專利名稱:志賀氏菌檢測用引物、檢測方法、檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基于環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(loop-mediated isothermalamplification,LAMP)技術(shù)的食源性病原體快速檢測技術(shù)。特別涉及對志賀氏 菌特定基因片段具有特異性的引物及引物組；還涉及將所述引物及引物組用環(huán)介導(dǎo)等溫擴 增法檢測志賀氏菌的檢測方法和檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
食源性疾病發(fā)病率較高，由沙門氏菌，志賀氏菌，金黃色葡萄球菌，變形桿菌，霍亂 弧菌，副溶血性弧菌以及E. coli 0157:H7，輪狀病毒以及諾如病毒引起的食物中毒，其發(fā)病 率在我國食源性疾病發(fā)病率中占非常高的比例，是一個嚴重的公共衛(wèi)生問題。
目前對食源性病原體的檢測主要依靠病原體分離法、免疫學方法和各種PCR方 法。病原體分離雖然是金標準，但繁瑣費時，一般需要5天時間，最長需要一個月時間，而且 免疫學方法的特異性和敏感性均較低。
隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展，人們采用PCR技術(shù)應(yīng)用于細菌的診斷。例如PCR中 國專利公開號CN1526825的專利申請，批露了一種利用副溶血性弧菌Η 72Η序列的特異性， 通過DNA提取、PCR擴增、電泳觀察等分子生物學手段檢測副溶血性弧菌的方法。雖然該方 法敏感、準確、快速，但由于需要昂貴的儀器設(shè)備、較高檢測費用以及對檢測人員較高的技 術(shù)要求而使其不適用于現(xiàn)場快速檢測及基層普及應(yīng)用。
環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(loop-mediatedisothermal amplification,LAMP)技術(shù)(國際 專利公開號WO 00/28082)是2000年Notomi等開發(fā)出一種核酸擴增新技術(shù)，即針對靶基因 的6個區(qū)域設(shè)計4條特異引物(如有需要還可以添加有環(huán)引物對)，利用一種鏈置換DNA聚 合酶(Bst DNA polymerase)在65°C左右恒溫條件保溫約60分鐘，即可完成核酸擴增反應(yīng)， 擴增結(jié)果可直接對擴增副產(chǎn)物焦磷酸鎂沉淀通過肉眼進行判斷或者對其濁度進行檢測，也 可用結(jié)合雙鏈DNA的熒光染料SYBR Green I染色，通過肉眼進行判定。用于LAMP技術(shù)擴 增的2對引物乃針對基因6個區(qū)段，因而具有比PCR更高的特異性，同時也具備不需要熱循 環(huán)、其單位時間內(nèi)擴增效率更高、且不需特殊儀器等優(yōu)點。但是目前未有利用環(huán)介導(dǎo)等溫擴 增法檢測志賀氏菌的檢測方法和檢測試劑盒。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的在于，提供一種對志賀氏菌特定基因片段具有特異性的引物。
上述目的是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的
一種志賀氏菌檢測用引物，其特征在于，能擴增靶基因的特異堿基序列，所 述靶基因為志賀氏菌的ipaH-—GenBank登陸號M32063，所述引物與所述靶基因的 1095-—1299bp位的核酸序列的一部分或其互補鏈互補。
本發(fā)明的另一個目的在于，提供一種對志賀氏菌特定基因片段具有特異性的引物組。[0010]上述目的是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的
一種志賀氏菌檢測用引物組，其特征在于，所述引物組由下列引物組成
正向外引物F3-ipa ATACCGTCTCTGCACGCA
反向外引物B3-ipa TCGAAAAGGCCTTCTGATGC
正向內(nèi)引物FIP-ipa GCGAAAGACTGCTGTCGAAGCTTTCCGTGAACAGGTCGCT
反向內(nèi)引物BIP-ipa TGCCACTGAGAGCTGTGAGGACTGATGGACCAGGAGGGTT
可以擴增志賀氏菌的ipaH(M32063)基因序列的1095-—1299bp位的核酸序列的 一部分或其互補鏈。
特別地，為了加快擴增反應(yīng)速度，所述引物組還可以包括
正向環(huán)引物LF-ipa GGCACTGAGTTTTTCCAGCCAT
反向環(huán)引物LB-ipa CGCTCACATGGAACAATCTCCGG
本發(fā)明的另一個目的在于，提供一種利用上述引物或引物組基于環(huán)介導(dǎo)等溫擴增 法檢測志賀氏菌的檢測方法。
上述目的是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的
一種志賀氏菌的檢測方法，該方法用于檢測標本中是否存在志賀氏菌，其特征在 于，以志賀氏菌的ipaH(M32063)基因序列的1095—1299bp位的核酸序列的一部分或其互 補鏈為靶，通過LAMP法用上述引物或引物組選擇性擴增上述靶區(qū)域，確認是否存在有擴增產(chǎn)物。
具體檢測方法為
1)樣品處理和模板提取，樣品范圍適用于食品樣品、糞便、嘔吐物等標本；細菌待 檢標本用相應(yīng)腸道增菌液增菌培養(yǎng)8-12小時后，取1. Oml增菌液IOOOOrpm離心2分鐘，棄 其上清液后，用DNA提取試劑盒提取模板DNA或加20 30ul三蒸水煮沸5分鐘，再取2ul 上清液做待檢模板DNA;2)志賀氏菌的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(LAMP)
取擴增反應(yīng)液，先加待檢模板，再加酶，最后加雙蒸水，形成如下總體積為20ul IOOul的反應(yīng)體系，混勻點離后在約65°C條件下恒溫保溫約40-90分鐘，然后置于80°C的 環(huán)境下2分鐘滅活酶。
反應(yīng)體系為(反應(yīng)總體積20ul IOOul)
權(quán)利要求
一種志賀氏菌檢測用引物組，其特征在于，所述引物組由下列引物組成正向外引物F3 ipa ATACCGTCTCTGCACGCA反向外引物B3 ipa TCGAAAAGGCCTTCTGATGC正向內(nèi)引物FIP ipa GCGAAAGACTGCTGTCGAAGCTTTCCGTGAACAGGTCGCT反向內(nèi)引物BIP ipa TGCCACTGAGAGCTGTGAGGACTGATGGACCAGGAGGGTT可以擴增志賀氏菌的ipaH基因 GenBank登陸號M32063，1095 1299bp位的特異性核酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的志賀氏菌檢測用引物組，其特征在于，所述引物組還包括正向環(huán)引物 LF-ipa GGCACTGAGTTTTTCCAGCCAT反向環(huán)引物 LB-ipa CGCTCACATGGAACAATCTCCGG。
3.—種志賀氏菌的檢測方法，該方法用于檢測食品樣品中是否存在志賀氏菌，其特征 在于，以志賀氏菌的ipaH基因序列的1095—1299bp位的核酸序列的一部分或其互補鏈為 靶，通過LAMP方法用權(quán)利要求
1或2所述引物組選擇性擴增所述靶基因，確認是否存在有 擴增產(chǎn)物。
4.根據(jù)權(quán)利要求
3所述的志賀氏菌檢測方法，其特征在于，具體檢測方法為1)樣品處理和模板提取，樣品范圍適用于食品樣品標本；細菌待檢標本用相應(yīng)腸道增 菌液增菌培養(yǎng)8-12小時后，取1. Oml增菌液IOOOOrpm離心2分鐘，棄其上清液后，用DNA 提取試劑盒提取模板DNA或加20 30 μ 1三蒸水煮沸5分鐘，再取2 μ 1上清液做待檢模 板 DNA ；2)志賀氏菌的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增取擴增反應(yīng)液，先加待檢模板，再加酶，最后加雙蒸水，形成如下總體積為20 μ 1 100 μ 1的反應(yīng)體系，混勻點離后在約65°C條件下恒溫保溫約40-90分鐘，然后置于80°C的 環(huán)境下2分鐘滅活酶；反應(yīng)總體積20 μ 1 100 μ 1的反應(yīng)體系為
5.根據(jù)權(quán)利要求
4所述的志賀氏菌檢測方法，其特征在于，所述擴增反應(yīng)液還包括 正向環(huán)引物LF-ipa 0. 6-1. 0 μ M反向環(huán)引物 LB-ipa 0. 6-1. 0 μ Μ。
6.根據(jù)權(quán)利要求
5所述的志賀氏菌檢測方法，其特征在于，當反應(yīng)總體積為25μ 1時， 所述反應(yīng)體系具體為
7. —種志賀氏菌檢測用試劑盒，其特征在于，所述試劑盒至少包括含有權(quán)利要求
1或2 所述引物組的擴增反應(yīng)液、酶；所述擴增反應(yīng)液中包括如下試劑
8.根據(jù)權(quán)利要求
7所述的一種志賀氏菌檢測用試劑盒，其特征在于，所述擴增反應(yīng)液 還包括正向環(huán)引物LF-ipa 0. 6-1. 0 μ M反向環(huán)引物 LB-ipa 0.6-1.0 μ Μ。
9.根據(jù)權(quán)利要求
8所述的一種志賀氏菌檢測用試劑盒，其特征在于，擴增反應(yīng)液包含 1/10預(yù)定反應(yīng)體積IOXBst DNA Polymerase Buffer反應(yīng)緩沖液、3· 6福硫酸鎂、1. 6 μ M正 向內(nèi)引物FIP-ipa、l. 6 μ M反向內(nèi)引物BIP_ipa、0. 2 μ M的正向外引物F3-ipa、0. 2 μ M的反 向外引物B3-ipa.0.8uM正向環(huán)引物LF-opa、0.8uM反向環(huán)引物LB-ipa.I. 4mM dNTP禾口 IM 甜菜堿；所述酶為每微升含8個活性單位，0. 32U/ μ 1的Bst DNA酶。
10.根據(jù)權(quán)利要求
8所述的志賀氏菌檢測用試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括陰 性及陽性對照模板，所述陰性對照模板為雙蒸水；所述陽性對照模板為1 100mM志賀氏菌 基因組DNA。
專利摘要
本發(fā)明涉及一種基于環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(loop-mediated isothermalamplification，LAMP)技術(shù)的食源性病原體快速檢測技術(shù)。一種志賀氏菌檢測用引物，能擴增靶基因的特異堿基序列，所述靶基因為志賀氏菌的ipaH---GenBank登陸號M32063，所述引物與所述靶基因的1095---1299bp位的核酸序列的一部分或其互補鏈互補。本發(fā)明通過提供一種對志賀氏菌特定基因片段具有特異性的引物組，及其用包含有上述引物組的試劑盒檢測標本中是否存在志賀氏菌特定基因片段，進而確定標本中是否存在志賀氏菌。
文檔編號C12Q1/04GKCN101153326 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請?zhí)朇N 200710030435
公開日2011年3月23日 申請日期2007年9月21日
發(fā)明者張麗榮, 張彩虹, 譚愛軍, 魏泉德 申請人:珠海市疾病預(yù)防控制中心導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (1), 非專利引用 (3),