專利名稱:用于改變的蛋白質(zhì)產(chǎn)生的具有失活蛋白酶基因的絲狀真菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及改造為具有一個(gè)或多個(gè)失活蛋白酶基因以便產(chǎn)生改變的蛋白質(zhì)產(chǎn)生 的絲狀真菌微生物，如曲霉屬(Aspergillus)物種。
背景技術(shù)：
遺傳工程已允許在用作工業(yè)生物反應(yīng)器、細(xì)胞工廠的微生物，以及用于食品發(fā)酵 的微生物中的改進(jìn)。由改造的微生物產(chǎn)生的重要的酶和蛋白質(zhì)包含葡糖淀粉酶、α-淀粉 酶、纖維素酶、中性蛋白酶和堿性(或絲氨酸)蛋白酶、激素和抗體。但是，蛋白質(zhì)降解和修 飾在一些遺傳改造系統(tǒng)中的發(fā)生可干擾有效的產(chǎn)生。
已改造絲狀真菌(例如曲霉屬和木霉屬(Trichoderma)物種)和某些細(xì)菌(例如 芽孢桿菌屬(Bacillus)物種)來產(chǎn)生和分泌大量有用的蛋白質(zhì)和代謝產(chǎn)物(見例如Bio/ Technol. 5 :369_376，713-719 和 1301-1304 [1987]和 Doi 和McGlouglin (編輯)Biology of Bacilli !Applications to Industry, Butterworth-Heinemann, Stoneham. Mass 311—337 頁[1992]中白勺 Zukowski，"Production of commercially valuable products，，)。
WO 97/22705涉及不產(chǎn)生某些蛋白酶且可以用作易被通常產(chǎn)生的蛋白酶蛋白水解 降解的蛋白質(zhì)產(chǎn)生的宿主真菌，其在此引入本文作為參考。
美國(guó)專利號(hào)5，840，570和6，509，171涉及天冬氨酸蛋白質(zhì)基因缺乏的突變絲狀真 菌，其是用于產(chǎn)生如凝乳酶的異源多肽的宿主，每個(gè)該專利在此引入本文作為參考。
美國(guó)專利申請(qǐng)公開號(hào)2006/0M6545涉及具有對(duì)應(yīng)于derA、derB、htmA、mnn9、 mnnlO、ochA、dpp4、dpp5、ρ印Aa、ρ印Ab、ρ印Ac、ρ印Ad、ρ印F及其組合的失活染色體基因的 重組絲狀真菌細(xì)胞，其在此引入本文作為參考。
發(fā)明概述
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含至少一個(gè)失活基因的絲狀真菌細(xì)胞，其中失 活基因選自apSB、apSB同源物、cpSA、cpSA同源物及其組合。在一些實(shí)施方案中，失活基因 是cpsA同源物，其中該同源物與SEQ ID NO :1具有至少85%序列同一性，或編碼與SEQ ID NO 2具有至少85%序列同一性的多肽。在一些實(shí)施方案中，失活基因是apsB同源物，其 中該同源物與SEQ ID NO :9具有至少85%序列同一性，或編碼與SEQ ID N0:10具有至少 85%序列同一性的多肽。在一些實(shí)施方案中，失活基因是cpsA (SEQ ID N0:1)或apsB(SEQ ID NO 9)。
在一些實(shí)施方案中，失活基因編碼胞內(nèi)蛋白質(zhì)，其中該胞內(nèi)蛋白質(zhì)涉及蛋白質(zhì)降 解和修飾(例如蛋白酶基因、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)降解途徑基因和糖基化基因)。在具體實(shí)施方案 中，由失活基因編碼的胞內(nèi)蛋白質(zhì)是N端蛋白酶(例如氨肽酶，如apsB)或胞內(nèi)C端蛋白酶(例如羧肽酶)。
在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的絲狀真菌細(xì)胞包含編碼分泌性蛋白質(zhì)(如蛋白酶) 的失活基因。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的絲狀真菌細(xì)胞是來自選自曲霉屬物種、根霉屬物種 (Rhizopus sp.)、木霉屬物種和毛霉屬物種(Mucor sp.)的絲狀真菌的細(xì)胞。在一個(gè)方面 中，絲狀真菌是選自米曲霉(A.oryzae)、黑曲霉(A. niger)、泡盛曲霉(A. awamori)、構(gòu)巢曲 霉(A. nidulans)、醬油曲霉(A. sojae)、日本曲霉(A. japonicus)、河內(nèi)曲霉(A. kawachi)和 棘孢曲霉(A. aculeatus)的曲霉屬物種。
在一些實(shí)施方案中，絲狀真菌細(xì)胞包含至少選自apSB、apSB同源物、cpSA、cpSA同 源物的第一失活基因禾口選自 apsB、cpsA、derA、derB、htmA、mnn9、mnnlO、ochA、dpp4、dpp5、 ρ印Aa、ρ印Ab、ρ印Ac、ρ印AcU ρ印B、ρ印C、ρ印D、ρ印F及其同源物的第二失活基因。在一個(gè) 方面中，第二失活基因選自apsB、cpsA、dpp4、dpp5及其同源物。
在一些實(shí)施方案中，通過用選擇標(biāo)記基因破壞(disruption)來失活該失活基因。 因此，在一些實(shí)施方案中，絲狀真菌細(xì)胞還包含插入該失活基因的核酸序列編碼區(qū)中的編 碼選擇標(biāo)記基因的核酸序列。在一些實(shí)施方案中，選擇標(biāo)記基因是amdS。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的絲狀真菌細(xì)胞還產(chǎn)生內(nèi)源蛋白質(zhì)，其中該細(xì)胞內(nèi) 源蛋白質(zhì)的產(chǎn)生比對(duì)應(yīng)的絲狀真菌細(xì)胞親本菌株中內(nèi)源蛋白質(zhì)的產(chǎn)生高至少約0%至約 200% (或更多)。因此，在一些實(shí)施方案中，內(nèi)源蛋白質(zhì)的產(chǎn)生比對(duì)應(yīng)的絲狀真菌細(xì)胞親本 菌株中內(nèi)源蛋白質(zhì)的產(chǎn)生高至少約0 %至100 %，在一些實(shí)施方案中高至少約10 %至60 %， 包含其中產(chǎn)生高至少約10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%和55%的實(shí)施 方案。在一些實(shí)施方案中，內(nèi)源蛋白質(zhì)是生糖酶(glucogenic enzyme)或選自α-淀粉酶、 纖維素酶、葡糖淀粉酶、漆酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶的酶。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的絲狀真菌細(xì)胞還包含編碼異源蛋白質(zhì)的核酸。在一 些實(shí)施方案中，此異源蛋白質(zhì)的產(chǎn)生相對(duì)于對(duì)應(yīng)的絲狀真菌細(xì)胞親本菌株中相同蛋白質(zhì)的 產(chǎn)生被改變。在一些實(shí)施方案中，異源蛋白質(zhì)是酶，尤其是選自α-淀粉酶、纖維素酶、葡糖 淀粉酶、漆酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶的酶。在其他實(shí)施方案中，異源蛋白質(zhì)選自蛋白酶 抑制劑、抗體或抗體片段。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明絲狀真菌細(xì)胞異源蛋白質(zhì)的產(chǎn)生比對(duì)應(yīng)的絲狀真菌細(xì) 胞親本菌株中異源蛋白質(zhì)的產(chǎn)生高至少約0%至約200% (或更多)。因此，在一些實(shí)施 方案中，異源蛋白質(zhì)的產(chǎn)生比對(duì)應(yīng)的絲狀真菌細(xì)胞親本菌株中異源蛋白質(zhì)的產(chǎn)生高至少約 0 %至100 %，在一些實(shí)施方案中高至少約10 %至60 %，包含其中產(chǎn)生高至少約10 %、15 %、 20%、25%、30%、；35%、40%、45%、50%和55%的實(shí)施方案。此外，在一些實(shí)施方案中，本發(fā) 明的絲狀真菌細(xì)胞的總細(xì)胞干重由于比對(duì)應(yīng)的絲狀真菌細(xì)胞親本菌株的總細(xì)胞干重低約 25%、20%、15%、10%、5%或更少而不同。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含至少一個(gè)失活基因的絲狀真菌細(xì)胞，其中 該失活基因編碼胞內(nèi)蛋白質(zhì)，且其中該細(xì)胞的至少一種其他蛋白質(zhì)的產(chǎn)生比對(duì)應(yīng)的絲狀真 菌細(xì)胞親本菌株中其他蛋白質(zhì)的產(chǎn)生高至少約10%至60% (包含至少約10%、15%、20%、 25%、30%、35%、40%、45%、50%和55% )(或更多)。其產(chǎn)生提高的其他蛋白質(zhì)可以是內(nèi) 源(即天然)蛋白質(zhì)或異源蛋白質(zhì)，和/或可以是胞內(nèi)蛋白質(zhì)或分泌性蛋白質(zhì)。[0020]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含至少一個(gè)失活基因的絲狀真菌細(xì)胞，其中 一個(gè)或多個(gè)內(nèi)源和/或異源目的蛋白質(zhì)的產(chǎn)生比絲狀真菌對(duì)應(yīng)的親本菌株中內(nèi)源和/或異 源蛋白質(zhì)的產(chǎn)生低至少約0%至100%或甚至更低。在一些實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)的產(chǎn)生比對(duì) 應(yīng)的親本菌株中一個(gè)或多個(gè)內(nèi)源和/或異源蛋白質(zhì)的產(chǎn)生低至少約10%至60%，包含其中 產(chǎn)生低至少約 10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%和 55%的實(shí)施方案。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法，其中所述方法包括 (a)將編碼蛋白質(zhì)的核酸引入絲狀真菌細(xì)胞，其中所述細(xì)胞包含至少一個(gè)失活基因，其中失 活基因選自apSB、apSB同源物、cpSA、cpSA同源物及其組合；和(b)在適合于產(chǎn)生該蛋白質(zhì) 的條件下培養(yǎng)細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，該方法還包括回收該蛋白質(zhì)。
本發(fā)明用于產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法可以使用任意真菌細(xì)胞，且在一些實(shí)施方案中，可 以使用本文所公開的任意絲狀真菌細(xì)胞。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供產(chǎn)生用于蛋白質(zhì)產(chǎn)生的絲狀真菌菌株的方法， 其中所述方法包括(a)用破壞序列轉(zhuǎn)化絲狀真菌細(xì)胞，其中該破壞序列包含至少一個(gè)選 自apSB、apSB同源物、cpSA、cpSA同源物及其組合的失活基因；和(b)選擇其中所述破壞序 列在染色體上整合的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。
本發(fā)明的產(chǎn)生用于蛋白質(zhì)產(chǎn)生的絲狀真菌菌株的方法可以使用本文所公開的任 意絲狀真菌細(xì)胞實(shí)施方案。
在產(chǎn)生用于蛋白質(zhì)產(chǎn)生的絲狀真菌菌株的方法的一些實(shí)施方案中，破壞序列包含 在失活基因的編碼區(qū)序列中的限制位點(diǎn)處反向插入的選擇標(biāo)記基因序列。在此方法的一些 實(shí)施方案中，該選擇標(biāo)記基因是amdS。在一些實(shí)施方案中，該限制位點(diǎn)包含失活基因中一個(gè) 以上的位點(diǎn)。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含基因破壞序列的線性化破壞質(zhì)粒片段，其中 該基因選自cpsA、cpsA同源物、apsB和apsB同源物，其中破壞序列包含在該基因的編 碼區(qū)序列中的限制位點(diǎn)處反向插入的選擇標(biāo)記基因序列。在一些實(shí)施方案中，該基因是 cpsA(SEQ ID NO :1)。在一些實(shí)施方案中，該基因是cpsA同源物，其中該同源物與SEQ ID NO :1具有至少85%序列同一性，或編碼與SEQ ID NO :2具有至少85%序列同一性的多肽。 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供其中破壞序列與SEQ ID NO :8具有至少95%同一性(或更 多)的線性化破壞質(zhì)粒片段。在一些實(shí)施方案中，該基因是apsB (SEQ ID NO :9)。在一些 實(shí)施方案中，該基因是apsB同源物，其中該同源物與SEQ ID NO :9具有至少85%序列同一 性，或編碼與SEQ ID NO :10具有至少85%序列同一性的多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明 提供其中破壞序列與SEQ ID NO :15具有至少95%同一性(或更多)的線性化破壞質(zhì)粒片 段。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含基因破壞序列的載體，其中該基因選自 cpsA、cpsA同源物、apsB和apsB同源物，其中破壞序列包含在該基因編碼區(qū)序列中的限制 位點(diǎn)處反向插入的選擇標(biāo)記基因序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，該載體包含與SEQ ID N0:8具 有至少95%同一性(或更多)的破壞序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該載體包含與SEQ ID NO 15具有至少95%同一性(或更多)的破壞序列。
在另一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及產(chǎn)生重組絲狀真菌細(xì)胞的方法，其包括將與選自 apsB、cpsA、其同源序列及其組合的染色體基因重組的DNA構(gòu)建體引入絲狀真菌細(xì)胞，由此失活染色體基因。在一些實(shí)施方案中，該失活基因被破壞，在其他實(shí)施方案中，該失活基因 被刪除。
在其他方面中，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生絲狀真菌細(xì)胞失活突變體的DNA構(gòu)建體，其 中該DNA構(gòu)建體包含被間插基因序列破壞的apsB、cpsA、其同源序列及其組合的部分基因 序列。
附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示黑曲霉(Aspergillus niger) cpsA基因的2188bp基因組DNA序列(SEQ ID NO :1)。
圖2顯示由SEQ ID NO 1的黑曲霉cpsA基因組DNA序列編碼的552個(gè)氨基酸的 序列(SEQ ID NO :2)。
圖3顯示用于制備失活cpsA菌株的Wl擴(kuò)增子的DNA序列(SEQ IDNO 12)。
圖4顯示通過NruI限制酶線性化并用來轉(zhuǎn)化黑曲霉以產(chǎn)生cpsA失活菌株AcpsA 的pBS Δ cpsA-amd破壞質(zhì)粒的質(zhì)粒圖。
圖5顯示通過NruI限制酶線性化并用來轉(zhuǎn)化黑曲霉菌株GICC2733的 pBS Δ cpsA-amd破壞質(zhì)粒部分的DNA序列(SEQ ID NO 8)。
圖6顯示電泳凝膠的圖像，其顯示來自失活菌株Δ cpsA的染色體DNA的PCR擴(kuò)增 后1378bp擴(kuò)增子的存在。泳道1 :100bp DNA梯標(biāo)記；泳道2 黑曲霉AcpsA菌株的染色體 DNA用作擴(kuò)增模板；泳道3 黑曲霉Δ dpp4/ Δ dpp5菌株的染色體DNA用作擴(kuò)增模板。
圖7顯示黑曲霉氨肽酶基因apsB的3352bp基因組DNA序列(SEQID NO 9)。
圖8顯示由SEQ ID NO :9的apsB基因組DNA序列編碼的881個(gè)氨基酸的序列(SEQ ID NO 10)。
圖9顯示用于制備失活apsB菌株的W2擴(kuò)增子的DNA序列(SEQ IDNO 14)。
圖10顯示通過HindIII和PvuII限制酶線性化并用來轉(zhuǎn)化黑曲霉以產(chǎn)生apsB失 活菌株Δ apsB的pBS Δ apsB-amdS破壞質(zhì)粒的質(zhì)粒圖。
圖11顯示通過HindIII和PvuII限制酶線性化并用來轉(zhuǎn)化黑曲霉菌株GICC2733 的pBS Δ apsB-amdS破壞質(zhì)粒部分的DNA序列(SEQ IDNO 15)。
圖12顯示電泳凝膠的圖像，其顯示來自失活菌株AapsB的染色體DNA的PCR擴(kuò)增 后1604bp擴(kuò)增子的存在。泳道1 IOObp DNA梯標(biāo)記；泳道2 黑曲霉AapsB菌株克隆#28 的染色體DNA用作擴(kuò)增模板；泳道3 黑曲霉AapsB菌株克隆#87的染色體DNA用作擴(kuò)增 模板；泳道4 黑曲霉AapsB菌株克隆#93的染色體DNA用作擴(kuò)增模板；泳道3 黑曲霉的 對(duì)應(yīng)親本菌株的染色體DNA用作擴(kuò)增模板。
發(fā)明詳述
本發(fā)明涉及具有一個(gè)或多個(gè)失活蛋白酶基因的重組絲狀真菌細(xì)胞，如曲霉屬細(xì) 胞。在一些實(shí)施方案中，失活基因?qū)е陆z狀真菌細(xì)胞產(chǎn)生其他異源或內(nèi)源蛋白質(zhì)的能力的 改變。在一些實(shí)施方案中，具有一個(gè)或多個(gè)失活基因的細(xì)胞以比對(duì)應(yīng)的絲狀真菌細(xì)胞親本 菌株(即非失活菌株)相同蛋白質(zhì)的產(chǎn)生高至少約10%至約60% (或更多)的量產(chǎn)生異 源或內(nèi)源蛋白質(zhì)。
I.定義
本文提到的所有專利和出版物，包含這類專利和出版物中公開的所有序列明確引用作為參考。除非本文另作定義，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所 屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員的通常理解相同的意義(見例如Singleton等，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology,第二版，John Wiley 禾口 Sons, New York [1994]； 禾口 Hale 禾口 Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology, Harper Perennial, NY[1991]，二者都向技術(shù)人員提供了本文所用許多術(shù)語的一般字典)。類似或等同于本文所 述的多種實(shí)施方案的任意方法和材料可以用于實(shí)施或測(cè)試本發(fā)明。
此說明書中公開的每個(gè)最大(或最小)數(shù)字限制旨在包含每個(gè)較低(或較高)的 數(shù)字限制，就如同已在本文中明確地寫出這類較低(或較高)的數(shù)字限制。此外，本說明書 中公開的每個(gè)數(shù)字范圍旨在包含落在這種較寬的數(shù)字范圍中的每個(gè)較窄的數(shù)字范圍，就如 同已在本文中明確地寫出這類較窄的數(shù)字范圍。
如本文所用，除非文中清楚地另作指定，單數(shù)形式“一個(gè)”、“所述”和“該”包含復(fù) 數(shù)指示物。因此，例如提到一個(gè)“宿主細(xì)胞”包含多個(gè)這類宿主細(xì)胞。
除非另作指定，分別以5'至3'的方向從左向右書寫核酸；以氨基至羧基的方向 從左向右書寫氨基酸序列。本文給出的標(biāo)題不是對(duì)可通過參考說明書整體而得到的本發(fā)明 的多個(gè)方面或?qū)嵤┓桨傅南拗啤Ｒ虼?，下文即將定義的術(shù)語通過參考說明書整體而得到更 充分的定義。
本文所用的術(shù)語“失活”指基本上阻止一個(gè)或多個(gè)基因及其片段或同源物的功能 性表達(dá)的任意方法，其中該基因或基因產(chǎn)物不能發(fā)揮其已知功能。它旨在包含含有刪除、蛋 白質(zhì)編碼序列的破壞、插入、添加、突變、基因沉默(例如RNAi基因反義)等的任意基因失 活方法。因此，術(shù)語“失活的”指上文所述“失活”的結(jié)果。在一些實(shí)施方案中，“失活”將產(chǎn) 生無可檢測(cè)到的對(duì)應(yīng)于失活基因的基因或基因產(chǎn)物的活性的細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，“失 活”可以產(chǎn)生少量或無基因的功能性表達(dá)，但仍然具有該基因同源物的功能性表達(dá)。因此， “失活菌株”可以顯示由同源基因引起的部分活性表型。
如本文所用，“失活突變體”或“失活菌株”指具有一個(gè)或多個(gè)失活基因的宿主生物 (例如黑曲霉細(xì)胞)。該術(shù)語旨在包含失活突變體或失活菌株的子代，且不限于經(jīng)受最初的 失活方法的細(xì)胞(例如最初轉(zhuǎn)化的細(xì)胞)。
在一些實(shí)施方案中，“失活”是基因刪除的結(jié)果，有時(shí)將這些失活突變體稱為“刪除 突變體”。在其他實(shí)施方案中，失活是基因的蛋白質(zhì)編碼序列被破壞的結(jié)果，有時(shí)將這些失 活突變體稱為“破壞突變體”。在一些實(shí)施方案中，失活是不可回復(fù)的。
如本文所用，基因的“刪除”指整個(gè)編碼序列的刪除、部分編碼序列的刪除或包含 側(cè)翼區(qū)的編碼序列的刪除。
如本文所用，“破壞”指與親本序列或天然存在的序列相比，分別在核苷酸或氨基 酸序列中插入一個(gè)或多個(gè)核苷酸或氨基酸殘基的變化。因此，如本文所用，“破壞序列”或 “破壞突變體”指包含核苷酸或氨基酸插入的核酸或氨基酸序列(通常是編碼區(qū)序列)。
如本文所用，“插入”或“添加”在序列的背景中指核酸或氨基酸序列中的變化，其 中與內(nèi)源染色體序列或蛋白質(zhì)產(chǎn)物相比，加入了 一個(gè)或多個(gè)核苷酸或氨基酸殘基。
如本文所用，“不可回復(fù)的”指將以低于10_7的頻率自然回復(fù)為其對(duì)應(yīng)的親本菌株 的菌株。
本文所用的術(shù)語“對(duì)應(yīng)的親本菌株”指從其產(chǎn)生失活突變體的宿主菌株(例如最初的和/或野生型的菌株)。
如本文所用，“菌株生存力”指生殖生存力。在一些實(shí)施方案中，基因的失活并非有 害地影響失活突變體在實(shí)驗(yàn)室條件下的分裂和存活。
如本文所用，“編碼區(qū)”指編碼蛋白質(zhì)氨基酸序列的基因區(qū)域。
如本文所用，“氨基酸”指多肽或蛋白質(zhì)序列或其部分。術(shù)語“蛋白質(zhì)”、“肽”和“多 肽”可互換使用。
本文所用的術(shù)語“異源蛋白質(zhì)”或“外源蛋白質(zhì)”指并非天然存在于宿主細(xì)胞中的 蛋白質(zhì)或多肽，包含天然存在的內(nèi)源蛋白質(zhì)的遺傳改造形式。
如本文所用，“內(nèi)源蛋白質(zhì)”或“天然蛋白質(zhì)”指天然存在于細(xì)胞中的蛋白質(zhì)或多肽。
如本文所用，“宿主”、“宿主細(xì)胞”或“宿主菌株”指可以表達(dá)引入該細(xì)胞中的DNA 序列的細(xì)胞。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是曲霉屬物種。
如本文所用，“絲狀真菌細(xì)胞”指生長(zhǎng)為多細(xì)胞菌絲鏈的任意微觀真菌物種的細(xì) 胞，包含但不限于曲霉屬物種、根霉屬物種、木霉屬物種和毛霉屬物種。
如本文所用，“曲霉屬，，或“曲霉屬物種，，包含如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的“曲霉屬，， 這個(gè)屬內(nèi)的所有物種，包含但不限于黑曲霉、米曲霉、泡盛曲霉、河內(nèi)曲霉和構(gòu)巢曲霉。
如本文所用，“核酸”指核苷酸或多核苷酸序列及其片段或部分，以及基因組或合 成來源的DNA、cDNA和RNA，其可以是雙鏈或單鏈，代表有義鏈或反義鏈。應(yīng)理解，由于遺傳 密碼的簡(jiǎn)并性，大量核苷酸序列可以編碼給定的蛋白質(zhì)。
本文所用的術(shù)語“基因”指涉及產(chǎn)生多肽的DNA區(qū)段，可以包含編碼區(qū)之前和之 后的區(qū)域(例如啟動(dòng)子、終止子、5'非翻譯序列(5‘ UTR)或前導(dǎo)序列和3'非翻譯序列 (3' UTR)或尾隨序列，以及單個(gè)編碼區(qū)段(外顯子)之間的間插序列(內(nèi)含子))。
如本文所述，“同源基因”、“基因同源物”或“同源物”指具有同源序列和產(chǎn)生具有 相同或相似功能的蛋白質(zhì)的基因。該術(shù)語包含通過物種形成(即新物種的發(fā)生)分離的基 因(例如直向同源基因)，以及已通過遺傳復(fù)制分離的基因(例如共生同源基因)。
如本文所用，“同源序列，，指通過最佳比對(duì)進(jìn)行比較時(shí)，與對(duì)象核苷酸或氨基酸序 列具有至少約99%、至少約98%、至少約97%、至少約96%、至少約95%、至少約94%、至 少約93 %、至少約92 %、至少約91%、至少約90 %、至少約88 %、至少約85 %、至少約80 %、 至少約75%、至少約70%或至少約60%序列同一性的核酸或多肽序列。在一些實(shí)施方案 中，同源序列具有約80%和100%之間的序列同一性，在一些實(shí)施方案中具有約90%和 100%之間的序列同一性，在一些實(shí)施方案中具有約95%和100%之間的序列同一性。
可以使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(見例如Smith和Waterman，Adv. App 1. Math.，2 :482[1981] ；Needleman 禾口 ffunsch, J.Mol. Biol. ,48 :443[1970] ；Pearson 和 Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 :2444 [1988]；諸如 Wisconsin Genetics Software Package (Genetics Computer Group, Madison, WI)中的 GAP、BESTFIT、FASTA 和 TFASTA 的 程序；和 Devereux 等，Nucl. Acid Res. , 12 :387-395 [1984])測(cè)定序列同源性。
用于測(cè)定序列同源性的算法包含=PILEUP和BLAST(Altschul等，J. Mol. Biol.， 215 :403-410, [1990]；和 Karlin 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA90 :5873-5787 [1993])。 PILEUP 使用 Feng 禾口 Doolittle 的漸進(jìn)比對(duì)法(progressive alignment method) (Feng 禾口Doolittle, J. Mol. Evol. ,35 =351-360 [1987])的簡(jiǎn)化方法。該方法類似于Higgins 和 Sharp 所描述的方法(Higgins和Sharp，CABIOS 5 :151_153[1989])。有用的PILEUP參數(shù)包含默 認(rèn)空位權(quán)重3. 00、默認(rèn)空位長(zhǎng)度權(quán)重0. 10和加權(quán)的末端空位。
WU-BLAST-2 程序(見 Altschul 等，Meth. Enzymol.，266 :460-480 [1996])是尤其 有用的BLAST程序。WU-BLAST-2使用幾個(gè)搜索參數(shù)，其中大多數(shù)設(shè)置為默認(rèn)值。用以下值 設(shè)置可調(diào)節(jié)參數(shù)重疊跨度(overlap span) = 1，重疊分?jǐn)?shù)(overlap fraction) = 0. 125， 字串閾值(word threshold)⑴=11。HSP S和HSP S2參數(shù)是動(dòng)態(tài)值，其由程序自身根據(jù) 具體序列的組成和針對(duì)其搜索目的序列的具體數(shù)據(jù)庫的組成來建立。但是，可以調(diào)節(jié)數(shù)值 來提高敏感性。通過匹配的相同殘基數(shù)除以比對(duì)區(qū)中“較長(zhǎng)”序列的總殘基數(shù)來測(cè)定百分 比氨基酸序列同一性的值?！拜^長(zhǎng)”序列是在比對(duì)區(qū)中具有最多的真實(shí)殘基的序列(忽略由 WU-Blast-2引入以最大化比對(duì)評(píng)分的空位)。
本文所用的術(shù)語“載體”指可以在細(xì)胞中復(fù)制且可以攜帶新基因或DNA區(qū)段進(jìn)入 細(xì)胞的任意核酸。因此，該術(shù)語指涉及用于在不同宿主細(xì)胞之間轉(zhuǎn)移的核酸構(gòu)建體?！氨磉_(dá) 載體”指具有在細(xì)胞中摻入和表達(dá)異源DNA片段(即非天然DNA)的能力的載體。許多原核 和真核表達(dá)載體是市售的。適合的表達(dá)載體的選擇屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員的技能。
本文所用的術(shù)語“DNA構(gòu)建體”、“表達(dá)盒”和“表達(dá)載體”指通過重組或合成產(chǎn)生 的，具有允許具體核酸在靶細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的一系列特定的核酸元件(即如上文所述的載體或 載體元件)的核酸分子。例如，可以將表達(dá)盒摻入質(zhì)粒、染色體、線粒體DNA、質(zhì)體DNA、病毒 或核酸片段。通常，表達(dá)載體的表達(dá)盒部分包含待轉(zhuǎn)錄的核酸序列、啟動(dòng)子和終止子等。在 一些實(shí)施方案中，DNA構(gòu)建體也包含允許具體核酸在靶細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的一系列特定的核酸元 件。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的DNA構(gòu)建體包含選擇標(biāo)記。
還本文所用的術(shù)語“DNA構(gòu)建體”(以及“轉(zhuǎn)化DNA”和“轉(zhuǎn)化序列”)指用來將序 列引入宿主細(xì)胞或生物(即“轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞”)的DNA?？梢酝ㄟ^PCR或任意其他適合的 技術(shù)在體外產(chǎn)生DNA構(gòu)建體。在一些實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)化DNA可以包含進(jìn)入序列(incoming sequence)和/或可以包含側(cè)翼具有同源盒的進(jìn)入序列。還在另一個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)化DNA 包含連接至末端的其他非同源序列(例如填充序列或側(cè)翼序列)?？梢苑忾]末端以使轉(zhuǎn)化 DNA形成封閉的環(huán)(即質(zhì)粒)，例如插入載體中。
本文所用的術(shù)語“質(zhì)?！敝赣米骺寺≥d體的環(huán)狀雙鏈(ds)DNA構(gòu)建體，其在許多細(xì) 菌和一些真核生物中形成染色體外自主復(fù)制的遺傳元件。在一些實(shí)施方案中，質(zhì)粒摻入宿 主細(xì)胞的基因組。
本文所用的術(shù)語“分離的”和“純化的”用來指從至少一種其天然結(jié)合的成分移出 的分子(例如核酸或多肽)或其他成分。
本文所用的術(shù)語“改變的表達(dá)”解釋為包含改變的(即改造的)細(xì)胞株目的蛋白 質(zhì)的產(chǎn)生相對(duì)于來自對(duì)應(yīng)的未改變的親本菌株的正常產(chǎn)生水平的提高或降低(即在基本 上相同的條件下培養(yǎng)時(shí))。
本文所用的術(shù)語“增強(qiáng)的表達(dá)”解釋為包含改變的(即改造的)細(xì)胞株目的蛋白 質(zhì)的產(chǎn)生在來自對(duì)應(yīng)的未改變的親本菌株的正常產(chǎn)生水平之上的增加(即在基本上相同 的條件下培養(yǎng)時(shí))。
本文所用的術(shù)語“表達(dá)”指通過其產(chǎn)生多肽的過程。該過程包含基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯二者。在一些實(shí)施方案中，該過程還包含多肽的分泌。
如本文所用，在“將核酸序 列引入細(xì)胞”的背景中，術(shù)語“引入”(和過去式的“已引 入”)指適合用于將核酸序列轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)的任意方法，其包含但不限于轉(zhuǎn)化、電穿孔、核顯 微注射、轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)染(例如脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染和DEAE-糊精介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染)、與磷酸鈣DNA沉淀孵 育、用DNA包被的微粒高速轟擊、農(nóng)桿菌屬介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化和原生質(zhì)體融合。
本文所用的術(shù)語“穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的”指具有整合入其基因組或作為附加型質(zhì)粒維持至 少兩代的非天然(異源)多核苷酸序列的細(xì)胞。
如本文所用，“進(jìn)入序列”指被引入宿主細(xì)胞的DNA序列。進(jìn)入序列可以是DNA構(gòu) 建體的部分，可以編碼一種或多種目的蛋白質(zhì)(例如異源蛋白質(zhì))，可以是功能性或非功能 性基因和/或突變的或經(jīng)修飾的基因，和/或可以是選擇標(biāo)記基因。例如，進(jìn)入序列可以包 含選自 apsB、cpsA、derA、derB、htmA、mnn9、mnnlO、ochA、dpp4、dpp5、pepAa、pepAb、pepAc、 ρ印Ad、ρ印F、ρ印B、ρ印C、ρ印D、其片段和同源序列的基因的功能性或非功能性(例如破壞 的)形式。在一個(gè)實(shí)施方案中，進(jìn)入序列包含兩個(gè)同源盒。
如本文所用，“同源盒”指與絲狀真菌細(xì)胞染色體中的基因序列同源的核酸序列。 更具體地，同源盒是與緊鄰的基因編碼區(qū)側(cè)翼或待按照本發(fā)明失活的基因的部分具有約 80 %至100 %之間的序列同一性、約90 %至100 %之間的序列同一性或約95 %至100 %之間 的序列同一性的上游或下游區(qū)域。這些序列指定DNA構(gòu)建體或進(jìn)入序列在染色體中的何處 整合，并指定染色體的什么部分被DNA構(gòu)建體或進(jìn)入序列替代。雖然不意味著限制本發(fā)明， 但同源盒可以包含約1堿基對(duì)(bp)至200千堿基對(duì)(1Λ)之間。通常，同源盒包含約Ibp 和 10. Okb 之間、Ibp 和 5. Okb 之間、Ibp 和 2. 5kb 之間、Ibp 和 1. Okb 之間、0. 25kb 和 2. 5kb 之間。同源盒還可以包含約 10. Okb,5. Okb,2. 5kb、2. OkbU. 5kb、l. 0kb、0. 5kb、0. 25kb 和 0.11Λ。在一些實(shí)施方案中，選擇標(biāo)記的5'端和3'端側(cè)翼具有同源盒，其中同源盒包含緊 鄰基因編碼區(qū)側(cè)翼的核酸序列。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)化DNA序列包含無進(jìn)入序列存在的同源盒。在此實(shí)施方 案中，希望刪除兩個(gè)同源盒之間的內(nèi)源DNA序列。此外，在一些實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)化序列是野 生型序列，而在其他實(shí)施方案中，它們是突變體或經(jīng)修飾的序列。此外，在一些實(shí)施方案中， 轉(zhuǎn)化序列是同源的，而在其他實(shí)施方案中，它們是異源的。
本文所用的術(shù)語“靶序列”指宿主細(xì)胞中的DNA序列，其編碼希望進(jìn)入序列在該處 插入宿主細(xì)胞基因組的序列。在一些實(shí)施方案中，靶序列編碼功能性野生型基因或操縱子， 而在其他實(shí)施方案中，靶序列編碼功能性突變體基因或操縱子，或非功能性基因或操縱子。
如本文所用，“側(cè)翼序列”指所討論的序列上游或下游的任意序列(例如，對(duì)基因 A-B-C，基因B側(cè)翼為A和C基因序列)。在一些實(shí)施方案中，進(jìn)入序列在每一側(cè)側(cè)接同源 盒。在其他實(shí)施方案中，進(jìn)入序列和同源盒包含每一側(cè)側(cè)接填充序列的單位。在一些實(shí)施 方案中，側(cè)翼序列僅存在于單側(cè)上(3’或5’)，在其他實(shí)施方案中，其存在于被其包夾的序 列的每一側(cè)上。每個(gè)同源盒的序列與曲霉屬染色體中的序列同源。這些序列指定新構(gòu)建體 在曲霉屬染色體中的何處整合和曲霉屬染色體的什么部分將被進(jìn)入序列替代。在一些實(shí)施 方案中，這些序列指定新構(gòu)建體在沒有染色體的任何部分被進(jìn)入序列替代的情況下在曲霉 屬染色體中的何處整合。在一些實(shí)施方案中，選擇標(biāo)記的5'和3'端側(cè)接包含失活染色體 區(qū)段的節(jié)段的多核苷酸序列。在一些實(shí)施方案中，側(cè)翼序列僅存在于單側(cè)上(3’或5’)，在其他實(shí)施方案中，其存在于被其包夾的序列的每一側(cè)上。
本文所用的術(shù)語“在染色體上整合的”指已整合入宿主細(xì)胞染色體DNA的序列，通 常是突變體基因(例如天然基因的破壞形式)。通常，染色體整合經(jīng)由“同源重組”的過程 發(fā)生，其中引入(轉(zhuǎn)化)DNA的同源區(qū)與宿主染色體的同源區(qū)一起排列(align)。隨后，同源 區(qū)之間的序列在雙交換中被進(jìn)入序列替代。因此，“在染色體上整合的”在本文中可與“同 源重組的”或“同源整合的”互換使用。
