專利名稱：:22個(gè)基因座的熒光標(biāo)記復(fù)合擴(kuò)增檢驗(yàn)系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種熒光標(biāo)記復(fù)合擴(kuò)增檢驗(yàn)系統(tǒng)，具體涉及通過(guò)復(fù)合擴(kuò)增，檢測(cè)人基因組中21個(gè)STR基因座和Amelogenin基因座的熒光標(biāo)記復(fù)合擴(kuò)增檢驗(yàn)系統(tǒng)，該系統(tǒng)可以廣泛用于公安部門(mén)日常檢案、DNA數(shù)據(jù)庫(kù)建立、個(gè)體識(shí)別、親子鑒定以及考古等方面，有助于解決公安部打拐數(shù)據(jù)庫(kù)一子多父母問(wèn)題和親子鑒定中突變和近親鑒定問(wèn)題。
背景技術(shù)：
：短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)是目前普遍應(yīng)用的遺傳標(biāo)記，由于它具有片段小容易擴(kuò)增、適宜于檢驗(yàn)微量或降解檢材、各基因座的擴(kuò)增條件相似而能夠?qū)崿F(xiàn)復(fù)合擴(kuò)增等特點(diǎn)，因而采用STR的檢驗(yàn)系統(tǒng)具有靈敏、準(zhǔn)確、快速、信息量大等優(yōu)點(diǎn)，尤其是在建立DNA數(shù)據(jù)庫(kù)方面，STR復(fù)合擴(kuò)增技術(shù)具有極大的優(yōu)越性。因此美國(guó)FBI選擇了13個(gè)STR基因座用于建立DNA數(shù)據(jù)庫(kù)-CODIS(CombinedDNAIndexSystem):CSFIPO、D3S1358、D5S818、D7S820、D8S1179、D13S317、D16S539、D18S51、D21S11、FGA、THOl、TP0X、vWA。這些STR基因座通常被稱為13個(gè)核心基因座。正是因?yàn)镾TR基因座具備以上優(yōu)點(diǎn)和應(yīng)用前景，許多科研機(jī)構(gòu)和公司投入了大量經(jīng)費(fèi)對(duì)其進(jìn)行開(kāi)發(fā)性的研究。國(guó)內(nèi)外已有較多基于STR-PCR技術(shù)的熒光檢測(cè)技術(shù)產(chǎn)品<table>tableseeoriginaldocumentpage3</column></row><table>ABIAMPFLSTlfIdentifilerPCR五色CSF1P0、D7S820、D8S1179、D21S11、D2S1338、D3S1358、D13S317、D16S539、THOl、D18S51、D19S433、TPOX、vWA、Amelogenin、D5S818、FGA16ABISinofilermultiplexPCR五色CSF1P0、D7S820、D8S1179、D21S11、D2S1338、D3S1358、D13S317、D16S539、D6S1043、D18S51、D19S433、D12S391、vWA、Amel。genin、D5S818、FGA16專利ZL200510096613.6四色Amelogenin、D2S1338、D3S1358、D5S818、D6S1043、D7S820、D8S1179、D13S317、D16S539、D18S51、D21S11、PentaE、CSF1P0、vWA、FGA15AGCU17+1STR熒光檢測(cè)試劑盒(專利公開(kāi)號(hào)CN101440410A)五色CSF1P0、D7S820、D8S1179、D21S11、D2S1338、D3S1358、D13S317、D16S539、THOl、D18S51、D19S433、TPOX、vWA、Amelogenin、D5S818、FGA、PentaE、D6S104318為了提供一種新的熒光標(biāo)記復(fù)合擴(kuò)增檢驗(yàn)系統(tǒng)，使其更適合于中國(guó)人群在個(gè)體識(shí)別和親子鑒定等方面的應(yīng)用，進(jìn)一步提高系統(tǒng)的累計(jì)個(gè)體識(shí)別力和累積非父排除率，該檢驗(yàn)系統(tǒng)中必須包含數(shù)目更多的、在中國(guó)人群中具有高度遺傳多態(tài)性的STR基因座。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種22個(gè)基因座的熒光標(biāo)記復(fù)合擴(kuò)增檢驗(yàn)系統(tǒng)，用于個(gè)體識(shí)別和親子鑒定。為此，本發(fā)明者對(duì)中國(guó)人群中STR基因座的遺傳多態(tài)性進(jìn)行了深入的研究，并以此為依據(jù)，開(kāi)發(fā)了新的STR基因座的5色熒光復(fù)合擴(kuò)增檢驗(yàn)系統(tǒng)，提供對(duì)包括Amelogenin在內(nèi)的22個(gè)基因座的分型結(jié)果，提高了系統(tǒng)的累計(jì)個(gè)體識(shí)別力和累積非父排除率。該系統(tǒng)單獨(dú)或與其他商品化試劑盒聯(lián)合使用，有助于解決公安部打拐數(shù)據(jù)庫(kù)一子多父母、親子鑒定中突變和近親鑒定問(wèn)題。本發(fā)明的同時(shí)分析人基因組DNA的22個(gè)基因座的熒光標(biāo)記復(fù)合擴(kuò)增系統(tǒng)中，所涉及的22個(gè)基因座為Amelogenin、D6S474、D12ATA63、D22S1045、D10S1248、D1S1677、D11S4463、D1S1627、D3S4529、D2S441、D6S1017、D4S2408、D19S433、D17S1301、D1GATA113、D18S853、D20S482、D14S1434、D9S1122、D2S1776、D10S1435和D5S2500。本發(fā)明的熒光標(biāo)記復(fù)合擴(kuò)增系統(tǒng)還涉及在一個(gè)體系中同時(shí)擴(kuò)增22個(gè)基因座，將22個(gè)基因座分為四組并分別用四種不同的熒光染料FAM、HEX、TAMRA、ROX進(jìn)行標(biāo)記。本發(fā)明的熒光標(biāo)記復(fù)合擴(kuò)增系統(tǒng)優(yōu)選的一種分組及熒光染料標(biāo)記方式為FAM標(biāo)記的Amelogenin、D6S474、D12ATA63、D22S1045、D10S1248、D1S1677和D11S4463為一組;HEX標(biāo)記的D1S1627、D3S4529、D2S441、D6S1017、D4S2408和D19S433為一組；TAMRA標(biāo)記的D17S1301、D1GATA113、D18S853、D20S482和D14S1434為一組；ROX標(biāo)記的D9S1122、D2S1776、D10S1435和D5S2500為一組。本發(fā)明所采用的22個(gè)基因座分別采用位于該基因座核心重復(fù)區(qū)兩側(cè)的一對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增，其中每對(duì)引物中有一條引物的5'端進(jìn)行熒光染料標(biāo)記；本發(fā)明還提供用于復(fù)合擴(kuò)增22個(gè)基因座的寡核苷酸引物混合物。本發(fā)明的系統(tǒng)中包括每個(gè)基因座的等位基因標(biāo)準(zhǔn)物，以確定待檢DNA樣品中各個(gè)基因座的基因型；本發(fā)明的系統(tǒng)中包含的用于鑒別DNA樣品性別的基因座是Amelogenin基因座。本發(fā)明的擴(kuò)增采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)進(jìn)行，擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)方法采用多道或單道毛細(xì)管電泳。本發(fā)明的熒光標(biāo)記復(fù)合擴(kuò)增檢驗(yàn)系統(tǒng)適用于人的精斑、唾液斑、組織、血痕或血液等檢材來(lái)源DNA樣品的檢測(cè)分析。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，采用如下技術(shù)方案—、基因座的確定采用STR分型技術(shù)進(jìn)行個(gè)體識(shí)別和親子鑒定，一方面是因?yàn)镾TR基因座具有高度多態(tài)性，所用的STR基因座都有較多等位基因，具有較高的非父排除率；但另一方面其突變率也很高，往往會(huì)對(duì)結(jié)果分析(尤其是對(duì)親子鑒定樣本中的結(jié)果分析)及最后作出判斷帶來(lái)許多困難。在實(shí)踐中，往往可以發(fā)現(xiàn)一些案例，在檢測(cè)的STR基因座中有l(wèi)-2個(gè)出現(xiàn)矛盾現(xiàn)象，此時(shí)就需要增加檢測(cè)的STR基因座數(shù)目。根據(jù)中山大學(xué)伍新堯教授在第二屆"全國(guó)親子鑒定理論與實(shí)踐研討會(huì)"上發(fā)表的《親子鑒定判斷標(biāo)準(zhǔn)和結(jié)論表述的推薦意見(jiàn)(討論稿)》對(duì)于三聯(lián)體親子鑒定案①最少檢測(cè)15個(gè)STR基因座，若沒(méi)有發(fā)現(xiàn)矛盾基因座，父權(quán)指數(shù)達(dá)10000，可以作出"肯定親生關(guān)系"的結(jié)論；②若出現(xiàn)1個(gè)矛盾基因座，要增加檢測(cè)基因座至19個(gè)；若發(fā)現(xiàn)有2個(gè)矛盾基因座，要增加檢測(cè)至28個(gè)，沒(méi)有新矛盾基因座發(fā)現(xiàn)時(shí)，父權(quán)指數(shù)達(dá)10000，可作出"肯定親生關(guān)系"的結(jié)論；③若發(fā)現(xiàn)有3個(gè)矛盾基因座，要增加檢測(cè)至35個(gè)，沒(méi)有新矛盾基因座發(fā)現(xiàn)時(shí)，父權(quán)指數(shù)達(dá)10000，可作出"肯定親生關(guān)系"的結(jié)論；若有4個(gè)矛盾STR基因座，則作出"否定親生關(guān)系"的結(jié)論。對(duì)于單親案親子鑒定①至少檢測(cè)18個(gè)STR基因座，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)矛盾基因座時(shí)，作出"不排除親生關(guān)系"的結(jié)論；②若發(fā)現(xiàn)有1個(gè)矛盾基因座，增加檢測(cè)至29個(gè)以上；若有2個(gè)矛盾基因座，要增加檢測(cè)至41個(gè)以上，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)新的矛盾基因座，可作出"不排除親生關(guān)系"的結(jié)論；③如果出現(xiàn)3個(gè)或3個(gè)以上矛盾STR基因座，則應(yīng)作出"否定親生關(guān)系"的結(jié)論。由上述內(nèi)容可知，僅檢測(cè)13個(gè)C0DIS基因座，或只單獨(dú)使用現(xiàn)常用的商品化試劑盒(如AGCU17+1STR熒光檢測(cè)試劑盒、ABIAMPFLSTlfIdentifiler、PromegaPowerPlex衝16)進(jìn)行檢測(cè)，在許多情況下都是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。因此，開(kāi)發(fā)一系列非CODIS基因座的STR分型檢測(cè)產(chǎn)品，增加一次性提供所檢測(cè)基因座的數(shù)目，將有利于親子鑒定和公安部打拐工作的開(kāi)展。本發(fā)明者對(duì)現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道的CODIS以外的常染色體STR基因座進(jìn)行深入分析研究。首先優(yōu)選新的高鑒別力基因座，同時(shí)考慮到和現(xiàn)常用商品化試劑盒的補(bǔ)充性，對(duì)D2S1338、D19S433、PentaE、PentaD、D19S253、D12S391、D6S1043、D1GATA113、D1S1627、D1S1677、D2S441、D2S1776、D3S3053、D3S4529、D4S2364、D4S2408、D5S2500、D6S474、D6S1017、D8S1115、D9S1122、D9S2157、D10S1248、D10S1435、D11S4463、D12ATA63、D14S1434、D17S974、D17S1301、D18S853、D20S482、D20S1082、D22S1045等33個(gè)STR基因座在中國(guó)人群的遺傳多態(tài)性開(kāi)展調(diào)查研究，對(duì)1800多名個(gè)體進(jìn)行基因型檢測(cè)，根據(jù)各基因座等位基因的分布頻率計(jì)算個(gè)體識(shí)別能力(DP)、雜合度(H)、非父排除率(PE)等數(shù)據(jù)，最終確立了21個(gè)STR基因座的構(gòu)成D6S474、D12ATA63、D22S1045、D10S1248、D1S1677、D11S4463、D1S1627、D3S4529、D2S441、D6S1017、D4S2408、D19S433、D17S1301、D1GATA113、D18S853、D20S482、D14S1434、D9S1122、D2S1776、D10S1435和D5S2500，表明這21個(gè)STR基因座在人群中具有高度的遺傳多態(tài)性和良好的等位基因頻率分布。將上述21個(gè)STR基因座加上用于鑒別人性別的Amelogenin基因座即構(gòu)成本發(fā)明的復(fù)合擴(kuò)增檢驗(yàn)系統(tǒng)。該基因座構(gòu)成突破了現(xiàn)有13個(gè)核心基因座的模式，提供了非C0DIS基因座以外的21個(gè)基因座的分型結(jié)果，是世界上首個(gè)完全非CODIS基因座的熒光檢測(cè)系統(tǒng)，單獨(dú)使用時(shí)是目前市場(chǎng)上單管反應(yīng)提供最多基因座分型結(jié)果(21個(gè)STR基因座加Amelogenin基因座)的產(chǎn)品，具有更高的累計(jì)個(gè)體識(shí)別力和累積非父排除率；或聯(lián)合現(xiàn)常用商業(yè)化試劑盒使用(如下表)，有助于解決公安部打拐數(shù)據(jù)庫(kù)一子多父母、親子鑒定中突變和近親鑒定的問(wèn)題。聯(lián)合使用的系統(tǒng)/試劑盒名稱聯(lián)合檢測(cè)時(shí)提供的STR基因座數(shù)目相同的基因座22個(gè)基因座的熒光標(biāo)記復(fù)合擴(kuò)增檢驗(yàn)系統(tǒng)(本專利)AGCU17+1STR熒光檢測(cè)試劑盒(專利公開(kāi)號(hào)CN101440410A)37Amelogenin、D19S433ABIAMPFLSTR*Identifiler35Amelogenin、D19S433PromegaPowerPlex②1636AmelogeninAGCUMini-補(bǔ)充基因座28Amelogenin、熒光檢測(cè)試劑盒D19S433專利ZL200510096613.635AmelogeninABISinofilermultiplex35AmelogeninSTRtyper-20Gkit39AmelogeninSTRtyper-16GCkit35AmelogeninSTRtyper-10F/Gkit30Amelogenin二、熒光標(biāo)記復(fù)合擴(kuò)增體系的基因座組合方案設(shè)計(jì)本研究對(duì)熒光染料進(jìn)行了鑒別、遴選，選用了FAM、HEX、TAMRA、ROX和SIZ五種熒光標(biāo)記物，構(gòu)建了5色熒光組合方案。在確定5色熒光組合方案的基礎(chǔ)上，通過(guò)大量反復(fù)實(shí)驗(yàn)，在國(guó)內(nèi)首次自行設(shè)計(jì)出基因座組合以及熒光標(biāo)記的方式。從生產(chǎn)成本、各基因座各引物擴(kuò)增效率等方面考慮，選擇了藍(lán)色7個(gè)基因座、綠色6個(gè)、黃色5個(gè)、紅色4個(gè)。采用這種標(biāo)記組合后，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)非目的片段以外的擴(kuò)增峰，這表明各基因座引物序列之間沒(méi)有錯(cuò)配的情況，不會(huì)產(chǎn)生和DNA模板在非目標(biāo)區(qū)域的結(jié)合和擴(kuò)增，即使更換各組的標(biāo)記熒光素也不會(huì)產(chǎn)生非目的擴(kuò)增峰。以下為其中一種優(yōu)選的產(chǎn)品組合方式Amelogenin、D6S474、D12ATA63、D22S1045、D10S1248、D1S1677和D11S4463為一組，熒光標(biāo)記物為6-FAM;D1S1627、D3S4529、D2S441、D6S1017、D4S2408和D19S433為一組，熒光標(biāo)記物為HEX;D17S1301、D1GATA113、D18S853、D20S482和D14S1434為一組，熒光標(biāo)記物為T(mén)AMRA;D9S1122、D2S1776、D10S1435和D5S2500為一組，熒光標(biāo)記物為R0X。內(nèi)標(biāo)選用熒光標(biāo)記物為SIZ。這種獨(dú)創(chuàng)的基因座組合方式使得僅需標(biāo)記四種熒光就可實(shí)現(xiàn)這22個(gè)基因座的同時(shí)檢測(cè)分析。結(jié)果表明我們所使用的這種組合和分色方式，能夠滿足分析的要求，各基因座能夠得到正確的分型結(jié)果，且峰值相對(duì)均衡。在組合方案的基礎(chǔ)上，根據(jù)22個(gè)基因座的側(cè)翼序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，實(shí)現(xiàn)22個(gè)基因座在同一反應(yīng)中的復(fù)合擴(kuò)增，同時(shí)將全部基因座擴(kuò)增產(chǎn)物控制在400bp以內(nèi)而實(shí)現(xiàn)高靈敏度，更加適宜于檢驗(yàn)微量或降解檢材。本發(fā)明在國(guó)內(nèi)首次實(shí)現(xiàn)22個(gè)基因座同時(shí)在單一反應(yīng)中的復(fù)合擴(kuò)增，并以5色熒光標(biāo)記進(jìn)行檢驗(yàn)。三、熒光標(biāo)記STR復(fù)合擴(kuò)增體系的優(yōu)化及建立1、基因座之間平衡度的調(diào)配隨著復(fù)合擴(kuò)增體系中基因座數(shù)目的增加，由于擴(kuò)增競(jìng)爭(zhēng)的影響，各基因座的相對(duì)平衡控制難度加大，通過(guò)多次反復(fù)實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化引物序列、濃度，終達(dá)到平衡。2、復(fù)合擴(kuò)增條件的建立先對(duì)22個(gè)基因座的單一擴(kuò)增條件進(jìn)行優(yōu)化，在成功地建立了單個(gè)基因座擴(kuò)增條件的基礎(chǔ)上，研究22個(gè)基因座復(fù)合擴(kuò)增PCR反應(yīng)條件，通過(guò)大量的反復(fù)實(shí)驗(yàn)確定了復(fù)合擴(kuò)增中的各個(gè)參數(shù)，如，循環(huán)參數(shù)、退火溫度、緩沖液離子強(qiáng)度、酶量、復(fù)合擴(kuò)增反應(yīng)體積的變化以及模板DNA量等，使擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到平衡、特異的要求，建立起復(fù)合擴(kuò)增體系，同時(shí)擴(kuò)增出22個(gè)基因座。本發(fā)明的熒光標(biāo)記復(fù)合擴(kuò)增檢驗(yàn)系統(tǒng)良好的應(yīng)用效果主要表現(xiàn)在下述幾個(gè)方面1.系統(tǒng)的靈敏度高本發(fā)明中22個(gè)基因座的熒光標(biāo)記復(fù)合擴(kuò)增檢驗(yàn)系統(tǒng)在DNA模板量為0.12ng的條件下，可檢出全部22個(gè)基因座。2、特異性強(qiáng)通過(guò)大量反復(fù)驗(yàn)證，本發(fā)明復(fù)合擴(kuò)增結(jié)果無(wú)22個(gè)基因座之外的擴(kuò)增產(chǎn)物。3.遺傳學(xué)調(diào)查用22個(gè)基因座的熒光標(biāo)記復(fù)合擴(kuò)增檢驗(yàn)系統(tǒng)對(duì)中國(guó)漢族群體進(jìn)行遺傳學(xué)調(diào)查，結(jié)果表明在中國(guó)漢族人群中的總體隨機(jī)匹配概率為8.3X10—2°，累積非父排除率為0.9999999893，高于現(xiàn)有技術(shù)所達(dá)到的水平。4.實(shí)際應(yīng)用的效果本發(fā)明中22個(gè)基因座的熒光標(biāo)記復(fù)合擴(kuò)增系統(tǒng)已在國(guó)內(nèi)10個(gè)省市的公安單位中測(cè)試與試用，結(jié)果表明該系統(tǒng)多態(tài)性高，平衡性好，靈敏度高，特異性高，分型結(jié)果準(zhǔn)確，完全能夠滿足實(shí)際案件檢驗(yàn)、DNA數(shù)據(jù)庫(kù)建設(shè)以及親子鑒定的需要。圖1:對(duì)無(wú)關(guān)個(gè)體DNA樣品的STR分型結(jié)果。[0046]圖2:22個(gè)基因座的熒光標(biāo)記復(fù)合擴(kuò)增檢驗(yàn)系統(tǒng)的等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物。圖3:對(duì)實(shí)施例2樣品中的STR分型結(jié)果。圖4:對(duì)實(shí)施例3樣品中的STR分型結(jié)果。具體實(shí)施方式下面的實(shí)施例用來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但這并不意味著對(duì)本發(fā)明的任何限制。實(shí)施例122個(gè)基因座的熒光標(biāo)記復(fù)合擴(kuò)增檢驗(yàn)系統(tǒng)的復(fù)合擴(kuò)增以及熒光檢測(cè)1、22個(gè)基因座的分組及熒光標(biāo)記Amelogenin、D6S474、D12ATA63、D22S1045、D10S1248、D1S1677和D11S4463為一組，熒光標(biāo)記物為6-FAM;D1S1627、D3S4529、D2S441、D6S1017、D4S2408和D19S433為一組，熒光標(biāo)記物為HEX;D17S1301、D1GATA113、D18S853、D20S482和D14S1434為一組，熒光標(biāo)記物為T(mén)AMRA;D9S1122、D2S1776、D10S1435和D5S2500為一組，熒光標(biāo)記物為R0X。內(nèi)標(biāo)選用熒光標(biāo)記物SIZ。2、PCR擴(kuò)增體系組分—人基因組DNA反應(yīng)混合物(含2.5XPCR緩沖液、MgCl21.2-3.0raM和r^c，dNTPs200WM4種dNTP)L0054」引物混合物(21+1，含22個(gè)基因座的22對(duì)引物，濃度范圍在O.1-2uM)熱啟動(dòng)G-Taq酶(5U/uL)sdH203、擴(kuò)增熱循環(huán)(1)將PCR擴(kuò)增管置于熱循環(huán)儀上；(2)選擇下面推薦的程序進(jìn)行擴(kuò)增；(3)擴(kuò)增后的樣品應(yīng)避光保存；熱循環(huán)儀的擴(kuò)增程序初始變性熱循環(huán)終延伸保溫10個(gè)循環(huán)94°C1分鐘，62°Cl分鐘，72°Cl分鐘60°C4°C20個(gè)循環(huán)90°Cl分鐘，60分鐘維持60°Cl分鐘，72°Cl分鐘4、擴(kuò)增產(chǎn)物在遺傳分析儀上熒光檢測(cè)由去離子甲酰胺與系統(tǒng)中分子量?jī)?nèi)標(biāo)(AGCUMarkerSIZ-500)組成上樣混合物〔(0.5iiLAGCUMarkerSIZ-500)X(進(jìn)樣數(shù))+(12yL去離子甲酰胺)X(進(jìn)樣數(shù))〕。將12.5iiL上樣混合物與liiL擴(kuò)增產(chǎn)物或系統(tǒng)中等位基因分析標(biāo)準(zhǔn)物(21+lAllelicLadder)混合，避免產(chǎn)生氣泡。95。C變性3分鐘，冰浴3分鐘，并盡快電泳。用遺傳分析儀檢0.12-2ng10,05.0ixL0.5"補(bǔ)足至25.OuL95。c11分鐘測(cè)分析。5、分型分析用片段分析軟件GeneM即per分析步驟4中遺傳分析儀檢測(cè)收集的數(shù)據(jù)，將樣品分析數(shù)據(jù)和21+1AllelicLadder(見(jiàn)附圖2)比較，得到實(shí)際樣品的基因分型數(shù)據(jù)，結(jié)果見(jiàn)附圖1。實(shí)施例2應(yīng)用22個(gè)基因座的熒光標(biāo)記復(fù)合擴(kuò)增檢驗(yàn)系統(tǒng)進(jìn)行親子鑒定(三聯(lián)體)1、收集親子鑒定案件中的血樣本實(shí)驗(yàn)中樣品由XX親子鑒定所提供。2、Chelex-100法提取基因組DNA取0.55iiL全血或13mmX25mm的血斑置于滅菌的1.5mL離心管中，加入lmL超純水，振蕩數(shù)秒。置于室溫10分鐘，振蕩數(shù)秒。用12，000rpm離心3分鐘。棄上清液，保留足夠上清液蓋沒(méi)沉淀，勿攪起沉淀。加入200iiL5%的Chelex-100，振蕩數(shù)秒。于56t:保溫30分鐘，振蕩數(shù)秒。沸水浴10分鐘，振蕩數(shù)秒。用12，000rpm離心5分鐘，上清中為提取得到的人基因組DNA。3、擴(kuò)增檢測(cè)按照實(shí)施例1進(jìn)行PCR擴(kuò)增、遺傳分析儀檢測(cè)并最終獲得分型結(jié)果。4、結(jié)論由附圖3得到本實(shí)驗(yàn)的親子鑒定父_子_母基因分型如下表1:表1:<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>[0077]在本例三聯(lián)體親子鑒定中，共檢測(cè)21個(gè)STR基因座，其中出現(xiàn)1個(gè)矛盾基因座(如上表中D19S433的分型結(jié)果)，超過(guò)"若出現(xiàn)1個(gè)矛盾基因座，要增加檢測(cè)基因座至19個(gè)"的要求，父權(quán)指數(shù)為84416799，超過(guò)10000，可作出"肯定親生關(guān)系"的結(jié)論。實(shí)施例3應(yīng)用22個(gè)基因座的熒光標(biāo)記復(fù)合擴(kuò)增檢驗(yàn)系統(tǒng)進(jìn)行親子鑒定(單親)1、收集親子鑒定案件中的血樣本實(shí)驗(yàn)中樣品由黑龍江省公安廳提供。2、Chelex-100法提取基因組DNA按照實(shí)施例2，使用Chelex-100法提取基因組DNA。3、擴(kuò)增檢測(cè)按照實(shí)施例1進(jìn)行PCR擴(kuò)增、遺傳分析儀檢測(cè)并最終獲得分型結(jié)果。4、結(jié)論由附圖4得到本實(shí)驗(yàn)的親子鑒定父_子基因分型如下表2:表2:<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>[0088]在本例單親親子鑒定中，共檢測(cè)21個(gè)STR基因座，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)矛盾基因座，可以作出"不排除親生關(guān)系"的結(jié)論。實(shí)施例4應(yīng)用22個(gè)基因座的熒光標(biāo)記復(fù)合擴(kuò)增檢驗(yàn)系統(tǒng)進(jìn)行個(gè)體識(shí)別1、收集血樣本實(shí)驗(yàn)中樣品由XX市公安局提供提供。采集犯罪現(xiàn)場(chǎng)血樣和被害人血樣，采集數(shù)名犯罪嫌疑人血樣(本實(shí)施例中以3名嫌疑人樣本為例)。[OO92]2、Chelex-100法提取基因組DNA按實(shí)施例2中方法提取血樣中的DNA。3、擴(kuò)增檢測(cè)除22個(gè)基因座的分組及熒光標(biāo)記如以下所述之外，其余按照實(shí)施例1所述進(jìn)行PCR擴(kuò)增、遺傳分析儀檢測(cè)并最終獲得分型結(jié)果Amelogenin、D6S474、D12ATA63、D22S1045、D10S1248、D1S1677和D11S4463為一組，熒光標(biāo)記物為HEX;D1S1627、D3S4529、D2S441、D6S1017、D4S2408和D19S433為一組，熒光標(biāo)記物為6-FAM;D17S1301、D1GATA113、D18S853、D20S482和D14S1434為一組，熒光標(biāo)記物為R0X;D9S1122、D2S1776、D10S1435和D5S2500為一組，熒光標(biāo)記物為T(mén)AMRA。內(nèi)標(biāo)選用熒光標(biāo)記物SIZ。4、結(jié)論本實(shí)驗(yàn)的各人員基因分型如下表<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>[0101]在本個(gè)體識(shí)別案例中，共檢測(cè)21個(gè)STR基因座，犯罪嫌疑人C的基因型和犯罪現(xiàn)場(chǎng)的血樣基因型完全一致，可以判斷犯罪嫌疑人C在本案中有重大犯罪嫌疑。權(quán)利要求一種同時(shí)分析人基因組DNA22個(gè)基因座的熒光標(biāo)記復(fù)合擴(kuò)增系統(tǒng)，其特征在于復(fù)合擴(kuò)增分析的22個(gè)基因座為Amelogenin、D6S474、D12ATA63、D22S1045、D10S1248、D1S1677、D11S4463、D1S1627、D3S4529、D2S441、D6S1017、D4S2408、D19S433、D17S1301、D1GATA113、D18S853、D20S482、D14S1434、D9S1122、D2S1776、D10S1435和D5S2500。2.如權(quán)利要求1所述的復(fù)合擴(kuò)增系統(tǒng)，其特征在于所說(shuō)的22個(gè)基因座在一個(gè)復(fù)合擴(kuò)增反應(yīng)體系中同時(shí)擴(kuò)增。3.如權(quán)利要求2所述的復(fù)合擴(kuò)增系統(tǒng)，其特征在于所述的22個(gè)基因座分為四組并分別用四種不同的熒光染料進(jìn)行標(biāo)記。4.如權(quán)利要求3所述的復(fù)合擴(kuò)增系統(tǒng)，其特征在于所述的22個(gè)基因座的分組及熒光標(biāo)記的方式為Amelogenin、D6S474、D12ATA63、D22S1045、D10S1248、D1S1677和D11S4463為一組；D1S1627、D3S4529、D2S441、D6S1017、D4S2408和D19S433為一組；D17S1301、D1GATA113、D18S853、D20S482和D14S1434為一組；D9S1122、D2S1776、D10S1435和D5S2500為一組，使用FAM、HEX、TAMRA、ROX分組標(biāo)記。5.如權(quán)利要求4所述的復(fù)合擴(kuò)增系統(tǒng)，其特征在于所述的22個(gè)基因座的熒光標(biāo)記的方式為FAM標(biāo)記的Amelogenin、D6S474、D12ATA63、D22S1045、D10S1248、D1S1677和D11S4463為一組；HEX標(biāo)記的D1S1627、D3S4529、D2S441、D6S1017、D4S2408和D19S433為一組；TAMRA標(biāo)記的D17S1301、D1GATA113、D18S853、D20S482和D14S1434為一組；以及ROX標(biāo)記的D9S1122、D2S1776、D10S1435和D5S2500為一組。6.如權(quán)利要求5所述的復(fù)合擴(kuò)增系統(tǒng)，其特征在于所述的22個(gè)基因座采用位于該基因座核心重復(fù)區(qū)兩側(cè)的一對(duì)引物擴(kuò)增，其中每對(duì)引物中有一條引物的5'端進(jìn)行熒光染料標(biāo)記。7.如權(quán)利要求6所述的復(fù)合擴(kuò)增系統(tǒng)，其特征在于所述的系統(tǒng)中包括每個(gè)基因座所對(duì)應(yīng)的等位基因標(biāo)準(zhǔn)物的混合物，以確定待檢DNA樣品中各個(gè)基因座的基因型。8.如權(quán)利要求7所述的復(fù)合擴(kuò)增系統(tǒng)，其特征在于所述的系統(tǒng)中用于鑒別待檢DNA樣品性別的基因座是Amelogenin基因座。9.如權(quán)利要求8所述的復(fù)合擴(kuò)增系統(tǒng)，其特征在于其多個(gè)基因座的復(fù)合擴(kuò)增采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，其擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)方法采用多道或單道毛細(xì)管電泳。10.—種同時(shí)分析人基因組DNA的方法，其特征在于應(yīng)用權(quán)利要求l-9任一項(xiàng)所述的復(fù)合擴(kuò)增系統(tǒng)來(lái)進(jìn)行DNA樣品分析。11.如權(quán)利要求l-9任一項(xiàng)所述的復(fù)合擴(kuò)增系統(tǒng)，其特征在于其適用的DNA樣品來(lái)源包括精斑、唾液斑、組織、血痕或血液。專利摘要本發(fā)明涉及一種新的熒光標(biāo)記復(fù)合擴(kuò)增檢驗(yàn)系統(tǒng)，該系統(tǒng)可以同時(shí)分析人基因組DNA22個(gè)基因座的遺傳多態(tài)性，其中的22個(gè)基因座分為4組，共涉及5種顏色的熒光標(biāo)記。本發(fā)明的熒光標(biāo)記復(fù)合擴(kuò)增檢驗(yàn)系統(tǒng)提供用于復(fù)合擴(kuò)增22個(gè)基因座的寡核苷酸引物混合物；系統(tǒng)中還包括每個(gè)基因座的等位基因標(biāo)準(zhǔn)物，以確定待檢DNA樣品中各個(gè)基因座的基因型；系統(tǒng)中包含的用于鑒別DNA樣品性別的基因座是Amelogenin基因座。該系統(tǒng)的檢測(cè)結(jié)果表明其多態(tài)性高、平衡性好、靈敏度高、特異性高、分型結(jié)果準(zhǔn)確，完全能夠滿足實(shí)際案件檢驗(yàn)、DNA數(shù)據(jù)庫(kù)建設(shè)以及親子鑒定的需要。在中國(guó)漢族人群中的總體隨機(jī)匹配概率為8.3×10-20，累積非父排除率為0.9999999893。文檔編號(hào)C12Q1/68GKCN101698890SQ200910224287公開(kāi)日2010年4月28日申請(qǐng)日期2009年11月26日發(fā)明者萬(wàn)慧榮,劉未斌,夏子芳,杜蔚安,湯文文,熊勇華,鄭衛(wèi)國(guó)申請(qǐng)人:無(wú)錫中德美聯(lián)生物技術(shù)有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX,EndNote,RefMan