專利名稱:谷氨酰胺酶,谷氨酰胺酶基因,新的重組dna及生產(chǎn)谷氨酰胺酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及谷氨酰胺酶，谷氨酰胺酶基因，新的重組DNA，和生產(chǎn)谷氨酰胺酶的方法在使用日本酒曲麥芽的醬油制造業(yè)和調(diào)味品制造業(yè)中，為了通過(guò)遺傳工程技術(shù)改進(jìn)谷氨酰胺酶及提高酶的產(chǎn)量，從日本酒曲麥芽中獲得酶是重要的。
采用這種方式能容易地改進(jìn)水解蛋白產(chǎn)物(如醬油)的質(zhì)量并可降低價(jià)格。
經(jīng)過(guò)多方面的研究和分析，本發(fā)明成功地分離出了源于醬油曲霉(Aspergillussojae)的一種谷氨酰胺酶，并確定了它的結(jié)構(gòu)，完成了本發(fā)明。
即，第一項(xiàng)發(fā)明是根據(jù)如下(a)或(b)的一種谷氨酰胺酶(a)一種含有如SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的蛋白；(b)一種含有相對(duì)于氨基酸序列(a)進(jìn)行缺失、取代或增加一個(gè)或多個(gè)氨基酸的氨基酸序列，該蛋白具有谷氨酰胺酶活性。第二項(xiàng)發(fā)明是編碼根據(jù)如下(a)或(b)的蛋白的谷氨酰胺酶基因(a)一種含有如SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的蛋白；(b)一種含有相對(duì)于氨基酸序列(a)進(jìn)行缺失、取代或增加一個(gè)或多個(gè)氨基酸的蛋白，該蛋白具有谷氨酰胺酶活性。
第三項(xiàng)發(fā)明是含有根據(jù)如下列(a)或(b)DNA的谷氨酰胺酶基因(a)一種含有SEQ ID NO1所示的堿基序列的DNA；(b)一種在嚴(yán)格條件下能與含有(a)所示的堿基序列的DNA雜交的DNA，該DNA編碼具有谷氨酰胺酶活性的蛋白。
第四項(xiàng)發(fā)明是一種新的重組DNA，其特征在于上述谷氨酰胺酶基因插入載體DNA。
第五項(xiàng)發(fā)明是一種含有上述重組DNA的轉(zhuǎn)化體或轉(zhuǎn)導(dǎo)體。
第六項(xiàng)發(fā)明是制備谷氨酰胺酶的方法，包括在培養(yǎng)基上培養(yǎng)上述轉(zhuǎn)化體或轉(zhuǎn)導(dǎo)體，從培養(yǎng)產(chǎn)物中收集谷氨酰胺酶。
可通過(guò)將源于曲霉屬的絲狀真菌的染色體DNA或cDNA的天然存在的谷氨酰胺酶基因進(jìn)行克隆，然后將克隆引入適宜的載體-宿主系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)而獲得蛋白(a)。
如(b)中所表明，該蛋白可以包含相對(duì)于氨基酸序列(a)進(jìn)行缺失、取代或增加一個(gè)或多個(gè)氨基酸的氨基酸序列，只要該氨基酸序列具有谷氨酰胺酶活性。在本發(fā)明中，“多個(gè)”通常意味著2至300，優(yōu)選2-170，更優(yōu)選2-50，最優(yōu)選為2-10，這些取決于谷氨酰胺酶蛋白的三維結(jié)構(gòu)中氨基酸殘基的位置或氨基酸的種類。
這種突變的谷氨酰胺酶，即蛋白(b)的獲得，可以通過(guò)在天然存在的谷氨酰胺酶基因的堿基序列中導(dǎo)入一種突變來(lái)產(chǎn)生出突變的谷氨酰胺酶基因，這種突變包括取代、缺失、插入、增加或倒置，然后將該突變基因?qū)胍粋€(gè)適宜的載體-宿主系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)。
將突變導(dǎo)入基因的方法包括，例如位點(diǎn)特異性誘變，PCR方法引入的隨機(jī)突變，和其中基因被選擇性剪切并在去掉或增加選擇的核苷酸后被重新連接的方法。
依據(jù)本發(fā)明的谷氨酰胺酶基因是含有編碼蛋白(a)或(b)DNA的基因。依據(jù)本發(fā)明的谷氨酰胺酶基因可以是一種在嚴(yán)格條件下能與編碼蛋白(a)或(b)的DNA雜交的基因，并且該DNA編碼的蛋白具有谷氨酰胺酶活性。在本發(fā)明中，“嚴(yán)格條件”指這樣的條件，其中鈉離子濃度在50-300mM，優(yōu)選150mM，同時(shí)溫度在42-68℃，優(yōu)選65℃。
含有編碼蛋白(a)的DNA的基因的例子是含有SEQ ID NO1所示堿基序列的DNA。該DNA是一種天然存在的谷氨酰胺酶基因。
這種天然存在的谷氨酰胺酶基因能通過(guò)將源于曲霉屬中的絲狀真菌的染色體DNA或cDNA的天然存在的谷氨酰胺酶基因進(jìn)行克隆獲得?；蚩寺〉姆椒òǎ?，其中一種在純化谷氨酰胺酶并確定部分的氨基酸序列后合成適合的探針DNA，然后用該探針DNA來(lái)篩選醬油曲霉染色體DNA。另一種方法包括基于部分的氨基酸序列設(shè)計(jì)適宜的引物DNA，接著通過(guò)適合的如5’-RACE或3’-RACE法等聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增出含有上述基因片段的DNA，這些片段連接起來(lái)從而產(chǎn)生含有全長(zhǎng)基因的DNA。