本文所用的術(shù)語“可選擇標(biāo)記”和“選擇標(biāo)記”指能夠在宿主細(xì)胞中表達(dá)的核酸， 其允許方便地選擇包含該標(biāo)記的那些宿主。因此，術(shù)語“可選擇標(biāo)記”指提供宿主細(xì)胞已吸 收(例如已被用其成功地轉(zhuǎn)化)進(jìn)入的目的核酸(例如失活的基因)或一些其他反應(yīng)已 發(fā)生的指示的基因。通常，可選擇標(biāo)記是賦予宿主細(xì)胞抗微生物劑抗性或代謝優(yōu)勢(shì)，以允 許從在轉(zhuǎn)化過程中未接受任意外源序列的細(xì)胞區(qū)分包含外源DNA的細(xì)胞的基因。用于本發(fā) 明的選擇標(biāo)記包含但不限于抗微生物劑抗性標(biāo)記(例如ampR、phleoR、specR、kanR、eryR、 tetR、cmpR、hygroR 禾口 neoR ；見例如 Guerot—Fleury，Gene, 167 :335-337 [1995] ；Palmeros 等，Gene 247 :255-264 [2000]；和 Trieu-Cuot 等，Gene，23 :331-341 [1983])、營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo) 記(如色氨酸、PyrG和amdS)和檢測(cè)標(biāo)記(如β -半乳糖苷酶)。
“居留(residing)可選擇標(biāo)記”是定位在待轉(zhuǎn)化微生物的染色體上的可選擇標(biāo)記。 居留可選擇標(biāo)記編碼不同于轉(zhuǎn)化DNA構(gòu)建體上的可選擇標(biāo)記的基因。
本文所用的術(shù)語“啟動(dòng)子”指發(fā)揮功能來指導(dǎo)下游基因轉(zhuǎn)錄的核酸序列。在一些 實(shí)施方案中，啟動(dòng)子適合于在其中表達(dá)所希望的基因的宿主細(xì)胞。啟動(dòng)子與其他轉(zhuǎn)錄和翻 譯調(diào)節(jié)核酸序列(也稱為“控制序列”)一起是表達(dá)給定基因必需的。一般，轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào) 節(jié)序列包含但不限于啟動(dòng)子序列、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄起始和終止序列、翻譯起始和終止 序列和增強(qiáng)子或激活序列。
當(dāng)將其與其他核酸序列置于功能性關(guān)系中時(shí)，核酸被“有效連接”。例如，若編碼分 泌前導(dǎo)序列(即信號(hào)肽)的DNA表達(dá)為參與多肽分泌的前蛋白質(zhì)，則其有效連接至該多肽 的DNA ；若啟動(dòng)子或增強(qiáng)子影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄，則其有效連接至該序列；或者若核糖體結(jié) 合位點(diǎn)放置得便于促進(jìn)翻譯，則其有效連接至編碼序列。一般，“有效連接”指所連接的DNA 序列是緊鄰的，在分泌前導(dǎo)序列的情況下，所連接的DNA序列是緊鄰且處于閱讀相中的。但 是，增強(qiáng)子不必是緊鄰的。通過在方便的限制位點(diǎn)處連接來完成連接。若不存在這類位點(diǎn)， 則按照常規(guī)實(shí)施使用合成的寡核苷酸銜接物或接頭。
本文所用的術(shù)語“雜交”指核酸鏈通過本領(lǐng)域已知的堿基配對(duì)與其互補(bǔ)鏈連接的 過程。
若核酸序列與參考核酸序列在中度到高度嚴(yán)格的雜交和漂洗條件下特異性地彼 此雜交，則認(rèn)為這兩條序列“可選擇性雜交”。雜交條件以核酸結(jié)合復(fù)合物或探針的溶解溫 度(Tm)為基礎(chǔ)。例如，“最嚴(yán)格”通常發(fā)生在約Tm-5°C (探針的Tm以下5°C )；“高度嚴(yán)格” 在Tm以下約5-10°C ；“中度嚴(yán)格”在探針的Tm以下約10_20°C ；和“低度嚴(yán)格”在Tm以下 約20-25°C。在功能上，最嚴(yán)格的條件可用來鑒定與雜交探針具有絕對(duì)的同一性或幾乎絕對(duì) 的同一性的序列；而中度或低度嚴(yán)格的雜交可用來鑒定或檢測(cè)多核苷酸序列同源物。
中度和高度嚴(yán)格的雜交條件為本領(lǐng)域公知。高度嚴(yán)格的條件的實(shí)例包含于約42°C 在50%甲酰胺、5X SSC、5X Denhardt，s溶液、0. 5% SDS和100 μ g/ml變性載體DNA中雜交，然后于室溫在2X SSC和0.5% SDS中漂洗兩次，于42°C在0. IX SSC和0. 5% SDS中漂洗 另外兩次。中度嚴(yán)格的條件的實(shí)例包含于37°C在包含20%甲酰胺、5x SSC(150mM氯化鈉， 15mM檸檬酸三鈉)、50mM磷酸鈉(pH 7. 6)、5x Denhardt，s溶液、10%硫酸葡聚糖和20mg/ ml變性的剪切鮭魚精子DNA的溶液中孵育過夜，然后于約37-50°C在Ix SSC中漂洗濾膜。 本領(lǐng)域技術(shù)人員了解如何按適應(yīng)如探針長(zhǎng)度等的因素所需來調(diào)節(jié)溫度、離子強(qiáng)度等。
如本文所用，在談?wù)摷?xì)胞或載體中使用的“重組體”指通過異源核酸序列的引入修 飾的細(xì)胞或載體，或衍生自經(jīng)如此修飾的細(xì)胞的細(xì)胞。因此，例如，由于有意的人為干預(yù)，重 組細(xì)胞表達(dá)不以相同形式見于該細(xì)胞的天然(非重組)形式的基因，或表達(dá)否則將非正常 表達(dá)、低量表達(dá)、過量表達(dá)或完全不表達(dá)的基因。“重組”、“重組的”或產(chǎn)生“重組的”核酸一 般是兩個(gè)或多個(gè)核酸片段的組裝，其中組裝產(chǎn)生嵌合基因。
本文所用的術(shù)語“引物”指天然存在于純化的限制酶消化產(chǎn)物中的或合成產(chǎn)生的 寡核苷酸，當(dāng)將其置于誘導(dǎo)與核酸鏈互補(bǔ)的引物延伸產(chǎn)物合成的條件(即存在核苷酸和如 DNA聚合酶的誘導(dǎo)劑，且處于適合的溫度和pH的情況下)下時(shí)，其能夠作為合成起點(diǎn)。通 常，引物是用于最大化擴(kuò)增效率的單鏈。大多數(shù)情況下，引物是寡脫氧核糖核苷酸。
本文所用的術(shù)語“聚合酶鏈反應(yīng)”(PCR)指用引物對(duì)、DNA聚合酶和DNA聚合、溶 解和退火的反復(fù)循環(huán)擴(kuò)增DNA鏈的方法(見例如美國(guó)專利號(hào)4，683，195 ；4, 683, 202和 4，965，188，其在此引入本文作為參考)。
本文所用的術(shù)語“限制性內(nèi)切酶”和“限制酶”指細(xì)菌酶，其各自在特異核苷酸序 列處或在其附近切割雙鏈DNA。
“限制位點(diǎn)，，指被給定的限制性內(nèi)切酶識(shí)別和切割的核苷酸序列，其經(jīng)常是DNA片 段插入的位點(diǎn)。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，將限制位點(diǎn)設(shè)計(jì)入選擇標(biāo)記中和DNA構(gòu)建體 的5'和3'末端中。
II.本發(fā)明的一般性方法和實(shí)施方案
本發(fā)明提供能夠產(chǎn)生目的蛋白質(zhì)的失活突變體(例如刪除突變體和破壞突變 體)。具體而言，本發(fā)明涉及具有改變的目的蛋白質(zhì)表達(dá)的重組絲狀真菌微生物(如曲霉屬 物種)，其中一個(gè)或多個(gè)染色體基因已失活，且通常其中一個(gè)或多個(gè)染色體基因已從曲霉屬 染色體刪除，或其中一個(gè)或多個(gè)染色體基因的蛋白質(zhì)編碼區(qū)已被破壞。更確切地，本發(fā)明提 供用于刪除單個(gè)或多個(gè)基因的方法。在一些實(shí)施方案中，這類刪除提供如提高的目的蛋白 質(zhì)產(chǎn)生的優(yōu)勢(shì)。
在一些方面中，本發(fā)明依賴于遺傳工程和分子生物學(xué)領(lǐng)域中使用的常規(guī)技術(shù)和方 法。以下資源包含用于本發(fā)明的一般方法學(xué)的描述Sambrook等，MOLE⑶LAR CLONING A LABORATORY MANUAL(第 二 版，1989) ；Kreigler, GENE TRANSFER AND EXPRESSION A LABORATORY MANUAL (1990)；和 Ausubel 等編輯 CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BI0L0GY(1994)。這些一般參考文獻(xiàn)提供本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的定義和方法。但是，并非旨 在將本發(fā)明限于所述的任意具體方法、流程和試劑，這些方法、流程和試劑可以改變。
失活基因
如上文所指出，本發(fā)明包含具有單個(gè)或多個(gè)蛋白酶基因失活的絲狀真菌細(xì)胞，其 中該失活基因選自apsB、apsB同源物、cpsA、cpsA同源物及其組合?？梢酝ㄟ^基因刪除或 基因破壞來失活基因。在一些實(shí)施方案中，失活基因是不可回復(fù)的。[0106]在一些實(shí)施方案中，失活基因是apsB同源物或cpsA同源物。用于本發(fā)明的同源 物具有與apsB或cpsA相同或相似的功能，且與apsB或cpsA具有至少99%、至少98%、至 少97%、至少96%、至少95%、至少94%、至少93%、至少92%、至少91%、至少90%、至少 88%、至少85%、至少80%、至少70%或至少60%序列同一性。
基因CpsA(SEQ ID NO 1)編碼具有氨基酸序列SEQ ID NO 2的黑曲霉羧肽酶，該 羧肽酶被認(rèn)為是分泌性蛋白質(zhì)。
基因apsB(SEQ ID NO 9)編碼具有氨基酸序列SEQ ID NO 10的黑曲霉氨肽酶，該 氨肽酶是胞內(nèi)蛋白質(zhì)(即不被細(xì)胞分泌)。
在一些實(shí)施方案中，絲狀真菌細(xì)胞可以包含其他失活基因。其他失活基因可以包 含但不限于涉及蛋白質(zhì)降解或蛋白質(zhì)修飾的基因，如ER降解途徑中的蛋白質(zhì)、蛋白酶基因 (如分泌性絲氨酸和天冬氨酸蛋白酶基因)、糖基化基因和糖蛋白降解基因。在一些實(shí)施 方案中，其他失活基因可以選自以下的一種或多種derA、derB、htmA、mnn9、mnnlO、ochA、 dpp4、dpp5、ρ印F、ρ印Aa、pepAb, pepAc和ρ印Ad。這些基因的多種編碼序列和功能，以及 產(chǎn)生和使用具有一個(gè)或多個(gè)失活的這些基因的絲狀真菌細(xì)胞的方法描述于美國(guó)專利申請(qǐng) 公開號(hào)2006/0M6545中，其在此引入本文作為參考(還見Wang等，“Isolation of four pepsin-like protease genes from Aspergillus niger and analysis of the effect of disruptions on heterologous laccase expression,，，F(xiàn)ungal Genet. Biol.45 (1) 17-27 (2008年1月)，其在此引入本文作為參考)。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的具有失活基因的絲狀真菌細(xì)胞可包含兩個(gè)或多個(gè) (例如兩個(gè)、三個(gè)或四個(gè))失活基因。
在一些實(shí)施方案中，絲狀真菌細(xì)胞可以包含其他失活基因。其他失活基因可以包 含但不限于涉及蛋白質(zhì)降解或蛋白質(zhì)修飾的基因，如ER降解途徑中的蛋白質(zhì)、蛋白酶基因 (如分泌性絲氨酸和天冬氨酸蛋白酶基因)、糖基化基因和糖蛋白降解基因。在一些實(shí)施 方案中，其他失活基因可以選自以下的一種或多種derA、derB、htmA、mnn9、mnnlO、ochA、 dpp4、dpp5、ρ印F、ρ印Aa、pepAb, pepAc和ρ印Ad。這些基因的多種編碼序列和功能，以及 產(chǎn)生和使用具有一個(gè)或多個(gè)失活的這些基因的絲狀真菌細(xì)胞的方法描述于美國(guó)專利申請(qǐng) 公開號(hào)2006/0M6545中，其在此引入本文作為參考(還見Wang等，“Isolation of four pepsin-like protease genes from Aspergillus niger and analysis of the effect of disruptions on heterologous laccase expression,，，F(xiàn)ungal Genet. Biol.45 (1) 17-27 (2008年1月)，其在此引入本文作為參考)。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的具有失活基因的絲狀真菌細(xì)胞可包含兩個(gè)或多個(gè) (例如兩個(gè)、三個(gè)或四個(gè))失活基因。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的具有失活基因的絲狀真菌細(xì)胞包含至少一個(gè)選自 apsB、apsB 同源物、cpsA、cpsA 同源物的基因禾口選自 derA、derB、htmA、mnn9、mnnlO、ochA、 dpp4、dpp5、ρ印F、ρ印Aa、ρ印Ab、pepAc和ρ印AcU其組合和與其具有至少99%、至少98%、 至少97%、至少96%、至少95%、至少94%、至少93%、至少92%、至少91%、至少90%、至 少88 %、至少85 %、至少80 %、至少70 %或至少60 %序列同一性的功能性同源序列的基因。
還考慮失活基因的組合，可將美國(guó)專利申請(qǐng)公開號(hào)2006/0M6545中明確公開的 derA、derB、htmA、mnn9、mnnlO、ochA、dpp4、dpp5、pepF、pepAa、pepAb、pepAc 禾口 pepAd 與本文公開的失活apsB和/或cpsA基因組合，以向絲狀真菌細(xì)胞提供兩個(gè)或多個(gè)失活基因。 在一些實(shí)施方案中，除失活的apsB和/或cpsA蛋白酶基因外，絲狀真菌細(xì)胞可以包含失活 的二肽基蛋白酶基因dpp4和dpp5。在一些實(shí)施方案中，除失活的apsB和/或cpsA蛋白 酶基因外，本發(fā)明的絲狀真菌細(xì)胞可以包含一個(gè)或多個(gè)失活的胃蛋白酶樣天冬氨酸蛋白酶 基因ρ印Aa、pepAb, ρ印Ac和/或ρ印Ad。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的具有失活基因的絲 狀真菌細(xì)胞包含至少一個(gè)選自apsB、apsB同源物、cpsA、cpsA同源物的基因和選自derA、 derB> htmA、mnn9、mnnlO、ochA、dpp4、dpp5、pepF、pepAa、pepAb、pepAc 禾口 pepAd、其組合禾口 與其具有至少99 %、至少98 %、至少97 %、至少96 %、至少95 %、至少94 %、至少93 %、至少 92%、至少91%、至少90%、至少88%、至少85%、至少80%、至少70%或至少60%序列同 一性的功能性同源序列的基因。
還考慮失活基因的組合，可將美國(guó)專利申請(qǐng)公開號(hào)2006/0M6545中明確公開的 derA、derB、htmA、mnn9、mnnlO、ochA、dpp4、dpp5、pepF、pepAa、pepAb、pepAc 禾口 pepAd 與 本文公開的失活apsB和/或cpsA基因組合，以向絲狀真菌細(xì)胞提供兩個(gè)或多個(gè)失活基因。 在一些實(shí)施方案中，除失活的apsB和/或cpsA蛋白酶基因外，絲狀真菌細(xì)胞可以包含失活 的二肽基蛋白酶基因dpp4和dpp5。在一些實(shí)施方案中，除失活的apsB和/或cpsA蛋白酶 基因外，本發(fā)明的絲狀真菌細(xì)胞可以包含一個(gè)或多個(gè)失活的胃蛋白酶樣天冬氨酸蛋白酶基 因 pepAa、pepAb、pepAc 禾口 / 或 pepAd。
在一些實(shí)施方案中，見于絲狀真菌細(xì)胞中的apsB和cpsA的同源基因可用于本發(fā) 明。具體而言，產(chǎn)生本文公開的具有失活基因的絲狀真菌細(xì)胞的方法可以用來失活具有 apsB和/或cpsA的這些天然同源物失活的突變株。在一些實(shí)施方案中，apsB和cpsA的 這些同源基因?qū)⒎謩e與SEQ IDNO :l(cpsA)或SEQ ID NO :8(apsB)具有至少約60%、70%、 80%、85%、90%、95%、或甚至更高的百分比序列同一性。
失活的方法和DNA構(gòu)建體
用于鑒定絲狀真菌細(xì)胞(例如黑曲霉)中待失活的基因的方法、用于制備用于 基因失活的DNA構(gòu)建體(例如破壞序列)的方法和用于檢測(cè)基因失活的方法描述于2006 年11月2日公開的美國(guó)專利申請(qǐng)公開號(hào)20060246M5A1中，其在此引入本文作為參考 (33SJAL Wang "Isolation of four pepsin-like protease genes from Aspergillus niger and analysis of the effect of disruptions on heterologous laccase expression, ”Fungal Genet. Biol. 45(1) :17-27(2008 年 1 月)，其在此引入本文作為參 考)。
從宿主細(xì)胞確定同源序列的方法為本領(lǐng)域已知，其包括用本文公開的核酸序列來 構(gòu)建寡核苷酸探針，所述探針對(duì)應(yīng)于所編碼的蛋白質(zhì)的約6至20個(gè)氨基酸。然后可以用探 針來克隆同源基因。分離絲狀真菌宿主基因組DNA并用適合的限制酶消化。分離片段并用 通過標(biāo)準(zhǔn)方法從蛋白質(zhì)降解序列制備的寡核苷酸探針探測(cè)。分離對(duì)應(yīng)于通過雜交至寡核苷 酸探針鑒定的DNA區(qū)段的片段，連接至適合的載體，然后轉(zhuǎn)化入宿主以產(chǎn)生DNA克隆。
在一些實(shí)施方案中，用于本發(fā)明的apsB或cpsA的基因同源物可以是分別與 apsB(SEQ ID NO :10)或cpsA(SEQ ID NO :2)具有至少約60%、70%、80%、85%、90%、95% 或甚至更高的百分比氨基酸序列同一性的見于絲狀真菌細(xì)胞(例如曲霉屬物種)的蛋白 質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，功能性同源核苷酸或氨基酸序列可見于相關(guān)的絲狀真菌物種(例如黑曲霉和米曲霉)，且將與apsB(SEQ ID NOS :9禾口 10)或cpsA(SEQ ID N0S:1和2)具有 至少約80^^85^^90%或至少95%序列同一性。在其他實(shí)施方案中，用于本發(fā)明的基因同 源物可以具有產(chǎn)生因一個(gè)或多個(gè)保守性氨基酸替代而不同于SEQ ID NOS :10或2的氨基酸 序列的序列。在這類實(shí)施方案中，保守性氨基酸替代包含但不限于以下組甘氨酸和丙氨 酸；纈氨酸、異亮氨酸和亮氨酸；天冬氨酸和谷氨酸；精氨酸和谷氨酰胺；絲氨酸和蘇氨酸； 色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸；和賴氨酸和精氨酸。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明包含含有進(jìn)入序列(例如破壞序列)的DNA構(gòu)建體。在 體外組裝DNA構(gòu)建體，然后直接將構(gòu)建體克隆入感受態(tài)宿主(例如曲霉屬宿主)，以使DNA 構(gòu)建體整合入宿主染色體。例如，可以用PCR融合和/或連接在體外組裝DNA構(gòu)建體。
在一些實(shí)施方案中，DNA構(gòu)建體是非質(zhì)粒構(gòu)建體，而在其他實(shí)施方案中，將DNA構(gòu) 建體摻入載體(例如質(zhì)粒)。在一些實(shí)施方案中，使用環(huán)狀質(zhì)粒。在一些實(shí)施方案中，設(shè)計(jì) 環(huán)狀質(zhì)粒以使用適合的限制酶(即不破壞DNA構(gòu)建體的限制酶)。因此，可將線性化質(zhì)粒用 于本發(fā)明。
在一些實(shí)施方案中，進(jìn)入序列包含apsB基因、cpsA基因、apsB或cpsA的同源序 列、apsB或cpsA的基因片段；和/或緊鄰的染色體編碼區(qū)側(cè)翼序列。同源序列是編碼與 apsB或cpsA具有相似或相同功能的蛋白質(zhì)，且與apsB或cpsA基因或其基因片段具有至 少約 99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、88%、85%、80%、70%或 60 %序列同一性的核酸序列。
在其中基因組DNA已知的一些實(shí)施方案中，通過兩個(gè)PCR反應(yīng)克隆待刪除基因的 5’側(cè)翼片段和3’側(cè)翼片段，在其中基因被破壞的實(shí)施方案中，通過一個(gè)PCR反應(yīng)克隆DNA 片段。
在一些實(shí)施方案中，編碼區(qū)側(cè)翼序列包含約Ibp至2500bp、約Ibp至1500bp、約 Ibp至lOOObp、約Ibp至500bp和Ibp至250bp。包含編碼區(qū)側(cè)翼序列的核酸序列的數(shù)目可 以在基因編碼序列的每一端不同。例如，在一些實(shí)施方案中，編碼序列的5'末端包含少于 25bp，編碼序列的3'末端包含超過IOObp。
在一些實(shí)施方案中，進(jìn)入序列包含破壞序列，其在5’和3’末端側(cè)接選擇標(biāo)記，以 及基因序列的片段。在其他實(shí)施方案中，當(dāng)將包含選擇標(biāo)記和基因、其基因片段或同源序列 的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞時(shí)，選擇標(biāo)記的定位使得基因?qū)ζ漕A(yù)期用途是無功能的。在 一些實(shí)施方案中，進(jìn)入序列包含定位于基因啟動(dòng)子區(qū)中的選擇標(biāo)記。在其他實(shí)施方案中，進(jìn) 入序列包含定位于基因啟動(dòng)子區(qū)之后的選擇標(biāo)記。
還在其他實(shí)施方案中，進(jìn)入序列是包含定位于基因編碼區(qū)中的選擇標(biāo)記的破壞序 列。在其他實(shí)施方案中，進(jìn)入序列包含兩個(gè)末端都具有同源盒的選擇標(biāo)記。還在其他實(shí)施 方案中，進(jìn)入序列包含破壞編碼序列的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的序列。還在其他實(shí)施方案中，DNA 構(gòu)建體包含設(shè)計(jì)在該構(gòu)建體上游和下游末端的限制位點(diǎn)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，構(gòu)巢曲霉amdS基因?yàn)橛糜诒景l(fā)明的絲狀真菌的轉(zhuǎn)化提供選 擇標(biāo)記系統(tǒng)。amdS基因編碼曲霉屬菌株中缺乏的乙酰胺酶，為在乙酰胺培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的轉(zhuǎn) 化體提供陽性選擇壓力。amdS基因甚至可以在已知其包含內(nèi)源amdS基因或同源物的真菌 中用作選擇標(biāo)記，例如在構(gòu)巢曲霉(Tilburn等1983，Gene 26 :205-221)和米曲霉(Gomi等 1991, Gene 108:91-98)中。可以通過在選擇培養(yǎng)基中包含CsCl來抑制非轉(zhuǎn)化體的背景amdS活性。
在本領(lǐng)域中建立了在工業(yè)上重要的絲狀真菌(例如在黑曲霉中(見例如Kelly 和 Hynes 1985，EMBO J. 4 :475-479 ；Wang 等，F(xiàn)ungal Genet. Biol. 45(1) :17-27(2008 年 1 月))；在產(chǎn)黃青霄(Penicillium chrysogenum)(見例如 Beri 禾口 Turner 1987，Curr. Genet. 11 :639-641)；在里氏木霉(Trichoderma reesei)(見例如 Pentilla 等 1987，Gene 61 :155-164)；在米曲霉(見例如 Christensen 等 1988，Bio/technology 6 :1419-1422)； 在哈茨木霉(Trichoderma harzianum)(見例如 Pe' er 等 1991，Soil Biol. Biochem. 23 1043-1046 ；和美國(guó)專利號(hào)6，548, 285)，每篇文獻(xiàn)在此引入本文作為參考)的轉(zhuǎn)化中使用 amdS標(biāo)記系統(tǒng)的方法。
可以將包含進(jìn)入序列的DNA構(gòu)建體摻入載體(例如質(zhì)粒中)，或直接用來轉(zhuǎn)化絲狀 真菌細(xì)胞，從而產(chǎn)生失活突變體。通常，DNA構(gòu)建體穩(wěn)定轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生不可回復(fù)的失活基因的染 色體整合。在體外構(gòu)建并將DNA構(gòu)建體插入適合的載體的方法為本領(lǐng)域公知。一般通過在 方便的限制位點(diǎn)處連接來進(jìn)行序列的刪除和/或插入。若不存在這類位點(diǎn)，則可以按照常 規(guī)實(shí)踐制備和使用合成的寡核苷酸接頭。(見Sambrook (1989)上文；和Bennett和Lasure， More Gene Manipulations in Fungi, Academic Press, San Diego(1991)70-76 頁)。此 夕卜，可以用己知的重組技術(shù)(例如 Invitrogen Life Technologies,Gateway Technology) 構(gòu)建載體?？梢杂迷诒景l(fā)明的實(shí)施中的適合的表達(dá)和/或整合載體的實(shí)例在Sambrook等， (1989)上文；Ausubel (1987)上文；Bennett 禾口 Lasure (編輯)More Gene Manipulations in Fungi, Academic Press 396-428 頁中的 van den Hondel 等(1991)；和美國(guó)專利號(hào) 5，874，276中給出。用于本發(fā)明的示例性載體包含pBS_T、pFB6、pBR322、pUC18、pUClOO和 pENTR/D。
在一些實(shí)施方案中，至少一個(gè)DNA構(gòu)建體的拷貝整合入宿主染色體。在一些實(shí)施 方案中，用本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。例如，可以用一個(gè)DNA構(gòu)建體失 活apsB基因，而可以用另一個(gè)構(gòu)建體失活cpsA基因。當(dāng)然，本發(fā)明考慮和提供其他組合。
失活經(jīng)由任意適合的方法發(fā)生，其包括在核酸基因序列中刪除、替代(例如突 變)、破壞、插入和/或基因沉默機(jī)制，如RNA干擾(RNAi)。在一個(gè)實(shí)施方案中，失活基因 的表達(dá)產(chǎn)物是在蛋白質(zhì)生物學(xué)活性中具有對(duì)應(yīng)的改變的截短蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施方案中， 失活導(dǎo)致基因生物學(xué)活性的喪失。在一些實(shí)施方案中，重組真菌細(xì)胞中失活基因的生物學(xué) 活性將實(shí)際上是零(即不可測(cè)量)。在一些實(shí)施方案中，可以保留一些殘余活性，且與對(duì)應(yīng) 的親本菌株中相同基因或同源基因的生物學(xué)活性相比，通常將低于251201151101 5%和2%或更少。
在一些實(shí)施方案中，通過刪除達(dá)到失活，在其他實(shí)施方案中，通過基因蛋白質(zhì)編碼 區(qū)的破壞達(dá)到失活。在一些實(shí)施方案中，通過同源重組失活基因。
在一些實(shí)施方案中，只要染色體中剩余的序列使基因在功能上失活，刪除可以是 部分的。在一些實(shí)施方案中，刪除突變體包含產(chǎn)生穩(wěn)定和不可回復(fù)的刪除的一個(gè)或多個(gè)基 因的刪除。編碼序列的側(cè)翼區(qū)可以在5’和3’末端包含約Ibp至約500bp。側(cè)翼區(qū)可以大 于500bp，但在可以按照本發(fā)明失活或刪除的區(qū)域中通常不包含其他基因。最終結(jié)果是刪除 的基因?qū)嶋H上是非功能性的。雖然不意味著限制用于進(jìn)行失活的方法，但在一些實(shí)施方案 中，可以通過刪除來失活apsB和/或cpsA和同源基因。[0135]在一些實(shí)施方案中，破壞序列包含插入蛋白質(zhì)編碼區(qū)中的選擇標(biāo)記基因。通常，通 過在限制位點(diǎn)處切割然后連接，將基因序列反向插入失活基因的編碼區(qū)序列來在體外進(jìn)行 此插入。編碼序列的側(cè)翼區(qū)可以在5’和3’末端包含約Ibp至約500bp。側(cè)翼區(qū)可以大于 500bp，但一般該區(qū)域中不包含其他基因。DNA構(gòu)建體與宿主染色體的同源序列比對(duì)，基因的 翻譯或轉(zhuǎn)錄在雙交換事件中被破壞。例如，將apsB染色體基因與包含基因或部分基因編碼 區(qū)和選擇標(biāo)記的質(zhì)粒比對(duì)。在一些實(shí)施方案中，將選擇標(biāo)記基因定位在基因編碼序列內(nèi)或 在質(zhì)粒上與基因分離的部分上。載體整合入宿主染色體，此后宿主基因由于插入編碼序列 的標(biāo)記的存在而失活。
雖然不意味著限制用于進(jìn)行失活的方法，但在一些實(shí)施方案中，可以通過此方法 失活apsB和/或cpsA和同源序列。
在一些實(shí)施方案中，以質(zhì)粒作為載體，通過單交換事件中的插入失活基因。例如， 載體整合入宿主細(xì)胞染色體，通過載體插入基因的蛋白質(zhì)編碼序列或基因的調(diào)節(jié)區(qū)來失活基因。
在其他實(shí)施方案中，由于基因的突變而產(chǎn)生失活。突變基因的方法為本領(lǐng)域公 知，且包含但不限于位點(diǎn)定向突變、隨機(jī)突變的產(chǎn)生和缺口雙鏈體方法(見例如美國(guó)專利 4，760，025 ；Moring 等，Biotech. 2 :646 [1984]；和 Kramer 等，Nucleic Acids Res.，12 9441 [1984])。
宿主絲狀真菌細(xì)胞
在本發(fā)明中，宿主細(xì)胞可以是絲狀真菌細(xì)胞(見Alexopoulos，C.J· (1962)， Introductory Mycology, Wiley, New York)。絲狀真菌細(xì)胞的類型不是關(guān)鍵的。用于本 發(fā)明的絲狀真菌細(xì)胞包含但不限于曲霉屬物種(例如米曲霉、黑曲霉、泡盛曲霉、構(gòu)巢曲 霉、醬油曲霉、日本曲霉、河內(nèi)曲霉和棘孢曲霉)、根霉屬物種、木霉屬物種(例如里氏木霉 (之前分類為長(zhǎng)梗木霉(T. Iongibrachiatum)，現(xiàn)在也稱為Hypocrea jecorina)、綠色木霉 (Trichoderma viride)、康寧木霄(Trichoderma koningii)禾口 Trichoderma harzianums) 和毛霉屬物種(例如米黑毛霉(M.miehei)和微小毛霉(M. pusillus))。在一些實(shí)施方案 中，宿主細(xì)胞是黑曲霉。
在一些實(shí)施方案中，可以用于本發(fā)明的黑曲霉的具體菌株包含ATCC22342 (NRRL 3112)、ATCC 44733和ATCC 14331及從其衍生的菌株。在一些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞能夠 表達(dá)異源基因。例如，宿主細(xì)胞可以是產(chǎn)生異源蛋白質(zhì)的重組細(xì)胞。在其他實(shí)施方案中，宿 主是過量表達(dá)已引入細(xì)胞的蛋白質(zhì)的細(xì)胞。
在一些實(shí)施方案中，宿主菌株是缺乏一個(gè)或多個(gè)基因(如對(duì)應(yīng)于apsB和cpsA基 因以外的蛋白酶基因的基因)的突變株。例如，可以考慮使用其中編碼主要的分泌性天冬 氨酰蛋白酶(如曲霉胃蛋白酶(aspergillop印sin))的基因已被刪除的黑曲霉宿主細(xì)胞 (見例如美國(guó)專利號(hào)5，840，570和6，509，171，其在此引入本文作為參考)。因此，本發(fā)明提 供絲狀真菌細(xì)胞的apSB和/或cpsA失活突變株，其中對(duì)應(yīng)的親本菌株已是具有一個(gè)或多 個(gè)失活基因的失活突變體。
目的蛋白質(zhì)
在一些實(shí)施方案中，與絲狀真菌對(duì)應(yīng)的親本菌株的一個(gè)或多個(gè)相同蛋白質(zhì)的表達(dá) 和翻譯相比，本發(fā)明所包含的失活突變體將顯示一個(gè)或多個(gè)內(nèi)源和/或異源目的蛋白質(zhì)的改變的表達(dá)和翻譯(即蛋白質(zhì)產(chǎn)生)。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明所包含的絲狀真菌細(xì)胞失活突變體將以比對(duì)應(yīng)的親本 菌株中一個(gè)或多個(gè)相同蛋白質(zhì)的產(chǎn)生高至少約0%至約200% (或更多)的量產(chǎn)生內(nèi)源和 /或異源目的蛋白質(zhì)。因此，在一些實(shí)施方案中，失活突變體一個(gè)或多個(gè)目的蛋白質(zhì)的產(chǎn)生 比對(duì)應(yīng)的親本菌株中一個(gè)或多個(gè)內(nèi)源和/或異源蛋白質(zhì)的產(chǎn)生高至少約0%至100%，在一 些實(shí)施方案中高至少約10%至60%，包含其中產(chǎn)生高至少約10%、15%、20%、25%、30%、 35%、40%、45%、50%禾口 55%的實(shí)施方案。
在其他實(shí)施方案中，希望獲得降低的目的蛋白質(zhì)產(chǎn)生。因此，本發(fā)明還提供其中一 個(gè)或多個(gè)內(nèi)源和/或異源目的蛋白質(zhì)的產(chǎn)生比絲狀真菌對(duì)應(yīng)的親本菌株中內(nèi)源和/或異源 蛋白質(zhì)的產(chǎn)生低至少約0%至100%或甚至更低的絲狀真菌細(xì)胞失活突變體。在一些實(shí)施 方案中，蛋白質(zhì)的產(chǎn)生比對(duì)應(yīng)的親本菌株中一個(gè)或多個(gè)內(nèi)源和/或異源蛋白質(zhì)的產(chǎn)生低至 少約10%至60%，包含其中產(chǎn)生低至少約10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、 50%和55%的實(shí)施方案。
在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，由絲狀真菌細(xì)胞失活突變體產(chǎn)生的目的蛋白質(zhì)是胞 內(nèi)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)(即胞內(nèi)的非分泌性多肽)。在其他實(shí)施方案中，目的蛋白質(zhì)是分泌性多 肽。此外，目的蛋白質(zhì)可以是融合蛋白質(zhì)或雜合蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，失活突變體顯 示大量蛋白質(zhì)的改變的產(chǎn)生，其中一些是胞內(nèi)蛋白質(zhì)，其中一些分泌性蛋白質(zhì)。
用于本發(fā)明的目的蛋白質(zhì)包含本領(lǐng)域已知的酶，其包含但不限于選自淀粉分解 酶、蛋白水解酶、纖維分解酶(cellulytic enzyme)、氧化還原酶和植物細(xì)胞壁降解酶的酶。 更具體而言，這些酶包含但不限于淀粉酶、葡糖淀粉酶、蛋白酶、木聚糖酶、脂肪酶、漆酶、酚 氧化酶、氧化酶、角質(zhì)酶、纖維素酶、半纖維素酶、酯酶、perioxidase、過氧化氫酶、葡糖氧化 酶、肌醇六磷酸酶、果膠酶、葡糖苷酶、異構(gòu)酶、轉(zhuǎn)移酶、半乳糖苷酶和幾丁質(zhì)酶。在一些實(shí)施 方案中，酶包含但不限于淀粉酶、葡糖淀粉酶、蛋白酶、酚氧化酶、纖維素酶、半纖維素酶、葡 糖氧化酶和肌醇六磷酸酶。在一些實(shí)施方案中，目的多肽是蛋白酶、纖維素酶、葡糖淀粉酶 或淀粉酶。
例如，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，黑曲霉中apsB的失活導(dǎo)致異源漆酶以及內(nèi)源 生糖酶的增加的產(chǎn)生。
在一些實(shí)施方案中，目的蛋白質(zhì)是融合至信號(hào)肽(即待分泌蛋白質(zhì)上的氨基端延 伸)的分泌性多肽。幾乎所有分泌性蛋白質(zhì)都使用氨基端蛋白質(zhì)延伸，該延伸在前體蛋白 質(zhì)靶向膜和跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)中起作用。此延伸在膜轉(zhuǎn)移的過程中或緊隨其后被信號(hào)肽酶通過蛋白 水解去除。
在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，目的多肽是如抑制蛋白酶作用的蛋白酶抑制劑的蛋 白質(zhì)。蛋白酶抑制劑為本領(lǐng)域已知，例如隸屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑家族的蛋白酶抑制劑， 已知其抑制trysin、組織蛋白酶G、凝血酶和組織激肽釋放酶。用于本發(fā)明的蛋白酶抑制劑 包含Bowman-Birk抑制劑和大豆胰蛋白酶抑制劑(見Birk, Int. J. Pept. Protein Res. 25 113-131[1985] ；Kennedy, Am. J. Clin. Neutr. 68 1406S-1412S[1998]；和 Billings 等， Proc. Natl. Acad. Sci. 89 :3120-3124 [1992])。
在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，目的多肽選自激素、抗體、生長(zhǎng)因子、受體、細(xì)胞因子 等。本發(fā)明所包含的激素包含但不限于促卵泡激素、黃體生成素、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子、促生長(zhǎng)素抑制素、促性腺激素、血管升壓素、催產(chǎn)素、促紅細(xì)胞生成素、胰島素等。生長(zhǎng)因 子包含但不限于血小板衍生生長(zhǎng)因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、 成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素(例如IL-I至IL-13)、干擾 素、集落刺激因子等?？贵w包含但不限于直接從希望從其產(chǎn)生抗體的任意物種獲得的免疫 球蛋白。此外，本發(fā)明包含修飾的抗體。多克隆和單克隆抗體也包含于本發(fā)明。在一些實(shí) 施方案中，抗體或其片段是嵌合抗體或人源化抗體，包含但不限于抗_pl85HCT2、HulDlO-、司 徒曼布(trastuzumab)、貝伐單抗(bevacizumab)、帕利珠單抗(palivizumab)、英利昔單抗 (infliximab，)、達(dá)利珠單抗(daclizumab)和利妥?，?rituximab)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，將編碼目的蛋白質(zhì)的核酸有效連接至在真菌宿主細(xì)胞中顯 示轉(zhuǎn)錄活性的適合的啟動(dòng)子。啟動(dòng)子可以衍生自編碼宿主細(xì)胞內(nèi)源或異源蛋白質(zhì)的基因。 啟動(dòng)子可以是截短啟動(dòng)子或雜合啟動(dòng)子。啟動(dòng)子還可以是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。通常，將啟動(dòng)子用 于木霉屬宿主或曲霉屬宿主中。適合的啟動(dòng)子的非限制性實(shí)例包含Cbhl、CW!2、egll、egl2 和xynl。在一個(gè)實(shí)施方案中，啟動(dòng)子是宿主細(xì)胞的天然啟動(dòng)子。有用的啟動(dòng)子的其他實(shí)例 包含來自泡盛曲霉和黑曲霉葡糖淀粉酶基因(glaA) (Nunberg等，(1984)Mol. Cell Biol. 4 2306-2315 和 Boel 等，(1984)EMBO J. 3 :1581-1585)、米曲霉 TAKA 淀粉酶基因、米赫根毛 霉(lihizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶基因、黑曲霉中性α -淀粉酶基因、黑曲霉酸穩(wěn)定 α-淀粉酶基因、里氏木霉stpl和cellobiohydrolase 1基因的啟動(dòng)子(見例如EP 0137 280 Al，其在此引用作文本文的參考)及其突變體啟動(dòng)子、截短啟動(dòng)子和雜合啟動(dòng)子。
在一些實(shí)施方案中，將多肽編碼序列有效連接至指導(dǎo)所編碼的多肽進(jìn)入細(xì)胞分泌 途徑的信號(hào)序列。編碼序列的5’末端可以天然包含在翻譯閱讀框中與編碼分泌性蛋白質(zhì) 的編碼區(qū)的區(qū)段天然連接的信號(hào)序列。編碼信號(hào)序列的DNA通常是與待表達(dá)的多肽天然結(jié) 合的序列。通常，信號(hào)序列由黑曲霉α-淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶或黑曲霉葡糖淀粉酶編 碼。在一些實(shí)施方案中，信號(hào)序列是有效連接至cdhl啟動(dòng)子的木霉屬cdhl信號(hào)序列。
絲狀真菌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化
DNA構(gòu)建體或載體往宿主細(xì)胞中的引入包含如轉(zhuǎn)化、電穿孔、核顯微注射、轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn) 染(例如脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染和DEAE-糊精介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染)、與磷酸鈣DNA沉淀孵育、用DNA包 被的微粒高速轟擊、農(nóng)桿菌屬介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化和原生質(zhì)體融合的技術(shù)。一般轉(zhuǎn)化技術(shù)為本領(lǐng)域 已知(見例如 Ausubel 等，(1987)，上文，第 9 章；和 Sambrook(1989)上文；Campbell 等， (1989) Curr. Genet. 16 :53-56 ；禾口 The Biotechnology of Filamentous Fungi,第 6 章編 輯Finkelstein和Ball (1992) Butterworth和Heinenmann，每篇文獻(xiàn)在此引入本文作為參 考)。
異源蛋白質(zhì)在絲狀真菌細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中的產(chǎn)生也是本領(lǐng)域已知的。例如，異源蛋 白質(zhì)在木霉屬中的表達(dá)描述于 Harkki 等(1991)，Enzyme Microb. Technol. 13 :227-233 ； Harkki 等，(1989)Bio Technol. 7 :596-603 ；EP 244, 234 ；EP 215，594 ；和 Molecular Industrial Mycology，Leong和Berka編輯，Marcel Dekker Inc.，NY(1992) 129-148頁中的 Nevalainen等，“The Molecular Biology of Trichoderma and its Application to the Expression of Both Homologous and Heterologous Genes“；禾口美國(guó)專利號(hào) 6，022，725 和6，268, 328中，每篇文獻(xiàn)在此引入本文作為參考。
異源蛋白質(zhì)在曲霉屬物種中的表達(dá)描述于Cao等，OOOOWci. 9 :991-1001 ；和美國(guó)專利號(hào)6，509，171中，每篇文獻(xiàn)在此引入本文作為參考。
可以用已知技術(shù)純化本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體。
檢測(cè)基因失活的方法
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用多種方法來測(cè)定基因是否已被失活。雖然不意味著限 制本發(fā)明，但可以使用的一種方法是描述于Zhu(Zhu等，Acat Mycologica Sinica 13: 34-40[1994]中的酚/氯仿法，其在此引入本文作為參考。簡(jiǎn)言之，在此方法中，用基因組 DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。如此設(shè)計(jì)引物，使得一條引物退火至選擇標(biāo)記基因(例如amdS 基因)，第二條引物在基因的3’末端退火至離DNA同源片段更遠(yuǎn)的3’末端。與將對(duì)應(yīng)的親 本菌株(具有未失活的基因)基因組DNA用作模板時(shí)將不產(chǎn)生PCR片段相反，將失活突變 體基因組DNA用作PCR反應(yīng)模板時(shí)將產(chǎn)生特異的PCR產(chǎn)物。此外，可以對(duì)來自失活突變體 的PCR片段進(jìn)行DNA測(cè)序來確認(rèn)失活基因的同一性。其他有用的方法包括Southern分析， 可參考Sambrook(1989)上文。
細(xì)胞培養(yǎng)
可將絲狀真菌細(xì)胞培養(yǎng)在常規(guī)培養(yǎng)基中?？蓪⒂糜谵D(zhuǎn)化細(xì)胞的培養(yǎng)基修改為適合 于激活啟動(dòng)子和選擇轉(zhuǎn)化體。如溫度、PH等的具體培養(yǎng)條件將是本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見 的。用于本發(fā)明絲狀真菌的一般培養(yǎng)條件是眾所周知的，可以見于如Sambrook，(1982)上 文的科學(xué)文獻(xiàn)中和從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心找到。此外，用于產(chǎn)生異源蛋白質(zhì)的發(fā)酵方 法是本領(lǐng)域本身已知的。例如，可以通過固體培養(yǎng)或浸沒培養(yǎng)產(chǎn)生蛋白質(zhì)，包含分批法、補(bǔ) 料分批法和連續(xù)流法。發(fā)酵溫度可以有一些改變，但對(duì)于如黑曲霉的絲狀真菌，取決于所選 擇的微生物菌株，溫度一般將在約20°C至40°C的范圍內(nèi)，通常在約至37°C的范圍內(nèi)。 含水微生物發(fā)酵(發(fā)酵混合物)中的pH應(yīng)在約2. O至8. O的示例性范圍內(nèi)。對(duì)于絲狀真 菌，pH正常在約2. 5至8. O的范圍內(nèi)；對(duì)于黑曲霉，pH正常在約4. O至6. O的范圍內(nèi)，且通 常在約4. 5至5. 5的范圍內(nèi)。雖然部分取決于發(fā)酵溫度和所使用的培養(yǎng)物，發(fā)酵混合物在發(fā) 酵罐中的平均存留時(shí)間可以顯著改變，但其一般在約M至500小時(shí)的范圍內(nèi)，通常在約M 至400小時(shí)的范圍內(nèi)。可以在本發(fā)明中使用的用于培養(yǎng)絲狀真菌的任意類型的發(fā)酵罐。用 于本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是在15L Biolatitte (Saint-Germain-en-Laye，法國(guó))下操作。
檢測(cè)所表達(dá)的蛋白質(zhì)的活性的方法
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知用于檢測(cè)和測(cè)量在胞內(nèi)和胞外表達(dá)的多肽活性的多種 測(cè)定法。測(cè)定宿主細(xì)胞中目的蛋白質(zhì)的分泌水平和檢測(cè)所表達(dá)的蛋白質(zhì)的方法包括使用 對(duì)該蛋白質(zhì)特異的多克隆或單克隆抗體的免疫測(cè)定的使用。實(shí)例包含酶聯(lián)免疫吸附測(cè) 定(ELISA)、放射免疫測(cè)定(RIA)、熒光免疫測(cè)定(FIA)和熒光激活細(xì)胞分選術(shù)(FACS)。 但是，其他方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知且可用于評(píng)估目的蛋白質(zhì)(見例如Hampton等， Serological Methods, A Laboratory Manual, APS Press, St. Paul, MN[1990]；禾口 Maddox 等，J. Exp. Med.，158 :1211 [1983]，每篇文獻(xiàn)在此引入本文作為參考)。在一些實(shí)施方案中， 目的蛋白質(zhì)的表達(dá)和/或分泌在失活突變體中增強(qiáng)。在一些實(shí)施方案中，與對(duì)應(yīng)的親本菌 株相比，失活突變體中目的蛋白質(zhì)的產(chǎn)生高至少100 %、至少95 %、至少90 %、至少80 %、至 少70%、至少60%、至少50%、至少40%、至少30%、至少20%、至少15%、至少10%、至少 5%和至少2%。
蛋白質(zhì)回收[0167]一旦表達(dá)和任選地分泌了所希望的蛋白質(zhì)，即可以回收和進(jìn)一步純化目的蛋白 質(zhì)?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的方法從發(fā)酵培養(yǎng)液進(jìn)行目的蛋白質(zhì)的回收和純化。發(fā)酵培養(yǎng)液 一般將包含細(xì)胞碎片(包含細(xì)胞、多種懸浮固體和其他生物量污染物)以及所希望的蛋白 質(zhì)產(chǎn)物。
適合用于這種去除的方法包括產(chǎn)生無細(xì)胞濾液的常規(guī)固體-液體分離技術(shù)，例如 離心、過濾、透析、微量過濾、旋轉(zhuǎn)真空過濾或其他已知方法。通常，在結(jié)晶之前用如超濾、蒸 發(fā)或沉淀的技術(shù)進(jìn)一步濃縮發(fā)酵培養(yǎng)液或無細(xì)胞濾液可以是有用的。
可以利用鹽來完成上清或?yàn)V液中蛋白質(zhì)成分的沉淀，然后通過多種層析方法純 化，例如離子交換層析、親和層析和本領(lǐng)域已知的類似方法。當(dāng)分泌所表達(dá)的希望多肽時(shí)， 可以從生長(zhǎng)培養(yǎng)基純化多肽。通常，在純化多肽之前從培養(yǎng)基去除表達(dá)宿主細(xì)胞(例如通 過離心)。
當(dāng)表達(dá)的重組希望多肽不從宿主細(xì)胞分泌時(shí)，通常破壞宿主細(xì)胞，將多肽釋放入 含水“提取物”中，這是純化的第一步。通常，在細(xì)胞破壞之前從培養(yǎng)基收集表達(dá)宿主細(xì)胞 (例如通過離心)。
通過參考以下實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以更充分地理解實(shí)施本發(fā)明的方式和方 法，這些實(shí)施例并非旨在以任意方式限制本發(fā)明或針對(duì)本發(fā)明的權(quán)利要求
的范圍。
實(shí)施例
提供以下實(shí)施例是為了論證和進(jìn)一步說明本發(fā)明的具體實(shí)施方案和方面，不解釋 為限制其范圍。
在以下實(shí)驗(yàn)公開內(nèi)容中應(yīng)用以下縮寫°C (攝氏度)；H20(水)；dH20(去離子 水)；HCl (鹽酸)；aa(氨基酸)；bp (堿基對(duì))；1Λ (千堿基對(duì))；kD(千道爾頓)；g(克)； Pg(微克)；mg(毫克)；μ (微升)；ml(毫升)；mm(毫米)；μπι(微米)；M(摩爾)； mM(毫摩爾)；μ M(微摩爾)；麗(分子量)；s (秒)；min(分鐘)；hr (小時(shí))；NaCl (氯化 鈉)；PBS (磷酸緩沖鹽溶液[150mM NaCl，IOmM磷酸鈉緩沖液，pH 7.2]) ；PCR(聚合酶鏈反 應(yīng))；SDS(十二烷基硫酸鈉)；w/v(質(zhì)量對(duì)體積)；ν/ν(體積對(duì)體積)；ATCC(美國(guó)典型培養(yǎng) 物保藏中心，Rockville, MD) ；BD Biosciences (前 CLONTECH Laboratories, Palo Alto, CA) ；Invitrogen(Invitrogen Corp. ， San Diego, CA)；禾口 Sigma(Sigma Chemical Co.， St. Louis, M0)。
實(shí)施例1
具有失活cpsA基因的黑曲霉細(xì)胞
a.具有失活cpsA DNA構(gòu)建體的破壞質(zhì)?！暗闹苽?br>圖1顯示曲霉屬cpsA基因(SEQ ID NO 1)的2188bp基因組DNA序列。圖2顯示 由SEQ ID NO :1的cpsA基因組DNA序列編碼的552個(gè)氨基酸的序列(SEQ ID NO :2)。羧 肽酶是從多肽的C末端切割氨基酸的蛋白酶。
cpsA “破壞質(zhì)粒”是用來轉(zhuǎn)化黑曲霉細(xì)胞從而產(chǎn)生cpsA失活突變體微生物的包含 失活cpsA基因的DNA構(gòu)建體。用來產(chǎn)生本文所用的cpsA (和apsB)破壞質(zhì)粒的一般策略 和方法與描述于2006年11月2日公開的美國(guó)專利申請(qǐng)公開號(hào)20060246M5 Al中的策略 和方法相同，其在此引入本文作為參考(還見Wang等，“Isolation of four pepsin-likeprotease genes from Aspergillus niger and analysis of the effect of disruptions on heterologous laccase expression,"Fungal Genet. Biol. 45 (1) :17-27 (2008年1月)， 其在此引入本文作為參考)。
以下表1顯示用來產(chǎn)生失活cpsA破壞質(zhì)粒構(gòu)建體和檢測(cè)轉(zhuǎn)化細(xì)胞中破壞的基因 構(gòu)建體的引物序列。
表 1
權(quán)利要求
1.包含至少一個(gè)失活基因的絲狀真菌細(xì)胞，其中所述失活基因選自apsB、apsB同源 物、cpsA、cpsA同源物及其組合。
2.權(quán)利要求
1的絲狀真菌細(xì)胞，其中所述失活基因是cpsA同源物，其中所述同源物與 SEQ ID NO 1具有至少85%序列同一性。
3.權(quán)利要求
1的絲狀真菌細(xì)胞，其中所述失活基因是apsB同源物，其中所述同源物與 SEQ ID NO :9具有至少85%序列同一性。
4.權(quán)利要求
1的絲狀真菌細(xì)胞，其中所述絲狀真菌選自曲霉屬物種、根霉屬物種、木霉 屬物種和毛霉屬物種。
5.權(quán)利要求
4的絲狀真菌細(xì)胞，其中所述絲狀真菌是選自米曲霉、黑曲霉、泡盛曲霉、 構(gòu)巢曲霉、醬油曲霉、日本曲霉、河內(nèi)曲霉和棘孢曲霉的曲霉屬物種。
6.權(quán)利要求
5的絲狀真菌細(xì)胞，其中所述絲狀真菌是黑曲霉。
7.權(quán)利要求
1的絲狀真菌細(xì)胞，其中所述失活基因是apsB(SEQ IDNO 9)。
8.權(quán)利要求
7的絲狀真菌細(xì)胞，其中所述絲狀真菌細(xì)胞包含至少第二個(gè)選自cpsA、 dpp4、dpp5及其同源物的失活基因。
9.權(quán)利要求
1的絲狀真菌細(xì)胞，其中所述失活基因是cpsA(SEQIDN0:l)o
10.權(quán)利要求
9的絲狀真菌細(xì)胞，其中所述絲狀真菌細(xì)胞包含至少第二個(gè)選自apsB、 dpp4、dpp5及其同源物的失活基因。
11.權(quán)利要求
1的絲狀真菌細(xì)胞，其中通過用選擇標(biāo)記基因破壞來失活所述失活基因。
12.權(quán)利要求
1的絲狀真菌細(xì)胞，其中所述細(xì)胞內(nèi)源蛋白質(zhì)的產(chǎn)生比對(duì)應(yīng)的絲狀真菌 細(xì)胞親本菌株中內(nèi)源蛋白質(zhì)的產(chǎn)生高至少約10%至約60%。
13.權(quán)利要求
12的絲狀真菌細(xì)胞，其中所述內(nèi)源蛋白質(zhì)是生糖酶。
14.權(quán)利要求
12的絲狀真菌細(xì)胞，其中所述內(nèi)源蛋白質(zhì)是選自α-淀粉酶、纖維素酶、 葡糖淀粉酶、漆酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶的酶。
15.權(quán)利要求
1的絲狀真菌細(xì)胞，其中所述細(xì)胞還包含編碼異源蛋白質(zhì)的核酸。
16.權(quán)利要求
15的絲狀真菌細(xì)胞，其中所述異源蛋白質(zhì)的產(chǎn)生相對(duì)于對(duì)應(yīng)的絲狀真菌 細(xì)胞親本菌株中相同蛋白質(zhì)的產(chǎn)生被改變。
17.權(quán)利要求
15的絲狀真菌細(xì)胞，其中所述異源蛋白質(zhì)的產(chǎn)生比對(duì)應(yīng)的絲狀真菌細(xì)胞 親本菌株中相同蛋白質(zhì)的產(chǎn)生高至少約10%至約60%。
18.權(quán)利要求
15的絲狀真菌細(xì)胞，其中總干細(xì)胞重因比對(duì)應(yīng)的絲狀真菌細(xì)胞親本菌株 的總干細(xì)胞重低約25%、20%、15%、10%或5%而不同。
19.權(quán)利要求
15的絲狀真菌細(xì)胞，其中所述異源蛋白質(zhì)是酶。
20.權(quán)利要求
19的絲狀真菌細(xì)胞，其中所述酶選自α-淀粉酶、纖維素酶、葡糖淀粉酶、 漆酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶。
21.權(quán)利要求
19的絲狀真菌細(xì)胞，其中所述酶是漆酶。
22.權(quán)利要求
15的絲狀真菌細(xì)胞，其中所述異源蛋白質(zhì)是蛋白酶抑制劑。
23.權(quán)利要求
15的絲狀真菌細(xì)胞，其中所述異源蛋白質(zhì)是抗體或其片段。
24.權(quán)利要求
1的絲狀真菌細(xì)胞，其中所述失活基因編碼胞內(nèi)蛋白質(zhì)。
25.權(quán)利要求
對(duì)的絲狀真菌細(xì)胞，其中所述胞內(nèi)蛋白質(zhì)是蛋白酶。
26.權(quán)利要求
1的絲狀真菌細(xì)胞，其中所述絲狀真菌細(xì)胞包含至少兩個(gè)失活基因。
27.權(quán)利要求
1的絲狀真菌細(xì)胞,其還包含選自derA、derB、htmA、mnn9、mnnlO、ochA、 dpp4、dpp5、ρ印Aa、pepAb、ρ印Ac、ρ印Ad、ρ印B、ρ印C、ρ印D、ρ印F及其同源物的失活基因。
28.絲狀真菌細(xì)胞，其包含至少一個(gè)失活基因，其中所述失活基因編碼胞內(nèi)蛋白質(zhì)，且 其中所述細(xì)胞的至少一種其他蛋白質(zhì)的產(chǎn)生比對(duì)應(yīng)的絲狀真菌細(xì)胞親本菌株中其他蛋白 質(zhì)的產(chǎn)生高至少約10%至約60%。
29.權(quán)利要求
觀的絲狀真菌細(xì)胞，其中所述胞內(nèi)蛋白質(zhì)是蛋白酶。
30.權(quán)利要求
觀的絲狀真菌細(xì)胞，其中所述胞內(nèi)蛋白質(zhì)是氨肽酶。
31.權(quán)利要求
觀的絲狀真菌細(xì)胞，其中所述胞內(nèi)蛋白質(zhì)是apsB。
32.用于產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法，其包括a)將編碼蛋白質(zhì)的核酸引入絲狀真菌細(xì)胞，其中所述細(xì)胞包含至少一個(gè)選自apsB、 apsB同源物、cpSA、cpSA同源物及其組合的失活基因；和b)在適合于產(chǎn)生所述蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞。
33.權(quán)利要求
32的方法，其中所述方法還包括回收所述蛋白質(zhì)。
34.權(quán)利要求
32的方法，其中所述失活基因是cpsA同源物，其中所述同源物與SEQID NO 1具有至少85%序列同一性。
35.權(quán)利要求
32的方法，其中所述失活基因是apsB同源物，其中所述同源物與SEQID NO 9具有至少85%序列同一性。
36.權(quán)利要求
32的方法，其中所述失活基因是cpsA(SEQID NO :1)。
37.權(quán)利要求
32的方法，其中所述失活基因是apsB(SEQ ID NO :9)。
38.權(quán)利要求
32的方法，其中所述絲狀真菌是選自米曲霉、黑曲霉、泡盛曲霉、構(gòu)巢曲 霉、醬油曲霉、日本曲霉、河內(nèi)曲霉和棘孢曲霉的曲霉屬物種。
39.權(quán)利要求
38的方法，其中所述曲霉屬物種是黑曲霉。
40.權(quán)利要求
32的方法，其中所述蛋白質(zhì)是蛋白酶抑制劑。
41.權(quán)利要求
32的方法，其中所述蛋白質(zhì)是抗體或其片段。
42.權(quán)利要求
32的方法，其中所述蛋白質(zhì)是酶。
43.產(chǎn)生用于蛋白質(zhì)產(chǎn)生的絲狀真菌菌株的方法，其包括a)用破壞序列轉(zhuǎn)化絲狀真菌細(xì)胞，其中所述破壞序列包含至少一個(gè)選自apSB、apSB同 源物、cpSA、cpSA同源物及其組合的失活基因；和b)選擇其中所述破壞序列在染色體上整合的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。
44.權(quán)利要求
43的方法，其中所述失活基因是cpsA同源物，其中所述同源物與SEQID NO 1具有至少85%序列同一性。
45.權(quán)利要求
43的方法，其中所述失活基因是apsB同源物，其中所述同源物與SEQID NO 9具有至少85%序列同一性。
46.權(quán)利要求
43的方法，其中所述絲狀真菌選自曲霉屬物種、根霉屬物種、木霉屬物種 和毛霉屬物種。
47.權(quán)利要求
43的方法，其中所述絲狀真菌是選自米曲霉、黑曲霉、泡盛曲霉、構(gòu)巢曲 霉、醬油曲霉、日本曲霉、河內(nèi)曲霉和棘孢曲霉的曲霉屬物種。
48.權(quán)利要求
47的方法，其中所述絲狀真菌是黑曲霉。
49.權(quán)利要求
43的方法，其中所述失活基因是apsB(SEQ ID NO :9)。
50.權(quán)利要求
49的方法，其中所述絲狀真菌細(xì)胞包含至少第二個(gè)選自CpsA、dpp4、dpp5 及其同源物的失活基因。
51.權(quán)利要求
43的方法，其中所述失活基因是cpsA(SEQ ID N0:1)。
52.權(quán)利要求
51的方法，其中所述絲狀真菌細(xì)胞包含至少第二個(gè)選自apSB、dpp4、dpp5 及其同源物的失活基因。
53.權(quán)利要求
43的方法，其中所述細(xì)胞還包含編碼異源蛋白質(zhì)的核酸。
54.權(quán)利要求
43的方法，其中所述破壞序列包含在所述失活基因編碼區(qū)序列中的限制 位點(diǎn)處反向插入的選擇標(biāo)記基因序列。
55.權(quán)利要求
討的方法，其中所述選擇標(biāo)記基因是amdS。
56.分離的核酸，其包含基因的破壞序列，其中所述基因是cpsA或cpsA同源物，且其中 所述破壞序列包含在所述基因的編碼區(qū)序列中的限制位點(diǎn)處反向插入的選擇標(biāo)記基因序 列。
57.權(quán)利要求
56的分離的核酸，其中基因是與SEQID NO :1具有至少85%序列同一性 WcpsA同源物。
58.權(quán)利要求
56的分離的核酸，其中基因是cpsA(SEQ ID NO :1)。
59.權(quán)利要求
56的分離的核酸，其中所述選擇標(biāo)記基因是amdS。
60.包含權(quán)利要求
56的核酸的載體。
61.分離的核酸，其包含基因的破壞序列，其中所述基因是apsB或cpsA同源物，且其中 所述破壞序列包含在所述基因的編碼區(qū)序列中的限制位點(diǎn)處反向插入的選擇標(biāo)記基因序 列。
62.權(quán)利要求
61的分離的核酸，其中基因是與SEQID NO :9具有至少85%序列同一性 WapsB同源物。
63.權(quán)利要求
61的分離的核酸，其中基因是apsB(SEQ ID NO :9)。
64.權(quán)利要求
61的分離的核酸，其中所述選擇標(biāo)記基因是amdS。
65.包含權(quán)利要求
61的核酸的載體。
專利摘要
本發(fā)明涉及包含至少一個(gè)選自apsB、apsB同源物、cpsA、cpsA同源物及其組合的失活蛋白酶基因的絲狀真菌細(xì)胞(例如曲霉屬物種)。本發(fā)明提供用于產(chǎn)生失活突變絲狀真菌細(xì)胞的核酸和方法，以及將該細(xì)胞用于改變的內(nèi)源和異源目的蛋白質(zhì)產(chǎn)生的方法。
文檔編號(hào)C12N1/15GKCN102099460SQ200980112295
公開日2011年6月15日 申請(qǐng)日期2009年3月27日
發(fā)明者王華明 申請(qǐng)人:丹尼斯科美國(guó)公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan