā)明還涉及致病桿菌抗菌肽在抑制病原真菌生長中的應(yīng)用。本發(fā)明致病桿菌抗菌肽在抑制病原真菌生長中的應(yīng)用，其中所述病原真菌為辣椒疫霉菌、大麗輪枝菌、禾谷鐮刀菌和/或灰葡萄孢菌。本發(fā)明還涉及致病桿菌抗菌肽在抑制細菌生長中的應(yīng)用。本發(fā)明致病桿菌抗菌肽在抑制細菌生長中的應(yīng)用，其中所述細菌為枯草芽孢桿菌、番茄瘡痂病菌、青枯菌、普通變形桿菌和/或巨大芽孢桿菌。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)不同之處在于提供一種致病桿菌抗菌肽，1.0 μ g/ml的該抗菌肽用于抑制病原真菌生長時，對辣椒疫霉菌、大麗輪枝菌、禾谷鐮刀菌和灰葡萄孢菌的抑制率分別為60. 01%、74. 00%,49. 21%,60. 71% ； 1.0 μ g/ml的該抗菌肽用于抑制細菌生長時，對枯草芽孢桿菌、番茄瘡痂病菌、青枯菌、普通變形桿菌和巨大芽孢桿菌分別能形成 19. 04士0. 2mm、16. 47士0. 35mm、10. 75士0. 41mm、10. 3士0. 33mm、7. 3士0. 28mm 的抑菌圈。下面結(jié)合附圖對本發(fā)明致病桿菌抗菌肽及其在抑制病原真菌和細菌生長中的應(yīng)用作進一步說明。


圖1是通過不同飽和度的硫酸銨沉淀所獲得沉淀物的抑菌活性；圖2是NMC-10粗提物進行離子交換層析的層析圖，其中“Q穿”表示穿透峰、El表示第一洗脫峰、E2表示第二洗脫峰；圖3A是離子交換層析收集的各組分對辣椒疫霉菌的抑制作用；其中“總”表示 NMClO粗提物，“穿”表示穿透峰組分，El表示第一洗脫峰組分、E2表示第二洗脫峰組分；圖3B是離子交換層析收集的各組分對枯草芽孢桿菌的抑制作用；其中“總”表示 NMClO粗提物，“穿”表示穿透峰組分，El表示第一洗脫峰組分、E2表示第二洗脫峰組分；
圖4是離子交換層析收集的各組分進行Tricine-SDS-PAGE的電泳圖；其中“稀釋總”表示稀釋過的NMClO粗提物，"Q穿”表示穿透峰組分，El表示第一洗脫峰組分、E2表示第二洗脫峰組分；圖5是穿透峰組分進行反相層析的圖譜；圖中5-10代表反相層析中收集管的編號；圖6是反相層析中收集的各組分對辣椒疫霉菌的抑制作用；圖中1-10代表反相層析中收集管的編號；圖7是將活性最強的收集管5-8中的組分分別稀釋2、8、64倍后測定其對辣椒疫霉菌的抑制作用，圖中5A、5B、5C分別表示收集管5中的組分稀釋2、8、64倍，圖中6A、6B、6C 分別表示收集管6中的組分稀釋2、8、64倍，圖中7A、7B、7C分別表示收集管7中的組分稀釋2、8、64倍，圖中8A、8B、8C分別表示收集管8中的組分稀釋2、8、64倍；圖8是收集管8中的組分再次進行反相層析的圖譜，2C2-12，2D9_12都表示收集管的編號 ；圖9A是再次進行反相層析時收集的各組分進行Tricine-SDS-PAGE的電泳圖， 2C2-3和2C4都表示收集管編號；圖9B是再次進行反相層析時收集的各組分對辣椒疫霉菌的抑制作用；圖10是2C2-3繼續(xù)進行反相層析分離純化時獲得的一個組分質(zhì)譜圖。
具體實施例方式實施例1致病桿菌培養(yǎng)及發(fā)酵代謝液制備采用NBTA培養(yǎng)基(營養(yǎng)瓊脂45g，氯化三苯基四氮唑0. 04g,溴百里酚藍0. 025g 溶于蒸餾水1000ml，調(diào)節(jié)pH至7. 2)對致病桿菌NMClO菌株進行型態(tài)鑒定，挑取藍色I型單菌落(I型菌是能吸收培養(yǎng)基中的染料，菌落呈現(xiàn)藍色；II型菌是不能吸收培養(yǎng)基中的染料，菌落成紅色)在TSB培養(yǎng)基(胰蛋白胨1.5g，大豆蛋白胨0. 5g，氯化鈉0. 5g，用IOOml 蒸餾水配制而成，調(diào)節(jié)PH為7. 2士0. 2)中進行搖瓶震蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為28°C、ISOrpm培養(yǎng)48h。5000rpm離心去除菌體細胞，上清液用于抗菌肽分離。實施例2抗菌代謝物的提取(1)硫酸銨沉淀對所得上清液進行硫酸銨沉淀，使硫酸銨分別達到不同的飽和度，4°C過夜， 12000rpm離心收集沉淀。用適當(dāng)體積20mMTris緩沖液(pH7. 4)對沉淀物進行重懸，再利用透析袋脫鹽，先使用蒸餾水、后使用20mMTriS緩沖液進行透析，每隔4h更換一次溶液，透析 48小時。透析袋選取截留分子量在8000D-12000D之間，透析的前期由于濃度差較大需要較頻繁地更換緩沖液，并且使用干燥劑聚乙二醇(PEG20000)去除樣品中過量的水分使透析能更加充分，循環(huán)往復(fù)直至透析完成。將透析處理后的提取物用直徑為0. 22 μ m的濾膜過濾進，所得到的澄清液體即為NMC-10粗提物。以枯草芽孢桿菌為指示菌、用瓊脂擴散抑菌圈試驗檢測不同飽和度硫酸銨沉淀物的抑菌活性，研究結(jié)果證明，硫酸銨飽和度為85%左右時，沉淀的蛋白(指一次性加入硫酸銨使飽和度為85%時，沉淀得到的所有蛋白)抑菌活性較高(見圖1)。其中本發(fā)明中的瓊脂擴散抑菌圈法的步驟為在NA斜面(蛋白胨10g、氯化鈉5.0g、牛肉浸出粉3g、瓊脂12g、自來水1000ml)上培養(yǎng)指示菌，溫度為28°C，待出現(xiàn)菌苔后用0. 85%的生理鹽水將菌苔洗下并重懸制成菌懸液，在紫外分光光度計下調(diào)節(jié)菌懸液0D600 = 0.33，然后按照(體積百分?jǐn)?shù))的比例添加到抗生素鑒定培養(yǎng)基(蛋白胨5g、氯化鈉3. 5g、葡萄糖lg、牛肉浸出粉1. 5g、磷酸氫二鉀 3. 68g、酵母浸出粉3g、磷酸二氫鉀1. 32g、水1000ml)上，在平板上均勻打若干個孔，每孔加入20 μ 1待測樣品，28°C培養(yǎng)一天觀察抑菌圈大小。對照平板只在孔中加入等量的無菌水。(2)離子交換層析分離用離子交換層析分離NMC-10粗提物，層析柱為MONO Q，每次上樣5ml，平衡液為 20mM的Tris-HCl，洗脫液為20mM的Tris-HCl與IM NaCl，流速lml/min。梯度洗脫，有一個組分未掛在離子交換柱上，將該組分稱為穿透峰，0%-45%這個梯度出現(xiàn)了第一洗脫峰， 45% -100%出現(xiàn)了第二洗脫峰(45%和100%指的是IM的NaCl在洗脫液中所占的體積百分比)，收集穿透峰和兩個洗脫峰，分別記為Q穿和E1、E2 (見圖2)，通過瓊脂擴散抑菌圈試驗分別測定所得各組分對辣椒疫霉菌和枯草芽孢桿菌的抑制活性(分別見圖3A和圖3B)。分析層析圖并比較層析分離效果與抑菌活性的相關(guān)程度，各個組分的積分面積與峰高見表1。表1陰離子交換層析參數(shù)
峰面積(mAU*ml)‘峰面積比(％)峰高(mAU)
Number Areas of peakRate of Areas ofHeigh og Peak
peak 6494.09481 431812.234
24392.988910.444301.265
36297.724014.964208.368
4960.81452.28490.178由圖3 (A)和圖3 (B)可以看出，Q穿和El對枯草芽孢桿菌和辣椒疫霉菌均有抑制活性，其中以Q穿為主，且對兩種指示菌的抑制作用具有很強的相關(guān)性(就是說對枯草芽孢桿菌抑制作用好的組份對辣椒疫霉抑制作用也好)。如圖4所示，第一洗脫峰El的蛋白電泳顯示有三個主要條帶，表觀分子量分別在20kD、IOkD和3kD左右。但是三個條帶的切膠回收組分不再具有之前的抑菌活性。這可能是由于單個蛋白條帶不是抑菌活性成分，也可能是起作用的組分并非蛋白組分。值得注意的是總蛋白和穿透峰兩個主要活性組分的蛋白條帶都有嚴(yán)重的拖尾現(xiàn)象，并且經(jīng)過100倍的稀釋仍然無法去除，這極有可能是因為樣品中具有某些復(fù)雜結(jié)構(gòu)的組分。從表1可以看出，離子柱的穿透峰面積占總面積的15.43%， 根據(jù)抑菌圈大小分析，穿透峰的抑菌活性占到總活性的70%以上，因此極有可能活性組分主要在穿透峰中，因此下一步選擇收集穿透峰組分進一步分離純化。(3)反相層析純化反相層析常見于小分子多肽的分離，將穿透峰組分用甲醇或乙腈溶解仍然具有較強的抑菌活性，并且單獨的甲醇和乙腈溶劑對枯草芽孢桿菌和辣椒疫霉菌都沒有抑制作用，因此下一步分離策略采用將步驟(2)得到的穿透峰組分冷凍干燥后再用有機溶劑重溶，為反相層析準(zhǔn)備樣品。反相層析的具體條件如下柱子采用Zorbax SB-C18柱，直徑 4. 6mm、柱長250mm、粒徑5 μ m，進樣體積為lOOOul，平衡緩沖液為20mM甘氨酸-鹽酸，洗脫緩沖液為100%乙腈。多次重復(fù)上樣并根據(jù)峰寬收集組分，反相層析圖譜見圖5。通過瓊脂擴散抑菌圈試驗，測定反相層析中不同收集管中的組分對辣椒疫霉菌的抑制作用，檢測活性前將樣品冷凍干燥后并用無菌水重溶，主要活性組分的抑菌測定結(jié)果見圖6。從圖6中可以看出，活性主要集中在收集管5-8的樣品中，為了進一步比較各組分間活性強弱，將收集管5-8中的樣品分別稀釋2倍、8倍和64倍重新通過瓊脂擴散抑菌圈試驗測定活性，稀釋2倍、8倍和64倍的樣品分別記為A、B、C。從圖6和圖7可以看出，收集管8中的組分為主要活性組分，將8號樣品重新進行反相層析，層析具體條件同前，層析結(jié)果見圖8。收集合并收集管8中的樣品再次進行反相層析，通過瓊脂擴散抑菌圈實驗測定所得各個組分對辣椒疫霉菌的抑制作用(見圖9A)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，收集管中的樣品從2C2-3 —直到2C12-2D9均具有明顯的抑菌活性。對各個樣品進行Tricine-SDS-PAGE (見圖9B)，發(fā)現(xiàn)樣品2C2-3和2C4的蛋白條帶較為單一，且所有具有活性的樣品均含有一條表觀分子量在 3kD左右的條帶，選定這兩個樣品作為主要活性組分進行重復(fù)收集，為下一步精細分離準(zhǔn)備樣品。(4)進一步分離與鑒定將上一步收集的樣品2C2-3和2C4重新進行反相層析，反相層析條件同前，在這兩個組分中都檢測到一個高純度的組分(見圖10)，可以用于生物質(zhì)譜鑒定。對上述純化的樣品用MALDI-T0F-T0F進行質(zhì)譜鑒定，用De novo手動拼接的方法獲得一個組分的氨基酸序列，即一條含有19個氨基酸組成的肽段，對應(yīng)的分子量為 1657. 8444Da，氨基酸序列如下GPVGLLSSPGSLPPVGGAP，將其命名為GP-19，如氨基酸序列表中的SEQID NO 1所示。將其氨基酸序列到NCBI全庫和抗菌肽數(shù)據(jù)庫APD進行BLAST序列分析，未發(fā)現(xiàn)相同序列。同源性最高僅為40. 9%，數(shù)據(jù)庫的比對結(jié)果見表2。表2 GP-19的序列比對結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種致病桿菌抗菌肽，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示。
2.權(quán)利要求1所述的致病桿菌抗菌肽在抑制病原真菌生長中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的致病桿菌抗菌肽在抑制病原真菌生長中的應(yīng)用，其特征在于所述病原真菌為辣椒疫霉菌、大麗輪枝菌、禾谷鐮刀菌和/或灰葡萄孢菌。
4.權(quán)利要求1所述的致病桿菌抗菌肽在抑制細菌生長中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的致病桿菌抗菌肽在抑制細菌生長中的應(yīng)用，其特征在于所述細菌為枯草芽孢桿菌、番茄瘡痂病菌、青枯菌、普通變形桿菌和/或巨大芽孢桿菌。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種含有不多于20個氨基酸的肽段和其應(yīng)用，目的是為了提供一種能抑制病原真菌和細菌生長的致病桿菌抗菌肽，1.0μg/ml抗菌肽用于抑制病原真菌生長時，對辣椒疫霉菌、大麗輪枝菌、禾谷鐮刀菌和灰葡萄孢菌的抑制率分別為60.01％、74.00％、49.21％、60.71％；1.0μg/ml抗菌肽用于抑制細菌生長時，對枯草芽孢桿菌、番茄瘡痂病菌、青枯菌、普通變形桿菌和巨大芽孢桿菌分別形成19.04±0.2mm、16.47±0.35mm、10.75±0.41mm、10.3±0.33mm、7.3±0.28mm的抑菌圈。本發(fā)明致病桿菌抗菌肽，其氨基酸序列為GPVGLLSSPGSLPPVGGAP。
文檔編號A01N43/36GK102351949SQ20111032825
公開日2012年2月15日 申請日期2011年10月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月25日
發(fā)明者劉崢, 曾洪梅, 楊秀芬, 肖堯, 袁京京, 邱德文, 郭立華 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所