具體地，天然存在的谷氨酰胺酶基因可以按照以下方法獲得。首先，培養(yǎng)醬油曲霉FERM BP-6820，將所得到的細(xì)菌體在液氮中冷凍，接著用研缽之類將之機(jī)械研磨或擠碎獲得細(xì)粉狀的細(xì)菌體片段，用常規(guī)方法從中提取總RNA部分。在提取的過(guò)程中，可以使用商業(yè)上可獲得的RNA抽提試劑盒。
可以選擇地，可以從經(jīng)乙醇沉淀的RNA的抽提液中收集RNA，然后用常規(guī)手段將帶有多聚A鏈的RNA分餾出來(lái)，在分餾的過(guò)程中，可以使用商業(yè)上可使用的寡dT柱。
參照SEQ ID NO2中的DNA序列合成PCR引物，利用引物DNA和由上述方法得到的RNA，通過(guò)一種適宜的RT-PCR反應(yīng)如5’-RACE法和3’-RACE法擴(kuò)增出含有基因片段的DNA，將這些片段連接就可以獲得含有全長(zhǎng)基因的DNA。在使用5’-RACE法和3’-RACE法合成部分cDNA的過(guò)程中，可以使用商業(yè)上可獲得的試劑盒。
將上述cDNA作為模板，用合成的與5’-端和3’-端序列互補(bǔ)的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)從而擴(kuò)增出DNA，可以根據(jù)傳統(tǒng)的方法克隆擴(kuò)增的DNA。
將擴(kuò)增出的DNA插入適宜的載體獲得重組DNA?？寺】梢允褂蒙虡I(yè)上可獲得的試劑盒如TA克隆試劑盒(Invitrogen Corporation)，商業(yè)上可獲得的質(zhì)粒載體DNAs如pUC 119(Takara Shuzo Co.，Ltd.)，pBR322(Takara Shuzo Co.，Ltd.)和pBluescript SK+(Stratagene)，和商業(yè)上可獲得的噬菌體載體DNA如λEMBL3(Stratagene)，或其它。
通過(guò)將所得到的重組DNA轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)入大腸桿菌K-12可獲得轉(zhuǎn)化體或轉(zhuǎn)導(dǎo)體，優(yōu)選如大腸桿菌JM 109(Takara Shuzo Co.，Ltd.)或XL-Blue(Stratagene)。轉(zhuǎn)化可以使用如D.M.Morrison的方法(酶學(xué)方法，68，326-331，1979)。另一方面，轉(zhuǎn)導(dǎo)可以使用如B.Hohn的方法(酶學(xué)方法，68，299-309，1979)。作為宿主細(xì)胞，除了大腸桿菌，可用其它微生物如細(xì)菌、酵母、絲狀真菌和放線菌類和以及動(dòng)物細(xì)胞。
可以對(duì)擴(kuò)增DNA的全部堿基序列(見SEQ ID NO1)進(jìn)行分析，例如其中可以使用Li-COR MODEL 4200L測(cè)序儀(購(gòu)自ALOKA CO.，LTD.)、370DNA測(cè)序儀(PerkinElmer Inc.)或CEQ2000XL DNA分析系統(tǒng)(Beck man Coulter)。通過(guò)比較堿基序列和部分氨基酸序列的信息，可以確定是否獲得了天然存在的谷氨酰胺酶基因。
通過(guò)分析天然存在的谷氨酰胺酶基因，可以確定所翻譯的多肽即蛋白(a)的氨基酸序列。2.制備谷氨酰胺酶的方法在制備本發(fā)明的谷氨酰胺酶時(shí)，首先生產(chǎn)含有谷氨酰胺酶基因的重組DNA，然后生產(chǎn)和培養(yǎng)含有該重組DNA的轉(zhuǎn)化體或轉(zhuǎn)導(dǎo)體，從培養(yǎng)產(chǎn)物中可以收集谷氨酰胺酶。
為了利用本發(fā)明的谷氨酰胺酶基因制備具有谷氨酰胺酶活性的蛋白，必須選擇一個(gè)適宜的載體-宿主系統(tǒng)。這樣的系統(tǒng)，這里可能提及的是，如pST14系統(tǒng)(Unkles等，1989，Mol.Gen.Genet.，218，99-104)和絲狀真菌(醬油曲霉，米曲霉，構(gòu)巢曲霉，黑色曲霉，產(chǎn)黃青霉等)，酵母表達(dá)載體pYES2(Invitrogen)和啤酒糖酵母系統(tǒng)，和一種大腸桿菌表達(dá)載體pTE(Stratagene)與大腸桿菌系統(tǒng)。優(yōu)選地使用一種絲狀真菌或酵母系統(tǒng)，其中蛋白中出現(xiàn)了添加的糖鏈。
重組DNA可以通過(guò)將谷氨酰胺酶基因插入一個(gè)適宜載體獲得，作為載體，可以使用商業(yè)上可得到的產(chǎn)品，如酵母表達(dá)載體pYES2、pYD1(Invitrogen)，pUR123(Takara Shuzo Co.，Ltd.)，pYEX-BX，pYEX-S1，pYEX-4T(CLONTECH)，大腸桿菌表達(dá)載體如pSET(Invitrogen)，和pTE(Stratagene)等。
然后將重組DNA轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)宿主細(xì)胞?？梢允褂萌鏐ecker DM.等的方法(酶學(xué)方法，194，182-187，1991)轉(zhuǎn)導(dǎo)酵母。宿主細(xì)胞除了大腸桿菌和酵母外，還可以使用其它的微生物，如其它細(xì)菌、絲狀真菌、放線菌或動(dòng)物細(xì)胞。
這樣就可以獲得一種具有生產(chǎn)谷氨酰胺酶能力的轉(zhuǎn)化體或轉(zhuǎn)導(dǎo)體，雖然這種轉(zhuǎn)化體或轉(zhuǎn)導(dǎo)體可以通過(guò)常規(guī)固體培養(yǎng)方法進(jìn)行培養(yǎng)，但優(yōu)選盡可能采用液體培養(yǎng)方法。
當(dāng)用酵母作宿主時(shí)，可以使用普通富養(yǎng)培養(yǎng)基如YPD培養(yǎng)基和YM培養(yǎng)基。當(dāng)考慮宿主的遺傳特性而使用選擇性培養(yǎng)基時(shí)，可以使用作為極限培養(yǎng)基的SD培養(yǎng)基。當(dāng)使用選擇性培養(yǎng)基時(shí)，由于選擇壓力依賴于所用的宿主-載體系統(tǒng)而不同，除了選擇壓力還要根據(jù)宿主遺傳需要向極限培養(yǎng)基中加入氨基酸或核酸。
另外，可以根據(jù)需要向培養(yǎng)基中加入無(wú)機(jī)鹽、糖類物質(zhì)、維生素等。培養(yǎng)基的初始PH值適當(dāng)調(diào)至大約PH6-9?？梢酝ㄟ^(guò)使用的載體控制蛋白的表達(dá)。當(dāng)使用這樣的載體時(shí)，可以加入適合于載體的誘導(dǎo)物如半乳糖或銅離子來(lái)誘導(dǎo)谷氨酰胺酶。
當(dāng)培養(yǎng)酵母時(shí)，優(yōu)選采用以下的方法，通氣攪拌深層培養(yǎng)，振蕩培養(yǎng)和靜止培養(yǎng)等等，培養(yǎng)溫度在25℃-30℃，優(yōu)選30℃左右，培養(yǎng)時(shí)間為24-48個(gè)小時(shí)。
可以使用部分改進(jìn)的日本專利申請(qǐng)公開(Kokai)號(hào)11-332553中描述的方法對(duì)表達(dá)的谷氨酰胺酶進(jìn)行純化。
就酵母的情況而言，在采用上述適合的方法培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的酵母后，離心培養(yǎng)液以獲得酵母菌體，在酵母菌體中加入一種細(xì)胞壁裂解酶使細(xì)胞壁充分裂解后離心取上清液。接著在上清液中加入硫酸銨進(jìn)行鹽析，并進(jìn)一步離心該上清液，去掉不能溶解的蛋白后獲得含有谷氨酰胺酶的粗酶溶液。
使用苯基瓊脂糖柱、DEAE瓊脂糖柱、凝膠過(guò)濾柱和HPLC從粗酶溶液中純化出谷氨酰胺酶活性部分，從而獲得純化的谷氨酰胺酶。
本發(fā)明的遺傳工程方法可以根據(jù)下列文獻(xiàn)的描述實(shí)施，“分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)第二版”(1989)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，ISBN 0-8769-309-6，“現(xiàn)代分子生物學(xué)方法”(1989)，John Wiley & Sons，Inc.，ISBN 0-471-50338-X，等。(實(shí)施例)通過(guò)后面的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述。實(shí)施例1谷氨酰胺酶cDNA的獲得(1)從曲霉屬細(xì)菌提取谷氨酰胺酶同源基因?qū)Ρ２赜讵?dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物寄托中心的日本酒曲霉菌EST文庫(kù)進(jìn)行篩選，以尋找與已知來(lái)源于隱球菌的谷氨酰胺酶基因(日本專利申請(qǐng)公開號(hào)2000-270371)高度同源的基因，結(jié)果得到一個(gè)含有711個(gè)堿基的EST克隆Contig Mix0010110003775_1。推測(cè)該克隆為谷氨酰胺酶基因的一個(gè)片段，并克隆了該基因的cDNA。從醬油曲霉中提取總RNA將醬油曲霉FERM BP-6820的孢子接種入50ml的大豆粉培養(yǎng)基(30％大豆粉，1％KH2PO4，pH 6.0)，使其密度達(dá)到3×105/ml，孢子放入150ml Erlenmeyer燒瓶中在30℃以150r.p.m振蕩培養(yǎng)48小時(shí)。
用Miracloth(Calbiochem)過(guò)濾得到的混合培養(yǎng)液收集菌體。用滅菌水漂洗收集的菌體后，將菌體放入液氮冷凍，然后在研缽里將菌體機(jī)械研磨，從而獲得細(xì)粉狀菌體片段。用ISOGEN(Nippon Gene Co.，Ltd.)從菌體片段中提取總RNA。整個(gè)過(guò)程按照所附的說(shuō)明進(jìn)行。(2)通過(guò)RACE法獲得谷氨酰胺酶cDNA使用Oligotex-dT30<Super>mRNA純化試劑盒(Takara Shuzo Co.，Ltd.)從200μg這樣獲得的總RNA中得到4μg的mRNA。使用Marathon cDNA擴(kuò)增試劑盒(Clontech)和高級(jí)cDNA PCR試劑盒(Clontech)對(duì)1μg的mRNA進(jìn)行5’-RACE和3’-RACE法。RACE法中使用的引物是合成的，分別由SEQID NOS3-6表示的寡DNAs，即用于對(duì)EST克隆Contig Mix0010110003775 1進(jìn)行5’-RACE法的反義引物(SEQ ID NOS3-4)和用于3’-RACE法的有義引物(SEQ ID NOS5-6)。整個(gè)過(guò)程按照所附說(shuō)明進(jìn)行。其中PCR裝置使用的是GeneAmp5700 DNA檢測(cè)系統(tǒng)(PerkinElmer)。結(jié)果擴(kuò)增出了相應(yīng)于谷氨酰胺酶cDNA 5’-端約1.7kb的DNA片段和相應(yīng)于DNA 3’-端大約0.8kb的DNA片段。
擴(kuò)增的DNA片段在O.7％的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行分離，使用QIAquick凝膠提取試劑盒(QIAGEN)提取DNA片段。步驟按照所附說(shuō)明進(jìn)行。使用TOPOTA克隆試劑盒(Invitrogen)將提取的DNA片段插入pCR2.1-TOPO載體，將所得到的重組質(zhì)粒進(jìn)行序列反應(yīng)，該反應(yīng)使用了Thermo序列循環(huán)測(cè)序試劑盒(Amersham Pharmacia Biotech)，堿基序列的測(cè)定是在LI-COR MODEL4200L測(cè)序儀(購(gòu)自Aloka)上進(jìn)行。結(jié)果測(cè)定出了由SEQ ID NO1表示的約1.9-kb的開放式閱讀框(ORF)的堿基序列，并且已經(jīng)清楚EST克隆CONTIGMIX0010110003775_1是其部分片段。
該DNA編碼含有由SEQ ID NO2表示的643個(gè)氨基酸的蛋白，而且在一個(gè)已知的氨基酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行了關(guān)于該氨基酸序列的同源性檢索，使用NCBI BLAST進(jìn)行同源性檢索(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)。結(jié)果表明沒有已知蛋白與上述ORF相匹配。
然而，當(dāng)對(duì)來(lái)源于淺白色隱球酵母和Cryptococcus nodaensis的谷氨酰胺酶進(jìn)行同源性檢索時(shí)，在認(rèn)為是活性中心的一個(gè)區(qū)域發(fā)現(xiàn)同源性，意味著谷氨酰胺酶由ORF編碼。
將5’-RACE法產(chǎn)生的cDNA作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，由此克隆出全長(zhǎng)的谷氨酰胺酶cDNA，其中使用了SEQ ID NOS7和8代表的寡DNA作為引物。用上述方法提取出約2.1kb的擴(kuò)增DNA片段，并使用TOPO TA克隆試劑盒(Invitrogen)將該DNA片段插入pCR2.1-TOPO載體，從而獲得含有全長(zhǎng)谷氨酰胺酶cDNA的重組質(zhì)粒pASgln。
對(duì)重組質(zhì)粒pASgln的堿基序列也進(jìn)行了分析，從而確定谷氨酰胺酶cDNA的堿基序列(SEQ ID NO1)。
全長(zhǎng)的谷氨酰胺酶cDNA，如，含有由SEQ ID NO1第1-1932個(gè)堿基所代表的堿基序列的質(zhì)粒pASgln，已經(jīng)在獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物寄托中心進(jìn)行了保藏，保藏號(hào)為FERM BP-7634。實(shí)施例2谷氨酰胺酶cDNA的表達(dá)上述質(zhì)粒pASgln先用限制性內(nèi)切酶Bam HI和Sph I(均來(lái)自Takara ShuzoCo.，Ltd.)進(jìn)行酶處理，接著將酶切產(chǎn)物在0.7％的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，然后切下所要大小(約2.0kb)的DNA片段并進(jìn)行純化。
將這些DNA片段導(dǎo)入已經(jīng)由上述限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶處理的酵母表達(dá)載體pYES2(Invitrogen)，從而產(chǎn)生重組質(zhì)粒pYES-ASgln。該重組質(zhì)粒能夠誘導(dǎo)靶蛋白谷氨酰胺酶表達(dá)。宿主使用了所附的INVSc1(基因型MATa，his3Δ1，leu2，trp1-289，ura3-52/MATα，his3Δ1，leu2，trp1-289，ura3-52)，使用醋酸鋰方法用上述質(zhì)粒pYES-ASgln轉(zhuǎn)化宿主酵母。選擇性培養(yǎng)基使用了不含氨基酸的0.67％的酵母氮基(Difco)、2％的棉子糖(Wako Pure Chemicals Industries，Ltd.)和0.192％的不含尿嘧啶的酵母合成D析出培養(yǎng)基補(bǔ)料(SIGMA)。醋酸鋰方法參見“Tanpakushitsu Jikken Purotokoru-Kino Kaiseki-hen-”(“蛋白試驗(yàn)手冊(cè)——功能分析”)(Saibo Kogaku雜志的增補(bǔ)本(細(xì)胞技術(shù)；Shujun-sha))。
然后，根據(jù)pYES2載體(Invitrogen)附的方法，使用所得到的轉(zhuǎn)化體來(lái)表達(dá)蛋白。用帶有凸緣的200ml Erlenmeyer燒瓶將菌落中的轉(zhuǎn)化體移入20ml選擇性培養(yǎng)基中，在30℃以140rpm的速度振蕩培養(yǎng)約14小時(shí)，從而獲得種子培養(yǎng)物。
接著測(cè)定種子培養(yǎng)物的渾濁度(OD600)，將該種子培養(yǎng)物接種到一種蛋白表達(dá)誘導(dǎo)培養(yǎng)基，其初始渾濁度為OD600＝0.4。在蛋白表達(dá)誘導(dǎo)培養(yǎng)基的培養(yǎng)中使用了500ml的Sakaguchi燒瓶，在50ml培養(yǎng)基中于30℃在140rpm下振蕩培養(yǎng)。蛋白表達(dá)誘導(dǎo)培養(yǎng)基使用了1％的酵母提取物(Difco)，2％的聚蛋白胨(Nippon Seiyaku K.K.)，1％的棉子糖和2％的半乳糖(均是SIGMA)。經(jīng)離心收集的酵母體懸浮于蒸餾水中作為提供的酶溶液。
對(duì)日本專利申請(qǐng)公開(Kokai)號(hào)11-332553中描述的方法進(jìn)行部分改進(jìn)以用來(lái)測(cè)定谷氨酰胺酶的活性。具體地，將500μl 0.2M磷酸緩沖溶液(pH6.5)和500μl酶溶液加入到250μl 2％(W/V)的L-谷氨酸溶液中并于37℃反應(yīng)30分鐘。加入250μl 0.75N高氯酸溶液終止反應(yīng)，并加入125μl 1.5N氫氧化鈉溶液來(lái)中和反應(yīng)溶液。反應(yīng)溶液經(jīng)過(guò)離心(10000r.p.m.，10min)，取100μl上清液，在該上清液中加入0.1M的鹽酸羥胺緩沖液1.0ml(pH 8.0)、1.0ml 20mM NAD+溶液(Oriental Yeast Co.，Ltd.)和50μl 500單位/ml的L-谷氨酸脫氫酶溶液(SHIGMA)。然后上清液在37℃反應(yīng)30分鐘后，用分光光度計(jì)測(cè)定其在340nm的吸收值。在這種條件下，每一個(gè)單位(U)的谷氨酰胺酶的活性是根據(jù)每分鐘產(chǎn)生1μmol谷氨酸的酶的數(shù)量來(lái)定義。
轉(zhuǎn)化體谷氨酰胺酶活性的測(cè)定結(jié)果列于表1。表中的數(shù)值表明在培養(yǎng)開始(OD600＝15)后24小時(shí)每1ml培養(yǎng)液中谷氨酰胺酶的活性(mU/ml)。名稱“pYES2”指質(zhì)粒pYES2轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化體，“pYES-ASgln”指質(zhì)粒pYES-ASgln轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化體，符號(hào)“-”和“+”分別指通過(guò)不含半乳糖的非蛋白表達(dá)誘導(dǎo)型培養(yǎng)基的誘導(dǎo)和含有半乳糖的蛋白表達(dá)誘導(dǎo)型培養(yǎng)基的誘導(dǎo)。
表1


當(dāng)在含有半乳糖的蛋白表達(dá)誘導(dǎo)型培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí)，質(zhì)粒pYES-ASgln的轉(zhuǎn)化體的谷氨酰胺酶活性高于質(zhì)粒pYES2的轉(zhuǎn)化體。另一方面，當(dāng)在不含半乳糖的非蛋白表達(dá)誘導(dǎo)型培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí)，質(zhì)粒pYES-ASgln的轉(zhuǎn)化體沒有表現(xiàn)出谷氨酰胺酶活性的提高。這表明質(zhì)粒pYES-ASgln的轉(zhuǎn)化體的谷氨酰胺酶活性源于導(dǎo)入的谷氨酰胺酶基因(表1)。當(dāng)INVSc1作為表達(dá)谷氨酰胺酶的宿主時(shí)，在酵母體表面表達(dá)的谷氨酰胺酶活性也如曲霉菌屬細(xì)菌的情況一樣。
這樣可以根據(jù)本發(fā)明高效地制備谷氨酰胺酶，因此本發(fā)明具有巨大的工業(yè)實(shí)用性。
序列表<110>龜甲萬(wàn)株式會(huì)社<120>谷氨酰胺酶、谷氨酰胺酶基因、新的重組DNA及生產(chǎn)谷氨酰胺酶的方法<130 PH-1498<160>8<210 1<211>1932<212>DNA<213>醬油曲霉(Aspergillus sojae)<400> 1atg ttt ctt agt aca ctc ctc tca ctg gcg gcg gtc gtt gcc ggc gct 48gcc atc ccc aat ggc cag acg ctt tct ctc aat gac att cct tac tat 96gtg agc ggc att cct gtg tca act ttg caa ggg tac aat gcc tct gca 144tat gct gct ttg aca aag gga ata gat ttg gtg cca tta act gtc att 192cct gta act cct acc acg aac ttg gag tcg ctg cta tcg gac tat gtt 240gaa cgc gat gat gtc ttc cag ccg gct ttt ctg cgt gca gtc tat ctc 288aca gct tcc act gct gat gac att gac tcc caa ctg agc aat tat gcg 336tca att ctc aag tct tcc ggc acc gac gtg ctg ctg gtt gat tca gaa 384gta cac acc gct tcg tca gat tcc aca atc aca gcg cag ttg acc aaa 432gag ctg ccg agt ggg cct tat ttt gtc tcc ttg tat act gga gag gtg 480ttt aga gcg tac cgg ttg tac cct gac gac aac cta gct ttc att caa 528gca gga atc agt gac gag aag gga ggt gtc ctg ccc cta cca gcc gtg 576aca gaa aac gcg atg acc aaa gac gtt gcc gtg cct tca cgt ctc tat 624tat aca ccg acc gca gaa aag cca tta gcc ggt ctg agg tta ggt gtc 672aag gat atc tac cac gtt aaa ggt ctc aag acg agt ggc ggc agt cgc 720tcc tat tat tat tta tac gga act cag aat gtc act gcc cca tct att 768cag aga ctg ttg gac tta ggc gcg gtc ttt gtc ggt aaa act ggg acc 816gtt cag ttt gct aac ggt gat cga cct act gcc gac tgg gtg gat ttc 864cac tgt cca ttc aac caa cgc gga gaa gga tat cag gca cct agc ggt 912tcc tcc tcc ggc tca ggt gtg gct att gca gcc tac gac tgg ttg gac 960ctt gct gtc ggt agt gac act ggc ggt tca atg cgt tcc cca gct gca 1008gtt caa ggg ata tat ggc aac agg cca tct act ggc gct atc tct cta 1056gat cat gtc tta cct ctc tcg ccg gct ctg gat aca gcg ggc gtc ttt 1104gcc cga agt gcc tca cta tgg tcc cat act gtg caa gct tgg tat cct 1152cat ctc cag cac aat ttt acg tcc ttc cct cgg cag ctg ctc cta gcc 1200ggt ggt gga tgg gat ggt aaa ggc atc agt ccc gag gcc cat cag agt 1248ctt acc aca ttc aca cgt ggg ctt gag gca ttc ctc gga aca aac cat 1296acc aat gtc gac gtg tcg cag cga tgg ctt gac aca cac tct ccc acc 1344aca cca agc ctg gaa gag atg ctc aac ctg acc tat gcc aca ctt act 1392tct gtg gat cag ttc aac cac cta gcc gtc cct ctc ttt gct gac tat 1440aaa gcc gtc cac cgc ggt cgt cag cct ttc att aac ccc ggc cca tta 1488gcg cgt tgg cag tgg ggc cag gcg aat ggc gga aac acc tcg tac gat 1536gca gct ctg cgc aac atg act act ttc cga aac tgg tgg gag aag tcc 1584ggg tat ggt cag tcc gat aat gcc tct tgc tcc agg tcg ctt ttc gtc 1632agt gtg tat tcg gtc ggc acc act gac tac cgt aac caa tat tat gag 1680gcg ccc act aca ccc cca ctg gga ttc tcg atc gga cgc atc gcg gta 1728tta ggt gga gca cct gag gtt gtt gtt cct gtg gga gag tcc cca tac 1776aat agt act atc tct ttg cag acc gag tat ttg ccg gtc agt gtt gcg 1824ctg cag atg gcg cga gga tgt gac cat gtt ctg gct tcc ttg gtc gct 1872ggc ctt gag aag aag ggc gtc ctc cga cct gtc agt acc ggc tct cgc 1920cta tac tcc taa 1932<210>2<211>643<212>PRT<213>醬油曲霉(Aspergillus sojae)<400>2Met Phe Leu Ser Thr Leu Leu Ser Leu Ala Ala Val Val Ala G1y1 5 10 15Ala Ala Ile Pro Asn Gly Gln Thr Leu Ser Leu Asn Asp Ile Pro20 25 30Tyr Tyr Val Ser Gly Ile Pro Val Ser Thr Leu Gln Gly Tyr Asn35 40 45Ala Ser Ala Tyr Ala Ala Leu Thr Lys Gly Ile Asp Leu Val Pro50 55 60Leu Thr Val Ile Pro Val Thr Pro Thr Thr Asn Leu Glu Ser Leu65 70 75Leu Ser Asp Tyr Val Glu Arg Asp Asp Val Phe Gln Pro Ala Phe80 85 90Leu Arg Ala Val Tyr Leu Thr Ala Ser Thr Ala Asp Asp Ile Asp95 100 105Ser Gln Leu Ser Asn Tyr Ala Ser Ile Leu Lys Ser Ser Gly Thr110 115 120Asp Val Leu Leu Val Asp Ser Glu Val His Thr Ala Ser Ser Asp125 130 135Ser Thr Ile Thr Ala Gln Leu Thr Lys Glu Leu Pro Ser Gly Pro140 145 150Tyr Phe Val Ser Leu Tyr Thr Gly Glu Val Phe Arg Ala Tyr Arg155 160 165Leu Tyr Pro Asp Asp Asn Leu Ala Phe Ile Gln Ala Gly Ile Ser170 175 180Asp Glu Lys Gly Gly Val Leu Pro Leu Pro Ala Val Thr Glu Asn185 190 195Ala Met Thr Lys Asp Val Ala Val Pro Ser Arg Leu Tyr Tyr Thr200 205 210Pro Thr Ala Glu Lys Pro Leu Ala Gly Leu Arg Leu Gly Val Lys215 220 225Asp Ile Tyr His Val Lys Gly Leu Lys Thr Ser Gly Gly Ser Arg230 235 240Ser Tyr Tyr Tyr Leu Tyr Gly Thr Gln Asn Val Thr Ala Pro Ser245 250 255Ile Gln Arg Leu Leu Asp Leu Gly Ala Val Phe Val Gly Lys Thr260 265 270Gly Thr Val Gln Phe Ala Asn Gly Asp Arg Pro Thr Ala Asp Trp275 280 285Val Asp Phe His Cys Pro Phe Asn Gln Arg Gly Glu Gly Tyr Gln290 295 300Ala Pro Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ser Gly Val Ala Ile Ala Ala305 310 315Tyr Asp Trp Leu Asp Leu Ala Val Gly Ser Asp Thr Gly Gly Ser320 325 330Met Arg Ser Pro Ala Ala Val Gln Gly Ile Tyr Gly Ash Arg Pro335 340 345Ser Thr Gly Ala Ile Ser Leu Asp His Val Leu Pro Leu Ser Pro350 355 360Ala Leu Asp Thr Ala Gly Val Phe Ala Arg Ser Ala Ser Leu Trp365 370 375Ser His Thr Val Gln Ala Trp Tyr Pro His Leu Gln His Asn Phe380 385 390Thr Ser Phe Pro Arg Gln Leu Leu Leu Ala Gly Gly Gly Trp Asp395 400 405Gly Lys Gly Ile Ser Pro Glu Ala His Gln Ser Leu Thr Thr Phe410 415 420Thr Arg Gly Leu Glu Ala Phe Leu Gly Thr Asn His Thr Asn Val425 430 435Asp Val Ser Gln Arg Trp Leu Asp Thr His Ser Pro Thr Thr Pro440 445 450Ser Leu Glu Glu Met Leu Asn Leu Thr Tyr Ala Thr Leu Thr Ser455 460 465Val Asp Gln Phe Asn His Leu Ala Val Pro Leu Phe Ala Asp Tyr470 475 480Lys Ala Val His Arg Gly Arg Gln Pro Phe Ile Asn Pro Gly Pro485 490 495Leu Ala Arg Trp Gln Trp Gly Gln Ala Asn Gly Gly Asn Thr Ser500 505 510Tyr Asp Ala Ala Leu Arg Asn Met Thr Thr Phe Arg Asn Trp Trp515 520 525Glu Lys Ser Gly Tyr Gly Gln Ser Asp Asn Ala Ser Cys Ser Arg530 535 540Ser Leu Phe Val Ser Val Tyr Ser Val Gly Thr Thr Asp Tyr Arg545 550 555Asn Gln Tyr Tyr Glu Ala Pro Thr Thr Pro Pro Leu Gly Phe Ser560 565 570Ile Gly Arg Ile Ala Val Leu Gly Gly Ala Pro Glu Val Val Val575 580 585Pro Val Gly Glu Ser Pro Tyr Asn Ser Thr Ile Ser Leu Gln Thr590 595 600Glu Tyr Leu Pro Val Ser Val Ala Leu Gln Met Ala Arg Gly Cys605 610 615Asp His Val Leu Ala Ser Leu Val Ala Gly Leu Glu Lys Lys Gly620 625 630Val Leu Arg Pro Val Ser Thr Gly Ser Arg Leu Tyr Ser635 640 643<210>3<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>3tag cta tgg tcc cgt act gtg caa gct tgg 30<210>4<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>4atg gct tga cac aca atc tcc cac cac acc 30<210>5<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>5gca gcg caa cac tga ccg gca aat act cgg 30<210>6<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>6aag agc gac ttg gag cag gag gca cat cgg 30<210>7<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>7ggt gac aga ctg gat cca tca tgt ttc tta 30<210>8<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>8ttg ttt gaa ccg gca tgc tct act ttg tac 30
權(quán)利要求
1.一種根據(jù)如下(a)或(b)的谷氨酰胺酶(a)一種含有如SEQ ID NO2所示氨基酸序列的蛋白；(b)一種含有相對(duì)于氨基酸序列(a)進(jìn)行缺失、取代或增加一個(gè)或多個(gè)氨基酸的蛋白，并且該蛋白具有谷氨酰胺酶活性。
2.一種編碼根據(jù)如下(a)或(b)的蛋白的谷氨酰胺酶基因(a)一種含有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的蛋白；(b)一種含有相對(duì)于氨基酸序列(a)進(jìn)行缺失、取代或增加一個(gè)或多個(gè)氨基酸的蛋白，并且該蛋白具有谷氨酰胺酶活性。
3.一種含有根據(jù)如下(a)或(b)的DNA的谷氨酰胺酶基因(a)一種含有SEQ ID NO1所示的堿基序列的DNA；(b)一種在嚴(yán)格條件下能與含有(a)的堿基序列的DNA雜交的DNA，該DNA編碼具有谷氨酰胺酶活性的蛋白。
4.一種新的重組DNA，其特征在于根據(jù)權(quán)利要求
2或3的谷氨酰胺酶基因被插入到載體DNA中。
5.一種含有根據(jù)權(quán)利要求
4的重組DNA的轉(zhuǎn)化體或轉(zhuǎn)導(dǎo)體。
6.一種制備谷氨酰胺酶的方法，包括在培養(yǎng)基上培養(yǎng)如權(quán)利要求
5所述的轉(zhuǎn)化體或轉(zhuǎn)導(dǎo)體，以及從培養(yǎng)產(chǎn)物中收集谷氨酰胺酶。
專利摘要
谷氨酰胺酶，該酶包括(a)一種含有如SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的蛋白，或(b)一種含有相對(duì)于氨基酸序列(a)進(jìn)行缺失、取代或增加一個(gè)或多個(gè)氨基酸并具有谷氨酰胺酶活性的蛋白。一種谷氨酰胺酶基因，該基因編碼(a)一種含有如SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的蛋白；或(b)一種含有相對(duì)于氨基酸序列(a)進(jìn)行缺失、取代或增加一個(gè)或多個(gè)氨基酸并具有谷氨酰胺酶活性的蛋白。本發(fā)明使得能夠高效地生產(chǎn)谷氨酰胺酶，從而有助于相關(guān)產(chǎn)業(yè)。
文檔編號(hào)C12N9/78GKCN1394953SQ02127255
公開日2003年2月5日 申請(qǐng)日期2002年6月21日
發(fā)明者松島健一朗, 伊藤考太郎, 小山泰二 申請(qǐng)人:龜甲萬(wàn)株式會(huì)社導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan