專利名稱:一種新的str等位基因階梯的制備技術(shù)以及具有這種等位基因階梯的分型試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及法醫(yī)學(xué)、遺傳學(xué)、分子生物學(xué)、人類學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、基因組學(xué)、基因診斷、基因工程等技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地說涉及一種新的STR等位基因階梯的制備技術(shù)以及具有這種等位基因階梯的分型試劑盒。該技術(shù)可用于法醫(yī)學(xué)、人類學(xué)、遺傳學(xué)和腫瘤學(xué)等領(lǐng)域的個體識別、親權(quán)鑒定以及遺傳和腫瘤的診斷等方面。
背景技術(shù)：
人類基因組DNA有3×109bp，其中10％是串聯(lián)重復(fù)序列，被稱為衛(wèi)星DNA。按重復(fù)單位的長短，又可分為大衛(wèi)星、中衛(wèi)星、小衛(wèi)星和微衛(wèi)星。其中重復(fù)單位僅由2-7bp組成的微衛(wèi)星，所以又稱為短串聯(lián)重復(fù)序列(short tanden repeat，STR)。不同人體基因組的衛(wèi)星DNA重復(fù)單位的數(shù)目是可變的，因此形成了極其復(fù)雜的等位基因片段長度多態(tài)性。根據(jù)這一規(guī)律，近幾年在法醫(yī)學(xué)、考古學(xué)、遺傳學(xué)和腫瘤學(xué)等領(lǐng)域建立了一種嶄新的對人體進(jìn)行個體識別、親權(quán)鑒定以及對遺傳和腫瘤進(jìn)行診斷的STR-PCR(短串聯(lián)重復(fù)序列聚合酶鏈反應(yīng))技術(shù)，從而給這些領(lǐng)域的發(fā)展帶來了新的革命性變化。在這一技術(shù)中，為了準(zhǔn)確地給各等位基因進(jìn)行定位和識別，必須設(shè)置與各等位基因相對應(yīng)的等位基因階梯(Allele ladder，AL)為標(biāo)準(zhǔn)參照物(Markers)。因等位基因階梯中的每一基因片段的長度均是已知的，將它與各待測樣品的擴增產(chǎn)物在相同電泳條件下的相鄰泳道上進(jìn)行電泳分離，染色后進(jìn)行對比，就很容易判斷待測樣品的基因型，所以，等位基因階梯在STR-PCR的結(jié)果判斷中至關(guān)重要。
目前國內(nèi)制備各STR位點等位基因階梯的方法有兩種一種是從人基因組的每個位點上篩選能代表各等位基因片段的幾種擴增產(chǎn)物，混合后直接用于Allele Ladder；另一種方法是將能代表某位點上所有等位基因的擴增產(chǎn)物混合物，稀釋后再次擴增，將再次擴增的產(chǎn)物用作等位基因階梯。
按上述方法制備的等位基因階梯有很多不足之處(1)、直接選擇人基因組作為擴增模板時，由于各等位基因的長度不同，易出現(xiàn)優(yōu)勢擴增現(xiàn)象，即長度較短的等位基因容易被擴增，而長度較長的等位基因則不易被擴增，使擴增產(chǎn)物的量不同，由此制備的等位基因階梯的各等位基因的量不一，甚至出現(xiàn)不擴增，即無擴增產(chǎn)物，無法檢測到的現(xiàn)象。
(2)、要批量生產(chǎn)，必須要經(jīng)常去挑選和制備能代表所有等位基因片段的模板，不但工作量大，而且每次用的同一模板的純度及含量等均有出入，使其擴增條件難以標(biāo)準(zhǔn)化。
(3)、人基因組DNA的分子量大，結(jié)構(gòu)極其復(fù)雜，極容易出現(xiàn)非特異擴增，需反復(fù)對產(chǎn)物進(jìn)行純化對產(chǎn)物的純化較嚴(yán)重，不適合批量生產(chǎn)。
(4)、若用人基因DNA擴增產(chǎn)物混合后再次進(jìn)行擴增，其非特異擴增更加嚴(yán)重，此法更不適合批量生產(chǎn)。
(5)、將擴增產(chǎn)物的混合物直接用于等位基因階梯時，在短時間內(nèi)可能出現(xiàn)降解，使其各條帶模糊不清，或者構(gòu)型有所改變，使其電泳遷移發(fā)生變化。由于這些原因引起的質(zhì)量變化均不能作為標(biāo)準(zhǔn)參照物使用。
為了解決上述方法制備的等位基因階梯存在的諸多不足之處，珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司于1999年6月4日申請了“短串聯(lián)重復(fù)序列等位基因階梯的制備技術(shù)”的中國發(fā)明專利，其公開號為CN1276427。這種短串聯(lián)重復(fù)序列等位基因階梯的制備技術(shù)包括以下步驟1、從人的有核細(xì)胞中提取DNA；2、按現(xiàn)有的各STR位點PCR方法進(jìn)行擴增，以尋求各位點的等位基因型；3、快速純化PCR產(chǎn)物；4、將純化的PCR產(chǎn)物連接到T載體上；5、按分子克隆的方法提取質(zhì)粒DNA，并進(jìn)行純度和定量測試；6、用STR-PCR技術(shù)分別制備各等位基因片段，然后對擴增產(chǎn)物進(jìn)行純化和定量測定；7、將各位點的等位基因片段進(jìn)行序列分析，以測定各片段的減基數(shù)及串聯(lián)重復(fù)單位數(shù)；8、將各片段等量混合后，加入穩(wěn)定劑，并按適當(dāng)量分裝；9、出廠前再次進(jìn)行電泳檢測。
這種制備技術(shù)具有的特點是1、用于擴增各等位基因的模板是通過分子克隆技術(shù)制備的，該模板的DNA序列與人基因組DNA上同一位點的序列完全相同，因此用這兩種不同模板得到的擴增產(chǎn)物的DNA序列及構(gòu)型完全一致，從而確保了這兩種擴增產(chǎn)物的電泳遷移率保持不變。
2、通過分子克隆技術(shù)得到的模板的長度遠(yuǎn)小于人基因組DNA的長度，容易線性化和解鏈，在相同條件下，得到的擴增產(chǎn)物遠(yuǎn)高于用人基因組DNA擴增的量，而且非特異性擴增產(chǎn)物也遠(yuǎn)少于人基因組DNA的擴增產(chǎn)物，所以容易批量生產(chǎn)。
3、各等位基因片段是一條一條的制備。然后分別測定其含量，再等量混合后制成等位基因階梯，這樣就確保了每條帶顏色的深淺是均一的。
4、用分子克隆技術(shù)制備的模板更容易作到定性定量測定，一次標(biāo)準(zhǔn)化的模板可用好幾年，這不但大大地減化了反復(fù)從人的有核細(xì)胞中去尋找和提取各等位基因模板的煩瑣工作，更主要的是盡可能地避免了因為每批模板質(zhì)量的差異，給生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)化和產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性帶來的負(fù)面影響。
5、在批量生產(chǎn)等位基因階梯時，所用引物之一的5’端標(biāo)上熒光素后，便可得到可供熒光檢測的等位基因階梯。
但是上述的這種短串聯(lián)重復(fù)序列等位基因階梯的制備技術(shù)也存在著如下缺點1、因其步驟多而繁雜，制備過程耗時長，因而出錯幾率高；2、雖然通過分子克隆技術(shù)得到的模板其非特異性擴增產(chǎn)物遠(yuǎn)少于人基因組DNA擴增產(chǎn)物，但仍存在非特異性DNA片段(如質(zhì)粒DNA)的干擾，從而造成制備的等位基因階梯純度欠佳。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新的STR等位基因階梯的制備技術(shù)，該技術(shù)能批量生產(chǎn)出穩(wěn)定性能好、高純度的，既可用于銀染法，也可用于熒光法的等位基因階梯試劑，以及具有利用這種制備技術(shù)制備的等位基因階梯的分型試劑盒。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種新的STR等位基因階梯的制備技術(shù)，它包括以下步驟從人有核細(xì)胞中提取DNA；合成各位點的引物；利用提取的DNA和合成的引物對各STR位點進(jìn)行PCR反應(yīng)；電泳檢測擴增片段；將PCR產(chǎn)物用HPLC純化并將各等位基因(包括正鏈和負(fù)鏈)分離，分離后繼續(xù)分別進(jìn)行PCR擴增，以此類推，經(jīng)過多輪PCR反應(yīng)-HPLC分離純化，制取具有不同基因型的各等位基因；
將各等位基因經(jīng)電泳結(jié)合熒光自動檢測法檢測后，按等比例混合即成各位點的等位基因階梯，出產(chǎn)前再次進(jìn)行電泳檢測。
上述電泳系統(tǒng)可采用聚丙稀酰胺凝膠電泳或瓊脂糖凝膠電泳，及對等形式的電泳。
上述STR位點涉及人類46條染色體上的所有STR位點，即包括常染色體、X染色體及Y染色體上的STR位點。
上述引物可為熒光染料標(biāo)記的引物或非熒光染料標(biāo)記的引物，這些引物的長度為10～60堿基對。
在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種具有利用上述技術(shù)制備的等位基因階梯的分型試劑盒，它含有容器；一組或多組等位基因階梯；與各STR位點對應(yīng)的引物；DNA分子量參照標(biāo)準(zhǔn)；PCR反應(yīng)各組份；陽性對照DNA；試劑盒使用說明書。
本發(fā)明除具有現(xiàn)有技術(shù)的優(yōu)點外，還具有如下優(yōu)點1、無須反復(fù)收集具有不同基因型個體的血標(biāo)本，僅需一次性收集即可，省時省力；2、制作流程簡便，周期短，操作簡單；3、制作成本低，經(jīng)濟實用；4、適用面廣，所有能經(jīng)凝膠電泳分離的DNA片段本技術(shù)均實用；5、試劑盒能批量生產(chǎn)，穩(wěn)定性好，即可用銀染法，也可用熒光法進(jìn)行檢測。



圖1是本發(fā)明實施例1所述熒光引物TH01 AL檢測結(jié)果圖；圖中從左至右顯示TH01位點的6、7、8、9、9.3、10等位基因，共六個其分子量見圖下表格。
圖2是本發(fā)明實施例1所述非熒光引物TH01 AL檢測結(jié)果圖；圖中7、8、9、10泳道分別為第一、第二、三、四輪(PCR反應(yīng)-HPLC分離純化)所制備的等位基因階梯。由上至下顯示TH01位點的6、7、8、9、9.3、10等位基因，其中等位基因9.3和10因差一個堿基對，未充分分離，部分重疊，僅顯示5條泳帶。
圖3是本發(fā)明實施例2所述一種非熒光引物試劑盒容器分布圖；圖中1～7為DYS19、DYS388、DYS389、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393位點AL。8～14為DYS19、DYS388、DYS389、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393位點引物對。15為dNTPs，16為Taq Ploymerase，17為10×buffer，18為deoionizeddouble-distilled water，19為DNA分子量參照標(biāo)準(zhǔn)，20為陽性對照DNA。
圖4是本發(fā)明實施例2所述另一種非熒光引物試劑盒容器分布圖。圖中1為7個位點AL混合物，2為各位點引物對混合物，3為陽性對照DNA，4為dNTPs，5為Taq Ploymerase，6為10×buffer，7為deoionized double-distilled water，8為分子量參照物(ROX標(biāo)記)。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例進(jìn)一步地闡述本發(fā)明，這些實施例僅用于說明目的，而不用于限制本發(fā)明范圍。
實施例1以制備TH01位點等位基因階梯為例。
(1)、模板DNA的選擇及制備。本例選擇具有6/10、7/9、8/9.3基因型的個體各一個。這些個體的基因型均事先經(jīng)變性聚丙稀酰胺凝膠電泳結(jié)合熒光自動檢測法檢測基因型，并經(jīng)DNA測序驗證無誤。取靜脈血5～10ml，以常規(guī)有機溶劑法提取基因組DNA，具體方法詳見《法醫(yī)學(xué)雜志》1997；13(2)68-70頁公開的“擴增X-Y同源Amelogenin基因內(nèi)含子在性別鑒定中的應(yīng)用研究”文章。
(2)、模板DNA濃度的調(diào)定。用紫外分光光度計檢測DNA OD值，并將所有模板DNA濃度加適量TE液，調(diào)至5ng/ul。
(3)、PCR反應(yīng)。PCR引物序列見表1，取步驟(2)中模板各1ul(約5ng)分別置于不同擴增管中，進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)各組份見表2，PCR循環(huán)參數(shù)為95℃ 5min，93℃ 0.5min，62℃ 1min，72℃ 1min，30個循環(huán)，72℃5min。
表1 TH01位點引物序列


表2 PCR反應(yīng)各組份


(4)、電泳取PCR擴增產(chǎn)物1ul～3ul，具體方法詳見《中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志》2000；17(1)42～46頁公開的“中國廣州漢族人六個STR位點的調(diào)查”文章；《法醫(yī)學(xué)雜志》1999；15(3)141～3頁公開的“運用變性PAGE熒光檢測技術(shù)對廣州漢族人群六個STR位點的研究”文章；《法醫(yī)學(xué)雜志》1997；13(2)68-70頁公開的“擴增X-Y同源Amelogenin基因內(nèi)含子在性別鑒定中的應(yīng)用研究”文章。
(5)、單個等位基因的制備。電泳檢測擴增片段，再次復(fù)核各模板DNA的基因型，確認(rèn)無誤后，進(jìn)行大規(guī)模PCR擴增反應(yīng)，用高效液相色譜儀(HPLC)，分離并純化PCR產(chǎn)物，將分離純化的各個等位基因分裝于不同試管中，分別做好標(biāo)記，待用。
(6)、第一輪(PCR反應(yīng)-HPLC分離純化)。取步驟(4)中各等位基因約1ul，按步驟(3)、(4)進(jìn)行。
(7)、第二輪、第三輪、......、第n輪(PCR反應(yīng)-HPLC分離純化)。重復(fù)步驟(3)、(4)。在每一輪(PCR反應(yīng)-HPLC分離純化)中，均取部分分離純化的單個等位基因進(jìn)行下一輪的(PCR反應(yīng)-HPLC分離純化)，取部分分離純化的單個等位基因等體積混合做成等位基因階梯。
(8)、TH01 AL。將各等位基因等體積混合，取1ul～5ul混合物電泳檢測，檢查復(fù)核等位基因階梯包含各等位基因并確認(rèn)無誤，即成TH01位點的等位基因階梯，本例所做的TH01等位基因階梯包含有等位基因6、7、8、9、9.3、10共6個等位基因，見圖1和圖2。
實施例2以制作Y染色體STR分型試劑盒為例，本試劑盒包括7個Y染色體STR位點DYS19、DYS388、DYS389(I、II)、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393。這7個位點的PCR擴增產(chǎn)物、非熒光引物PCR循環(huán)參數(shù)、等位基因、擴增片段長度等情況見表3，非熒光引物PCR擴增反應(yīng)見表2，熒光引物PCR循環(huán)為94℃ 8min，(94℃ 60sec，55℃ 30sec，72℃ 30sec)*35個循環(huán)，72℃ 2min，熒光引物PCR擴增反應(yīng)見表4。
表3 7個Y-STR位點的PCR擴增引物、等位基因、擴增片段長度、PCR循環(huán)參數(shù)


表4 復(fù)合PCR反應(yīng)各組份


**注各引物濃度分別為DYS19 0.25uM、DYS388 0.5uM、DYS389 0.2uM、DYS390 0.25uM、DYS391 0.3uM、DYS392 0.3uM、DYS 0.5uM。
本試劑盒包括以下組成成分(1)、容器分布見圖3及圖4；(2)、STR等位基因階梯；按實施例1分別制作各位點等位基因，一組或多組STR等位基因階梯(熒光染料標(biāo)記的混合物為一管，非熒光染料標(biāo)記分別設(shè)置為若干為管)；(3)、DNA分子量參照標(biāo)準(zhǔn)使用非熒光引物的試劑盒使用50bp marker，使用熒光引物的試劑盒使用ROX熒光染料標(biāo)記的分子量參照物。
(4)、PCR反應(yīng)各組分。①各STR位點引物(熒光染料標(biāo)記的或非熒光染料標(biāo)記，若為前者可按一定比例混合)參照表3，②dNTPs，③Taq Polymerase，④10×buffer100mM Tris-HCl，pH8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、10％Triton-X-100；⑤deoionized double-distilled water；(5)、陽性對照DNA；(6)、試劑盒使用說明書，包括各引物序列、PCR反應(yīng)條件、電泳系統(tǒng)等，并配有相應(yīng)的軟件。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨引用參考一樣。此外，應(yīng)理解，本發(fā)明是結(jié)合最佳實施例進(jìn)行描述的，然而在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落入本申請所附權(quán)利要求
書所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.一種新的STR等位基因階梯的制備技術(shù)，其特征是它包括以下步驟從人有核細(xì)胞中提取DNA；合成各位點的引物；利用提取的DNA和合成的引物對各STR位點進(jìn)行PCR反應(yīng)；電泳檢測擴增片段；將PCR產(chǎn)物用HPLC純化并將各等位基因(包括正鏈和負(fù)鏈)分離，分離后繼續(xù)分別進(jìn)行PCR擴增，以此類推，經(jīng)過多輪PCR反應(yīng)-HPLC分離純化，制取具有不同基因型的各等位基因；將各等位基因經(jīng)電泳結(jié)合熒光自動檢測法檢測后，按等比例混合即成各位點的等位基因階梯，出產(chǎn)前再次進(jìn)行電泳檢測。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的一種新的STR等位基因階梯的制備技術(shù)，其特征是所述電泳系統(tǒng)可采用聚丙稀酰胺凝膠電泳或瓊脂糖凝膠電泳，及對等形式的電泳。
3.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的一種新的STR等位基因階梯的制備技術(shù)，其特征是STR位點涉及人類46條染色體上的所有STR位點，即包括常染色體、X染色體及Y染色體上的STR位點。
4.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的一種新的STR等位基因階梯的制備技術(shù)，其特征是引物可為熒光染料標(biāo)記的引物或非熒光染料標(biāo)記的引物，這些引物的長度為10～60堿基對。
5.一種具有利用根據(jù)權(quán)利要求
1所述的一種新的STR等位基因階梯的制備技術(shù)制備的等位基因階梯的分型試劑盒，其特征是它含有容器；一組或多組等位基因階梯；與各STR位點對應(yīng)的引物；DNA分子量參照標(biāo)準(zhǔn)；PCR反應(yīng)各組份；陽性對照DNA；試劑盒使用說明書。
專利摘要
本發(fā)明提供了一種新的STR(短串聯(lián)重復(fù)序列，short tandem repeat，)等位基因階梯(allele ladder，AL)的制備技術(shù)，它包括從人有核細(xì)胞中提取DNA，合成對應(yīng)于這些STR位點的引物，選擇具有不同等位基因個體的DNA，利用PCR技術(shù)特異地擴增出對應(yīng)的擴增產(chǎn)物，采用HPLC技術(shù)純化分離擴增產(chǎn)物，并多次循環(huán)地進(jìn)行PCR擴增→純化→PCR擴增→純化，最后將各STR位點具有不同等位基因的純化產(chǎn)物按等比例混合，即成各STR AL。本發(fā)明還提供了一種具有利用這種技術(shù)制備的等位基因階梯的分型試劑盒。本發(fā)明所述的制備技術(shù)和分型試劑盒可用于法醫(yī)學(xué)、人類學(xué)、遺傳學(xué)和疾病等領(lǐng)域的個體識別、親子鑒定以及基因診斷等方面。
文檔編號C12N15/10GKCN1446921SQ02114017
公開日2003年10月8日 申請日期2002年3月25日
發(fā)明者江斌 申請人:江斌導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan