專(zhuān)利名稱(chēng)：一種重組葡激酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于溶解血栓的葡激酶突變株(121)的構(gòu)建及其表達(dá)產(chǎn)物的分離純化方法，屬生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
葡激酶(Staphylokinase，Sak)是來(lái)源于金黃色葡萄球菌分泌的一種蛋白質(zhì)。1948年Lack C.H首先發(fā)現(xiàn)其具有溶解血栓的能力，由于天然Sak分泌水平較低及當(dāng)時(shí)純化工藝的落后，制約了Sak發(fā)展。80年代隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，Sak的核苷酸序列被解析，并確認(rèn)了它的溶栓機(jī)理。Sak象鏈激酶(SK)一樣，首先與纖溶酶原結(jié)合形成復(fù)合物，去催化纖溶酶原轉(zhuǎn)化為纖溶酶，然后對(duì)血纖維蛋白進(jìn)行水解。Sak優(yōu)先選擇與血栓上的纖溶酶原結(jié)合，水解其中的血纖維蛋白，當(dāng)血漿中不存在血栓時(shí)，血纖維蛋白溶酶則被血漿中的α-AP中和，不降低凝血系統(tǒng)中的纖維蛋白原，不易引起全身性溶血。由于Sak具有很強(qiáng)的溶栓專(zhuān)一性，曾先后被國(guó)內(nèi)外多家實(shí)驗(yàn)室克隆，如中國(guó)專(zhuān)利94112105、95111222、97105988、97103921、98102132、00111627、00111628、99804195和00112673均為成熟的Sak(136個(gè)氨基酸組成)。
本發(fā)明的目的就是提供一種表達(dá)水平和活性均比成熟葡激酶提高的工程菌株；為此，我們通過(guò)在N端缺失不同氨基酸的方法，通過(guò)PCR擴(kuò)增，最后獲得了在成熟葡激酶N端缺失15個(gè)氨基酸殘基的表達(dá)水平和活性均提高的新型葡激酶。其具有專(zhuān)一性強(qiáng)、溶栓速度快等特點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所述的重組葡激酶突變株與中國(guó)專(zhuān)利94112105、97105988、97103921、98102132、00111627、00111628、99804195、00112674、和00112673報(bào)道的均不相同，中國(guó)專(zhuān)利所報(bào)道的均為成熟的葡激酶由136個(gè)氨基酸組成，而本發(fā)明提供的Sak是由121個(gè)氨基酸組成的，表達(dá)水平和活性均提高的葡激酶突變株，是一種新型的葡激酶。
本發(fā)明構(gòu)建的葡激酶工程菌CGMCC0871，具有45％以上的表達(dá)量，并以可溶性形式表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)分離純化獲得高純度葡激酶制品，經(jīng)臨床研究表明葡激酶與尿激酶(UK)、鏈激酶(SK)、組織纖溶酶原激活劑(t-PA)相比，具有分子量小、專(zhuān)一性強(qiáng)、溶栓速度快等特點(diǎn)，其可用于急性心肌梗塞，腦栓塞、肺栓塞等疾病的治療和預(yù)防。
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種分子量小、專(zhuān)一性強(qiáng)、溶栓速度快的新型重組葡激酶(121)基因核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列；提供一種高效表達(dá)工程菌菌株的制備方法；提供該重組葡激酶與適當(dāng)賦形劑的藥用組合物；同時(shí)提供該重組葡激酶與適當(dāng)賦形劑的藥用組合物的用途。
本發(fā)明目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)以本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的成熟Sak(pSAK136)DNA為模板，采用引物I和引物II經(jīng)PCR擴(kuò)增，獲得含有約380bp的葡激酶基因DNA片段，該基因DNA片段和表達(dá)載體pBV220(pBV220質(zhì)粒見(jiàn)《病毒學(xué)報(bào)》，1990，6(2)111-116。)質(zhì)粒，分別以EcoRI和BamHI酶切；再將酶切后的上述質(zhì)粒和葡激酶基因DNA片段用T4DNA連接酶連接，獲得含有Sak(121)基因的pDS03質(zhì)粒DNA，再轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α宿主細(xì)胞中，構(gòu)建成高表達(dá)的葡激酶(121)工程菌菌株CGMCC0871。
本發(fā)明提供的技術(shù)方案一為本發(fā)明質(zhì)粒pDS03構(gòu)建過(guò)程中所采用的引物為引物I為5′CACGAATTCATGAGTTATTTTGAACCAACA 3′；引物為5′CACGGATCCCTATTTCTTTTCAATAACAACCTT 3。
本發(fā)明PCR反應(yīng)為dd.H2O 31μl
10xPCR緩沖液 5μldNTP(2.0mmol)4μlP-1(20pmol) 2μlP-2(20pmol) 2μl模板DNA(pSAK136) 5μlPfu DNA聚合酶(2.0u/μl) 1μl振蕩、稍加離心，92℃變性3分鐘。放入PCR擴(kuò)增儀，按以下步驟進(jìn)行反應(yīng)94℃10秒55℃30秒72℃60秒共30個(gè)循環(huán)，然后72℃延伸10分鐘。
本發(fā)明重組葡激酶(121)表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建為將PCR擴(kuò)增Sak121基因片段以EcoRI-BamHI雙酶切后，以相同的限制性?xún)?nèi)切酶酶切的表達(dá)載體pBV220重組，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，涂于LB(含Amp)平板上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。提取質(zhì)粒(方法見(jiàn)《分子克隆操作指南》1986)，以EcoRI-BamHI雙酶切，走1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢查，似含Sak121基因特征片斷者，為表達(dá)質(zhì)粒pDS03。經(jīng)自動(dòng)序列分析儀測(cè)定了其核苷酸序列為AGT TAT TTT GAA CCA ACA GGC CCG TAT TTG ATG GTAAAT GTG ACT GGA GTT GAT GGT AAG GGA AAT GAA TTGCTA TCC CCT CGT TAT GTC GAG TTT CCT ATT AAA CCTGGG ACT ACA CTT ACA AAA GAA AAA ATT GAG TAC TATGTC GAA TGG GCA TTA GAT GCG ACA GCA TAT AAA GAGTTT AGA GTA GTT GAA TTA GAT CCA AGC GCA AAG ATCGAA GTC ACT TAT TAT GAT AAG AAT AAG AAA AAA GAAGAA ACG AAG TCT TTC CCT ATA ACA GAA AAA GGT TTTGTT GTC CCA GAT TTA TCA GAG CAT ATT AAA AAC CCTGGA TTC AAC TTA ATT ACA AAG GTT GTT ATA GAA AAGAAA
本發(fā)明重組葡激酶(121)高效表達(dá)工程菌株的鑒定方法為將葡激酶121工程菌CGMCC0871挑取單菌落分別接種在5ml的LB(Amp)液體培養(yǎng)基中30℃振蕩培養(yǎng)4h，42℃繼續(xù)培養(yǎng)3h，各取1ml培養(yǎng)液，4℃，10000rpm，離心1min，去上清，沉淀加入100μl的2xSDS-PAGE電泳緩沖液100℃煮沸5min，室溫12000rpm，離心5min。對(duì)照為pBV220/DH5α或誘導(dǎo)前培養(yǎng)液以同樣方法處理。取樣10μl，走SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后，將SDS-PAGE電泳凝膠切開(kāi)。一組用于考馬斯亮藍(lán)染色，可見(jiàn)誘導(dǎo)樣品在分子量14.0KD處有非常濃集的區(qū)帶，而對(duì)照樣品pBV220/DH5α和誘導(dǎo)前培養(yǎng)液無(wú)此區(qū)帶。經(jīng)電泳凝膠成像掃描分析，Sak121蛋白約占菌體總蛋白的45％以上。
另一組凝膠以Western Blot的方法，將SDS-PAGE凝膠用半干膠轉(zhuǎn)移儀轉(zhuǎn)移在硝酸纖維素膜(NC)上，通過(guò)特異試劑(抗體)作為探針，對(duì)靶物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)。首先在下電極板上依次放上濕濾紙2張，NCl張，凝膠，濕濾紙2張，蓋上電極板，電壓60V，30分鐘。轉(zhuǎn)移結(jié)束后，取出NC用TTBS封閉1小時(shí)；加入溶有一抗(兔抗葡激酶抗體)的新鮮配置的TTBS(0.1ml/cm2膜面積)，室溫過(guò)夜；用TTBS漂洗3次，各10分鐘，以除去過(guò)量的一抗；加入二抗(羊抗兔IgG，HRP)的新鮮配置的TTBS(0.1ml/cm2膜面積)，室溫孵育2小時(shí)，用TTBS漂洗3次，各10分鐘，以除去未結(jié)合的二抗；以DAB(3，3’一二氨基聯(lián)苯胺鹽酸鹽)室溫顯色，在分子量約14.0KD處有一條非常濃集的區(qū)帶，而對(duì)照樣品pBV220/DH5α和誘導(dǎo)前培養(yǎng)液無(wú)此區(qū)帶。表明葡激酶突變株121具有高效表達(dá)能力。
本發(fā)明提供的技術(shù)方案二為重組葡激酶(121)產(chǎn)物的分離純化經(jīng)發(fā)酵液、離心收集菌體、高壓溶漿離心收集細(xì)胞裂解上清液，以截流量100KD膜包，在8℃以下進(jìn)行超濾，去掉約40％的雜蛋白。然后上Q-Sepharose F.F柱進(jìn)行分離純化每升發(fā)酵液可獲得該純品500mg以上；經(jīng)SDS-PAGE和HPLC分析， 純度均在98％以上。以人血纖維蛋白平板法，測(cè)定重組葡激酶(121)蛋白質(zhì)的生物活性，其比活為6.0×105IU/mg。


圖1重組葡激酶pDS03表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建圖譜圖2重組葡激酶(121)核苷酸序列分析圖譜具體實(shí)施方案本發(fā)明是以本實(shí)驗(yàn)室克隆的成熟葡激酶基因(pSAK136)為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增出的葡激酶(121)基因片段插入表達(dá)載體pBV220質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，構(gòu)建成新的重組葡激酶工程菌菌株CGMCC0871。該表達(dá)產(chǎn)物具有免疫原性降低的與成熟葡激酶相同的藥用價(jià)值，可用于心肌梗塞、腦栓塞、肺栓塞等血栓性疾病的治療和預(yù)防。
下面結(jié)合實(shí)施例證詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的制備方法實(shí)施例一1、引物設(shè)計(jì)根據(jù)已知葡激酶核苷酸序列，設(shè)計(jì)一對(duì)引物，用該引物擴(kuò)增出的葡激酶基因片段，為在成熟的葡激酶基因前缺失15個(gè)氨基酸殘基的葡激酶基因片段。
引物I5′CACGAATTCATGAAGGGCGATGACGCGAGT；引物II5′CACGGATCCTATTTCTTTTCAATAACAAC。
2.PCR反應(yīng)dd.H2O 31μl10xPCR緩沖液 5μldNTP(2.0mmol)4μlP-1(20pmol) 2μlP-2(20pmol) 2μl模板DNA(Sak136DNA) 5μlPfu DNA聚合酶(2.0u/μl) 1μl振蕩、稍加離心，92℃變性3分鐘。放入PCR擴(kuò)增儀，按以下步驟進(jìn)行反應(yīng)
94℃10秒55℃30秒72℃60秒共30個(gè)循環(huán)，然后72℃延伸10分鐘。取5μl PCR反應(yīng)物，以1.2％瓊脂糖電泳檢查，可見(jiàn)380bp左右的DNA片斷。
3、重組葡激酶(121)表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建將PCR擴(kuò)增Sak121片段以EcoRI-BamHI雙酶切后，以相同的限制性?xún)?nèi)切酶酶酶切的表達(dá)載體pBV220重組，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，涂于LB(含Amp)平板上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。提取質(zhì)粒，以EcoRI-BamHI雙酶切，走1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢查，似含Sak121基因特征片斷者，為表達(dá)質(zhì)粒pDS03(如圖1所示)。經(jīng)自動(dòng)序列分析儀測(cè)定了其核苷酸序列(如圖2所示)。
4、重組葡激酶(121)高效表達(dá)工程菌株的鑒定將葡激酶121工程菌CGMCC0871挑取單菌落分別接種在5ml的LB(Amp)液體培養(yǎng)基30℃振蕩培養(yǎng)4h，42℃繼續(xù)培養(yǎng)3h，各取1ml培養(yǎng)液，4℃，10000rpm，離心1min，去上清，沉淀加入100μl的2xSDS-PAGE電泳緩沖液100℃煮沸5min，室溫12000rpm，離心5min。對(duì)照為pBV220/DH5α或誘導(dǎo)前培養(yǎng)液以同樣方法處理。取樣10μ1，走SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后，將SDS-PAGE電泳凝膠切開(kāi)。一組用于考馬斯亮藍(lán)染色，可見(jiàn)誘導(dǎo)樣品在分子量14.0KD處有非常濃集的區(qū)帶，而對(duì)照樣品pBV220/DH5α和誘導(dǎo)前培養(yǎng)液無(wú)此區(qū)帶。經(jīng)電泳凝膠成像掃描分析，Sak121蛋白約占菌體總蛋白的45％以上，比成熟葡激酶表達(dá)量提高約10％。
另一組凝膠以Western Blot的方法，將SDS-PAGE凝膠用半干膠轉(zhuǎn)移儀轉(zhuǎn)移在硝酸纖維素膜(NC)上，通過(guò)特異試劑(抗體)作為探針，對(duì)靶物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)。首先在下電極板上依次放上濕濾紙2張，NCl張，凝膠，濕濾紙2張，蓋上電極板，電壓60V，30分鐘。轉(zhuǎn)移結(jié)束后，取出NC用TTBS封閉1小時(shí)；加入溶有一抗(兔抗葡激酶抗體)的新鮮配置的TTBS(0.1m1/cm2膜面積)，室溫過(guò)夜；用TTBS漂洗3次，各10分鐘，以除去過(guò)量的一抗；加入二抗(羊抗兔IgG，HRP)的新鮮配置的TTBS(0.1m1/cm2膜面積)，室溫孵育2小時(shí)，用TTBS漂洗3次，各10分鐘，以除去未結(jié)合的二抗；以DAB(3，3’一二氨基聯(lián)苯胺鹽酸鹽)室溫顯色，在分子量約14.0KD處有一條非常濃集的區(qū)帶，而對(duì)照樣品pBV220/DH5α和誘導(dǎo)前培養(yǎng)液無(wú)此區(qū)帶。表明葡激酶突變株121具有高效表達(dá)能力。
實(shí)施例二一種重組葡激酶(121)產(chǎn)物的分離純化1、收獲發(fā)酵液經(jīng)4℃，10000rpm，離心10分鐘，收集菌體。以20mM磷酸鹽緩沖液(pH8.0)懸浮，洗菌體一次，以同樣條件離心，收集菌體。
2、高壓溶漿將離心收集菌體，以濕重菌體100g加入1000ml 20mM磷酸鹽(pH8.0)緩沖液懸浮，用高壓溶漿儀破碎細(xì)胞，4℃，15000rpm離心20分鐘，收集上清。用SDS-PAGE檢測(cè)上述細(xì)胞裂解液，可見(jiàn)在分子量14KD處有一很粗的區(qū)帶，經(jīng)掃描分析含量約45％，由此可見(jiàn)，表達(dá)產(chǎn)物為可溶性。
3、超濾將高壓溶漿離心收集上清液，以截流量100KD膜包，在8℃以下進(jìn)行超濾截留，可去掉約40％的雜蛋白，使粗酶液的純度達(dá)到80％以上。
4、Q-Sepharose F.F柱層析將以分子截流量100KD超濾濾出液(葡激酶粗蛋白)，上經(jīng)20mM磷酸鹽(pH8.0)緩沖液平衡層析柱(Φ7.5×20cm)，并用此緩沖液充分洗滌至基線(xiàn)，再用含有0.25M NaCl的上述緩溶液洗脫目的峰。經(jīng)蛋白質(zhì)定量測(cè)定，每升發(fā)酵液經(jīng)分離純化可得純品500mg以上；SDS-PAGE和HPLC分析，純度均在98％以上。
5、活性鑒定(人血纖維蛋白平板法)5.1纖維蛋白平板的制備稱(chēng)取125mg瓊脂糖，加入23ml生理氯化鈉溶液，煮沸溶解，60℃水浴平衡，加凝血酶14μ1(100IU/ml)，纖溶酶原280μl(0.5mg/ml)，要邊加邊搖勻，加2.2ml人纖維蛋白原(6mg/ml)，不停地?fù)u勻，混勻后立即到平板(直徑9cm)，水平放置充分凝固后4℃放置至少30分鐘待用。
5.2標(biāo)準(zhǔn)品和待見(jiàn)樣品的稀釋標(biāo)準(zhǔn)品用生理氯化鈉溶液稀釋成以下5個(gè)稀釋度(IU/ml)1000，250，62.5，15.6，3.9，待檢樣品根據(jù)標(biāo)示量稀釋至大約100IU/ml，或1μg/ml的濃度，待用。
5.3打孔及點(diǎn)樣在形成的纖維蛋白平皿內(nèi)打孔(直徑2mm)，每孔點(diǎn)樣10μl，每個(gè)待檢樣品和標(biāo)準(zhǔn)品各點(diǎn)2個(gè)孔，37℃濕盒(在飯盒內(nèi)加少量水以保持一定的濕度)水平放置24小時(shí)。
5.4 結(jié)果計(jì)算縱橫兩次量取溶圈直徑，以各個(gè)稀釋度的活性的對(duì)數(shù)(x)為橫坐標(biāo)，以溶圈直徑的平均數(shù)(4次量取的數(shù)值)的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)(y)，按生物統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析結(jié)果，并求得y＝a+bx中的a和b及線(xiàn)性回歸系數(shù)r值，根據(jù)待檢樣品的溶圈直徑可求得待檢樣品的活性。
經(jīng)測(cè)定，葡激酶121蛋白質(zhì)的生物活性，其比活為6.0×105IU/mg，比成熟的葡激酶活性5.0x x105IU/mg高20％左右。
本發(fā)明構(gòu)建的重組葡激酶的高效表達(dá)工程菌株為pDS03/DH5α。菌株已由中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)進(jìn)行了保藏保藏地址北京市海淀區(qū)中關(guān)村北一條13號(hào)保藏日期2002年12月27日保藏編號(hào)No.0871分類(lèi)命名大腸埃希氏菌
權(quán)利要求
1.一種重組葡激酶，其特征在于其編碼的核苷酸序列為AGT TAT TTT GAA CCA ACA GGC CCG TAT TTG ATG GTAAAT GTG ACT GGA GTT GAT GGT AAG GGA AAT GAA TTGCTA TCC CCT CGT TAT GTC GAG TTT CCT ATT AAA CCTGGG ACT ACA CTT ACA AAA GAA AAA ATT GAG TAC TATGTC GAA TGG GCA TTA GAT GCG ACA GCA TAT AAA GAGTTT AGA GTA GTT GAA TTA GAT CCA AGC GCA AAG ATCGAA GTC ACT TAT TAT GAT AAG AAT AAG AAA AAA GAAGAA ACG AAG TCT TTC CCT ATA ACA GAA AAA GGT TTTGTT GTC CCA GAT TTA TCA GAG CAT ATT AAA AAC CCTGGA TTC AAC TTA ATT ACA AAG GTT GTT ATA GAA AAGAAA
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述重組葡激酶，其特征在于其編碼的氨基酸序列為Ser Tyr Phe Glu Pro Thr Gly Pro Tyr Leu Met ValAsn Val Thr Gly Val Asp Gly Lys Gly Asn Glu LeuLeu Ser Pro Arg Tyr Val Glu Phe Pro Ile Lys ProGly Thr Thr Leu Thr Lys Glu Lys Ile Glu Tyr TyrVal Glu Trp Ala Leu Asp Ala Thr Ala Tyr Lys GluPhe Arg Val Val Glu Leu Asp Pro Ser Ala Lys IleGlu Val Thr Tyr Tyr Asp Lys Asn Lys Lys Lys GluGlu Thr Lys Ser Phe Pro Ile Thr Glu Lys Gly PheVal Val Pro Asp Leu Ser Glu His Ile lys Asn ProGly Phe Asn Leu Ile Thr Lys Val Val Ile Glu LysLys
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述重組葡激酶，其高效表達(dá)工程菌株為pDS03/E.coli(CGMCC0871)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組葡激酶，其構(gòu)建該葡激酶衍生物的高效表達(dá)工程菌的方法為以本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的成熟葡激酶(pSAK136)DNA為模板，將擴(kuò)增出葡激酶(121)基因片段，與表達(dá)載體pBV220重組，轉(zhuǎn)化宿主菌大腸桿菌DH5α，獲得了高效表達(dá)工程菌菌種CGMCC0871。
5.權(quán)利要求1所述的重組葡激酶的制備方法。
6.權(quán)利要求1所述的重組葡激酶的適當(dāng)賦形劑的藥用組合物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的藥用組合物在治療心腦血管疾病方面的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種重組葡激酶(Sak)基因的構(gòu)建及其表達(dá)產(chǎn)物的制備方法，屬生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明所述Sak為N端缺失15個(gè)氨基酸殘基的Sak衍生物，由121個(gè)氨基酸組成。改良后的Sak基因在大腸桿菌中高效表達(dá)，表達(dá)水平比成熟葡激酶表達(dá)量提高10％；比活比成熟葡激酶提高約20％；經(jīng)分離純化獲得單一組份Sak制品，其表達(dá)產(chǎn)物具有分子量小、專(zhuān)一性高、溶栓速度快等特點(diǎn)，適宜工業(yè)化生產(chǎn)?？捎糜诩毙孕募」Ｈ湍X栓等血栓性急病的治療和預(yù)防。
文檔編號(hào)A61K38/43GK1511952SQ0215907
公開(kāi)日2004年7月14日 申請(qǐng)日期2002年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月31日
發(fā)明者杜永峰, 左新文 申請(qǐng)人:北京永安世紀(jì)軟件技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司