專(zhuān)利名稱(chēng)：：熱穩(wěn)定可逆失活酶類(lèi)的再激活的增強(qiáng)的制作方法熱穩(wěn)定可逆失活酶類(lèi)的再激活的增強(qiáng)相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用本申請(qǐng)要求以2006年6月28日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)NO.60/817,043和2006年10月19日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)No.60/852，804作為優(yōu)先權(quán)基礎(chǔ)，這兩份申請(qǐng)均通過(guò)援引全文納入本申請(qǐng)。
背景技術(shù)：
：一些分子生物學(xué)方法需要已存在于反應(yīng)中的、可受控激活的酶。這使得可在預(yù)定的時(shí)間點(diǎn)在同一反應(yīng)容器中起動(dòng)相繼的酶解過(guò)程，或者避免由于過(guò)早開(kāi)始酶反應(yīng)而產(chǎn)生不良副產(chǎn)物。就使用經(jīng)化學(xué)修飾的熱穩(wěn)定酶類(lèi)而言，對(duì)熱穩(wěn)定DNA聚合酶的這兩類(lèi)修飾已被描述(參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利No.5,677,152、5,773,258和6，183，998，通過(guò)援引將其全文納入本文)。這種修飾還可應(yīng)用于其它熱穩(wěn)定酶，原因在于所有酶中所含的氨基酸例如具有游離NH2-基團(tuán)的氨基酸可由這些化學(xué)物質(zhì)所修飾，并且這些氨基酸通常涉及酶的催化中心。另外，美國(guó)專(zhuān)利No.6，183,998教導(dǎo)了用醛類(lèi)交聯(lián)酶分子，該交聯(lián)一般適于修飾任何熱穩(wěn)定酶。這種經(jīng)化學(xué)修飾的酶類(lèi)的活性可通過(guò)熱孵育步驟恢復(fù)，所述熱孵育步驟可斷裂連接到氬基酸殘基上的共價(jià)鍵，由此恢復(fù)酶的催化活性。但是，由于所選擇的修飾物濃度或失活方法，酶活性?xún)H以緩慢速率恢復(fù)。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)含氮化合物可顯著提高經(jīng)化學(xué)修飾的酶類(lèi)的酶活性，并且它們不影響未修飾的酶。因此，本發(fā)明首次描述了使經(jīng)化學(xué)修飾的酶的再激活增強(qiáng)的機(jī)制，該機(jī)制適于多種應(yīng)用例如用于提高酶反應(yīng)速度。
發(fā)明內(nèi)容依照本文所具體充分描述的公開(kāi)的材料、化合物、組合物、物品和方法的目的，所公開(kāi)主題一方面涉及化合物和組合物以及制備和使用所述化合物和組合物的方法。另一方面，所公開(kāi)主題涉及使用一種或多種含氮化合物來(lái)增強(qiáng)可逆失活熱穩(wěn)定酶類(lèi)的再激活。其它優(yōu)點(diǎn)一部分將在隨后的說(shuō)明書(shū)中進(jìn)行闡述，另一部分可顯而易見(jiàn)于說(shuō)明書(shū)或者可通過(guò)實(shí)施下述各方面獲知。下述優(yōu)點(diǎn)可通過(guò)在所附權(quán)利要求書(shū)中具體指出的要素和組合實(shí)現(xiàn)和獲得。應(yīng)理解的是，上文的概述和隨后的詳述均是示例性的，僅僅用于解釋而無(wú)意于限定。納入本文并構(gòu)成本說(shuō)明書(shū)的一部分的附圖對(duì)下述幾方面進(jìn)行了圖示。圖1為來(lái)自加入不同濃度三唑的快速PCR反應(yīng)的瓊脂糖凝膠。圖2為一組表格和相應(yīng)組圖，每個(gè)表格示出獲自加入不同濃度具體氨化合物的反應(yīng)的平均Ct佳。圖3為一組獲自加入不同濃度氯化銨的三個(gè)快速PCR反應(yīng)的三個(gè)瓊脂糖凝膠。圖4為獲自存在氯化銨和不同濃度三唑時(shí)的快速PCR反應(yīng)的瓊脂糖凝膠。具體實(shí)施例方式通過(guò)參考下文的對(duì)所公開(kāi)主題具體方面和其中包括的實(shí)施例的詳細(xì)描述并參考附圖，可更容易理解本文所述材料、化合物、組合物、物品和方法。公開(kāi)和描述本發(fā)明材料、化合物、組合物、物品和方法之前，應(yīng)理解的是下述各方面并不限于具體的合成方法或具體的試劑，因?yàn)樗鼈兝硭?dāng)然可有所變化。還應(yīng)理解的是，本文所使用的術(shù)語(yǔ)僅僅是為了描述具體方面，而無(wú)意于限定。還在通篇說(shuō)明書(shū)中引用了多篇出版物。這些出版物的公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)援引全文納入本申請(qǐng)，目的在于充分描述與所公開(kāi)主題相關(guān)的現(xiàn)有技術(shù)的狀況。基于倚賴(lài)參考文獻(xiàn)的句子中所論述的包含在所述參考文獻(xiàn)中的素材，公開(kāi)的參考文獻(xiàn)也通過(guò)引用的方式單獨(dú)地并特別地納入本說(shuō)明書(shū)?？偟亩x在本說(shuō)明書(shū)及隨后的權(quán)利要求書(shū)中，會(huì)提及一些術(shù)語(yǔ)，這些術(shù)語(yǔ)應(yīng)被定義為具有下述含義整篇本說(shuō)明書(shū)的描述和權(quán)利要求中，詞語(yǔ)"包含"和該詞的其它形式例如"包括"和"含有"意味著包括但不限于，而且無(wú)意于排除例如其它添加劑、組分、整數(shù)或步驟。除非上下文中另外明確指出，在本說(shuō)明書(shū)和所附權(quán)利要求書(shū)中使用的單數(shù)形式的"一"、"一種"和"該"包括復(fù)數(shù)指代對(duì)象。因此，例如，提及"一種化合物"包括兩種或多種這類(lèi)化合物的混合物，提及"一種酶"包括兩種或多種這類(lèi)酶的混合物，提及"該引物"包括兩種或多種這類(lèi)引物的混合物等等。本文所使用術(shù)語(yǔ)"取代的"，考慮包括有機(jī)化合物的所有容許的取代基。在一個(gè)大方面，容許的取代基包括有機(jī)化合物的無(wú)環(huán)與有環(huán)、支鏈與無(wú)支鏈、碳環(huán)與雜環(huán)以及芳香族與非芳香族取代基。示例性取代基包括例如下述的取代基。恰當(dāng)有機(jī)化合物的容許取代基可有一個(gè)或多個(gè)，并且可相同或不同。就本發(fā)明公開(kāi)內(nèi)容的目的而言，雜原子例如氮可具有氫取代基和/或滿(mǎn)足雜原子化合價(jià)的本文所述有機(jī)化合物的任何容許取代基。該公開(kāi)內(nèi)容無(wú)意于以任何方式被有機(jī)化合物容許的取代基限定。同樣，術(shù)語(yǔ)"取代"或"被……取代"包含這樣一種隱含前提這種取代與所取代原子和取代基容許的化合價(jià)相一致，并且這種取代可得到穩(wěn)定的化合物，例如不會(huì)通過(guò)例如重排、環(huán)化、消除等發(fā)生自發(fā)轉(zhuǎn)化的化合物。本文所使用的術(shù)語(yǔ)"烷基，，為1至24個(gè)碳原子的支鏈或無(wú)支鏈飽和烴基，例如曱基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、異戊基、仲戊基、新戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十二烷基、十四烷基、十六烷基、二十烷基、二十四烷基等等。烷基基團(tuán)還可以是取代的或未取代的。烷基基團(tuán)可被一個(gè)或多個(gè)基團(tuán)所取代，所述一個(gè)或多個(gè)基團(tuán)包括但不限于本文所述的取代的或未取代的烷基、環(huán)烷基、烷氧基、鏈烯基、環(huán)烯基、炔基、環(huán)炔基、芳基、雜芳基、醛、氨基、羧酸、硼酸、酯、醚、卣化物、羥基、酮、疊氮化物、硝基、氧肟酸鹽、曱硅烷基、疏代-氧代(sulfo-oxo)或巰基。"低級(jí)烷基，，基團(tuán)是含有一至六個(gè)碳原子的烷基基團(tuán)。本文所使用的"烷氧基"為通過(guò)醚鍵鍵合的烷基或環(huán)烷基；也就是說(shuō)，"烷氧基"基團(tuán)可定義為一OA1，其中V為上文定義的烷基或環(huán)烷基。本文所使用的術(shù)語(yǔ)"鏈烯基"為其結(jié)構(gòu)式含有至少一個(gè)碳碳雙鍵的2至24個(gè)碳原子烴基。不對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)例如(Al2)C=C(A3A4)旨在包括E和Z異構(gòu)體。這可從存在不對(duì)稱(chēng)烯的本發(fā)明結(jié)構(gòu)式推定，或者可由鍵合符號(hào)C吒明示。鏈烯基可被一個(gè)或多個(gè)基團(tuán)所取代，所述一個(gè)或多個(gè)基團(tuán)包括但不限于本文所述取代的或未取代的烷基、環(huán)烷基、烷氧基、鏈烯基、環(huán)烯基、炔基、環(huán)炔基、芳基、雜芳基、醛、氨基、羧酸、硼酸、酯、醚、由化物、鞋基、酮、疊氮化物、硝基、氧肟酸鹽、甲硅烷基、硫代氧代或巰基。本文所使用術(shù)語(yǔ)"炔基"為其結(jié)構(gòu)式含有至少一個(gè)碳碳三鍵的2至24碳原子烴基。炔基可未被取代，或者被一個(gè)或多個(gè)基團(tuán)所取代，所述一個(gè)或多個(gè)基團(tuán)包括但不限于本文所述取代的或未取代的烷基、環(huán)烷基、烷氧基、鏈烯基、環(huán)烯基、炔基、環(huán)炔基、芳基、雜芳基、醛、氨基、羧酸、硼酸、酯、醚、卣化物、羥基、酮、疊氮化物、硝基、氧肝酸鹽、曱硅烷基、硫代氧代或巰基。術(shù)語(yǔ)"?；?表示含10個(gè)或少于IO個(gè)連續(xù)C原子的相應(yīng)酸的衍生物。這些酸部分可具有其它烷基基團(tuán)或官能團(tuán)例如羥基、氨基、羧基、磺酸、酯或醚基團(tuán)。本文所使用術(shù)語(yǔ)"芳基"是包含任意基于碳的芳香族基團(tuán)的基團(tuán)，包括但不限于苯、萘、苯基、聯(lián)苯基、苯氧基苯(phenoxybenzene)等。術(shù)語(yǔ)"芳基"還包括"雜芳基'，，它被定義為含有芳香族基團(tuán)、且所述芳香族基團(tuán)的環(huán)內(nèi)摻入了至少一個(gè)雜原子的基團(tuán)。雜原子的實(shí)例包括但不限于氮、氧、硫和磷。同樣，也包含在術(shù)語(yǔ)"芳基"中的術(shù)語(yǔ)"非雜芳基"定義為含有不含雜原子的芳香族基團(tuán)的基團(tuán)。芳基基團(tuán)可為取代的或未取代的。芳基基團(tuán)可被一個(gè)或多個(gè)基團(tuán)所取代，所述一個(gè)或多個(gè)基團(tuán)包括但不限于本文所述取代的或未取代的烷基、環(huán)烷基、烷氧基、鏈烯基、環(huán)烯基、炔基、環(huán)炔基、芳基、雜芳基、醛、氨基、羧酸、硼酸、酯、醚、卣化物、羥基、酮、疊氮化物、硝基、氧肟酸鹽、曱硅烷基、硫代氧代或巰基。術(shù)語(yǔ)"聯(lián)芳基"為特定類(lèi)型的芳基基團(tuán)，它包含在"芳基'，的定義之中。聯(lián)芳基指的是通過(guò)例如萘中的稠環(huán)結(jié)構(gòu)鍵合在一起、或者通過(guò)例如聯(lián)苯中的一個(gè)或多個(gè)碳碳鍵連接的兩個(gè)芳基基團(tuán)。術(shù)語(yǔ)"苯基"包含在芳基的含義之中，并指芐基部分，它可具有連接到環(huán)上的其它烷基鏈(含4個(gè)或少于4個(gè)連續(xù)C原子)或官能團(tuán)例如羥基、氨基、硝基、H基、磺酸、酯、醚或鹵素基團(tuán)。本文所使用的術(shù)語(yǔ)"胺"或"氨基"由式NAHs表示，其中A1、A2和/〖3可獨(dú)立地為氫或本文所述取代的或未取代的烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、環(huán)烯基、炔基、環(huán)炔基、芳基或雜芳基基團(tuán)。術(shù)語(yǔ)"M烷基"指具有烷基部分的M基團(tuán)。術(shù)語(yǔ)"烷基"定義如上。同樣，氨基烷基的衍生物與烷基基團(tuán)的衍生物相對(duì)應(yīng)。本文所使用的術(shù)語(yǔ)"氮雜五元環(huán)(azole)"為在環(huán)上含有至少一個(gè)氮原子的取代的或未取代的或者稠合的五元環(huán)。本文所使用術(shù)語(yǔ)"羧酸，，由式一C(0)0H表示。本文所使用術(shù)語(yǔ)"酯"由式一0C(0)Y或一C(0)0^表示，其中(為本文所述取代的或未取代的烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、環(huán)烯基、炔基、環(huán)炔基、芳基或雜芳基基團(tuán)。本文所使用術(shù)語(yǔ)"醚"由式A^A2表示，其中V和f可獨(dú)立地為本文所述取代的或未取代的烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、環(huán)烯基、炔基、環(huán)炔基、芳基或雜芳基。本文所使用術(shù)語(yǔ)"面化物"或"囟素"指面素氟、氯、溴和碘。本文所使用術(shù)語(yǔ)"羥基，，由式一OH表示。本文所使用術(shù)語(yǔ)"酮"由式A^(0)AZ表示，其中V和A'可獨(dú)立地為本文所述取代的或未取代的烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、環(huán)烯基、炔基、環(huán)炔基、芳基或雜芳基。本文所使用術(shù)語(yǔ)"疊氮化物"由式一N3表示。本文所使用術(shù)語(yǔ)"硝基"由式一N02表示。本文所使用術(shù)語(yǔ)"腈"由式一CN表示。本文所使用術(shù)語(yǔ)"曱硅烷基"由式一SiAH3表示，其中A1、^和A3可獨(dú)立地為氬或本文所述取代的或未取代的烷基、環(huán)烷基、烷氧基、鏈烯基、環(huán)烯基、炔基、環(huán)炔基、芳基或雜芳基。本文所使用的術(shù)語(yǔ)"硫代-氧代"由式一S(0)A1、一S(0)A1、一OS(0)A1或一0S(0)20^表示，其中Ai可為氫或本文所述取代的或未取代的烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、環(huán)烯基，炔基、環(huán)炔基、芳基或雜芳基基團(tuán)。整個(gè)說(shuō)明書(shū)中，"S(O)"是S-O的縮寫(xiě)符號(hào)。本文所使用術(shù)語(yǔ)"磺?；?指的是由式一S(0)^表示的硫代-氧代基團(tuán)，其中V可為氬或本文所述取代的或未取代的烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、環(huán)烯基，炔基、環(huán)炔基、芳基或雜芳基基團(tuán)。本文所使用術(shù)語(yǔ)"砜"可由式^S(0)2^表示，其中Y和Ai可獨(dú)立地為本文所述取代的或未取代的烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、環(huán)烯基、炔基、環(huán)炔基、芳基或雜芳基基團(tuán)。本文所使用術(shù)語(yǔ)"亞砜，，由式^S(0)Ai表示，其中^和V可獨(dú)立地為本文所述取代的或未取代的烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、環(huán)烯基，炔基、環(huán)炔基、芳基或雜芳基基團(tuán)。本文所使用術(shù)語(yǔ)"巰基"由式一SH表示。本文所使用"R1，，、"R2，，和"X"可獨(dú)立地具有上述一個(gè)或多個(gè)基團(tuán)。例如，若R1為烷基基團(tuán)，則所述烷基的氫原子之一任選可被羥基基團(tuán)、烷氧基基團(tuán)、烷基基團(tuán)、鹵化物等所取代。根據(jù)所選擇的基團(tuán)，第一個(gè)基團(tuán)可摻入第二個(gè)基團(tuán)之中，或者第一個(gè)基團(tuán)可懸吊于(即連接)第二個(gè)基團(tuán)之上。例如短語(yǔ)"含氨基的烷基"為氨基摻入烷基的骨架之中?；蛘?，氨基可與烷基的骨架相連。所選基團(tuán)的性質(zhì)可確定第一個(gè)基團(tuán)是嵌于第二個(gè)基團(tuán)之中還是與"M目連?，F(xiàn)將以所公開(kāi)材料、化合物、組合物、物品和方法的具體方面為詳細(xì)參考，它們的實(shí)例將在所附實(shí)施例和附圖中闡述。方法和纟且合物本發(fā)明提供了一種增強(qiáng)可逆失活熱穩(wěn)定酶類(lèi)的再激活的方法。具體而言，所公開(kāi)的方法涉及使用其特征在于下式1-6的含氮化合物，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>其中每個(gè)X各自獨(dú)立地為CH、CR、N、0或S;并且每個(gè)R各自獨(dú)立地為H,取代的或未取代的烷基、鏈烯基、炔基、烷氧基或芳基，羥基，氨基，硝基，羧酸，酯，磺酸，醚或卣素基團(tuán)。如本文所公開(kāi)的那樣，可使用這些化合物(包括其混合物在內(nèi))來(lái)增強(qiáng)熱穩(wěn)定可逆失活酶的再激活。在多個(gè)實(shí)例中，本文公開(kāi)了用于增強(qiáng)熱穩(wěn)定可逆失活酶的再激活的方法，所述方法包括在含氮化合物的存在下再激活至少一種熱穩(wěn)定可逆失活酶。適用于本文的含氮化合物的具體實(shí)施例包括但不限于氮雜五元環(huán)。合適的氮雜五元環(huán)可包括具有式1的含氮五元環(huán)化合物，其中每個(gè)X各自獨(dú)立地為CH、CR或N,并且R可為H，取代的或未取代的烷基、鏈烯基、炔基、烷氧基或芳基基團(tuán)，羥基，氨基，硝基，羧酸，酯，磺酸，醚或卣素基團(tuán)。在另一實(shí)例中，合適的氮雜五元環(huán)可包括具有式2的含氮五元環(huán)化合物，其中每個(gè)X各自獨(dú)立地為CH、CR、N、0或S，并且每個(gè)R可各自獨(dú)立地為H,取代的或未取代的烷基、鏈烯基、炔基、烷氧基或芳基基團(tuán)，羥基，氨基，硝基，羧酸，酯，磺酸，醚或鹵素基團(tuán)。在另一實(shí)例中，每個(gè)X可各自獨(dú)立地為任意組合的CH或N。在又一實(shí)例中，合適的氮雜五元環(huán)可包括具有式3的含氮二環(huán)化合物，其中每個(gè)X可各自獨(dú)立地為CH、CR、N、0或S，并且每個(gè)R可各自獨(dú)立地為H,取代的或未取代的烷基、鏈烯基、炔基、烷氧基或芳基基團(tuán)，羥基，，硝基，羧酸，酯，磺酸，醚或鹵素基團(tuán)。本文還公開(kāi)了增強(qiáng)熱穩(wěn)定可逆失活酶的再激活的方法，所述方法包括，在包括具有式4的吡啶的化合物的存在下再激活至少一種熱穩(wěn)定可逆失活酶，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>其中每個(gè)X可各自獨(dú)立地為CH、CR或N，并且R可為羥基、氮基、巰基或氨基烷基基團(tuán)，或其衍生物。另外，本文公開(kāi)了增強(qiáng)熱穩(wěn)定可逆失活酶的再激活的方法，所述方法包括，在包括具有式5的N-氫氧化物的化合物的存在下再激活至少一種熱穩(wěn)定可逆失活酶，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>其中每個(gè)R可各自獨(dú)立地為H,取代的或未取代的烷基、鏈烯基、炔基、烷氧基或芳基基團(tuán)，或?；鶊F(tuán)或其衍生物。在又一實(shí)施例中，本文公開(kāi)了增強(qiáng)熱穩(wěn)定可逆失活酶的再激活的方法，所述方法包括，在包括具有式6的肼的化合物的存在下激活至少一種熱穩(wěn)定可逆失活酶，R、<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>其中每個(gè)R可各自獨(dú)立地為H,取代的或未取代的烷基、鏈烯基、炔基、烷氧基或芳基基團(tuán)，或?；鶊F(tuán)或其衍生物。在又一實(shí)例中，本文公開(kāi)了增強(qiáng)熱穩(wěn)定可逆失活酶的再激活的方法，所述方法包括在銨鹽的存在下再激活至少一種熱穩(wěn)定可逆失活酶。銨鹽可為包含式+服4的帶正電荷氮類(lèi)和帶負(fù)電荷的無(wú)機(jī)反荷離子、有機(jī)反荷離子、金屬氧化物反荷離子或金屬^物反荷離子反荷離子的任何化合物，所述式+NR4的帶正電荷氮類(lèi)中每個(gè)R各自獨(dú)立地為H，取代的或未取代的烷基、鏈烯基、炔基、烷氧基或芳基，羥基，氨基，硝基，羧酸，酯，磺酸，醚或鹵素基團(tuán)。銨鹽的合適帶正電荷氮類(lèi)為肌和四烷基銨。銨鹽中合適的反荷離子可帶一個(gè)或多個(gè)負(fù)電荷。合適的反荷離子的實(shí)例包括但不限于無(wú)機(jī)反荷離子如卣素(如F—、C廠、Br—和r)、擬卣素(如SCN—和0CN—)、高氯酸根(cior)、氯酸根(CIO,)、亞氯酸根(C1(V)、次氯酸根(C1(T)、溴酸根(Br03)、高硤酸根(I(V)、硫離子(S2—)、硫酸根(SO,)、亞硫酸根(SO廣)、硫酸氫根(HS04—)、磷離子(P3—)、磷酸根(P043—)、磷酸氫根(HP042—)、磷酸二氫根(H2P04—)、亞磷酸根(PO。、氮離子(N3—)、硝酸根(NOO、亞硝酸根(NO廣)、氫氧根(0H—)、過(guò)氧根(022—)、六氟磷酸根(PF「)和高錳酸根(MnOO。合適的反荷離子的其它實(shí)例包括但不限于有機(jī)反荷離子例如碳酸根(C032—)、碳酸氫根(HC03—)、甲酸根(CH(V)、乙酸根(CH3C02—)和其它烷基羧酸根(RCO「，其中R為烷基，如丙酸根、丁酸才艮等)、草酸才艮(C20,)、酒石酸才艮和蘋(píng)果酸才艮(C4H4062—)、檸檬酸才艮(C6H5073—)和苯曱酸才艮(C6H5C02)。其它適合的反荷離子包括但不限于金屬氧化物和金屬絡(luò)合物。金屬氧化物和金屬絡(luò)合物的實(shí)例包括原釩酸根、鉬酸根(Mo力24)、六氰亞鐵酸根(FeCN6廣和硝酸鈰。本文公開(kāi)的任何反荷離子可與本文公開(kāi)的任何銨類(lèi)聯(lián)合形成銨鹽。合適的銨鹽的一些具體實(shí)例包括但不限于氯化銨(NIW:i)、磷酸二氫銨(NH4H2P04)、磷酸氳二銨((麗4)2肝0》、(匪4)艮(NH4)4(Fe(CN)6)、醋酸銨(NH4CH3C02)、碳酸銨((NH4)2C03)、鉬酸銨(NH4Mo7024)、高氯酸銨(NH4C104)、檸檬酸銨((NH4)3C6H507)、苯曱酸銨(NH4C6H5C02)和磷酸銨((NH4)3P04)。應(yīng)該理解的是，可對(duì)本文所公開(kāi)的方法作一些調(diào)整。例如，若銨鹽的反荷離子可與反應(yīng)中的Mg(其作為輔因子是酶所必需的)螯合，則該鹽對(duì)再激活也具有相同作用。但是，必須提高反應(yīng)中的Mg濃度以補(bǔ)償反荷離子的螯合作用。同樣，若反荷離子對(duì)酶有抑制作用，則可優(yōu)化濃度，使其既有效又沒(méi)有抑制作用。在一個(gè)具體方面，銨鹽可與本文所公開(kāi)的任何氮雜五元環(huán)、嘧啶、N-羥胺或肼一起使用。正如下文更充分描述的那樣，本文所公開(kāi)的銨鹽與本文所公開(kāi)的任何其它含氮化合物一起使用可產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)。本文所公開(kāi)的方法中，本文所7>開(kāi)的氮雜五元環(huán)、嘧啶、N-羥胺和肼存在的濃度可為從約0.5mM至約1M,例如約O.5、1、5、10、15、20、25、30、35、40、,45、50、55、60、65、,70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、405、410、415、420、425、430、435、440、445、450、455、460、465、470、475、480、485、490、495、500、505、510、515、520、525、530、535、540、545、550、555、560、565、570、575、580、585、590、595、600、605、610、615、620、625、630、635、640、645、650、655、660、665、670、675、680、685、690、695、700、705、710、715、720、725、730、735、740、745、750、755、760、765、770、775、780、785、790、795、800、805、810、815、820、825、830、835、840、845、850、855、860、865、870、875、880、885、890、895、900、905、910、915、920、925、930、935、940、945、950、955、960、965、970、975、980、985、990、995、1000mM，其中任何指明的數(shù)值可形成某個(gè)范圍的上限或下限端點(diǎn)。對(duì)于銨鹽而言，銨類(lèi)可為所列出的任何濃度。在某些實(shí)施例中，銨化合物并非擰檬酸銨、磷酸氫二銨、苯曱酸銨、碳酸銨或硫酸銨。所公開(kāi)方法可應(yīng)用到涉及核酸操作如擴(kuò)增、連接、核酸外切或核酸內(nèi)切反應(yīng)，或核酸拓樸學(xué)發(fā)生改變的S^1反應(yīng)的所有應(yīng)用中，其中通過(guò)在升高的溫度下、在本文所述含氮化合物的存在下，在預(yù)定酶促反應(yīng)之前孵育反應(yīng)混合物或?qū)⒋朔跤鳛轭A(yù)定酶促反應(yīng)的一部分，從而使所述失活酶得以再激活。實(shí)施例下面給出以下實(shí)施例以闡述所公開(kāi)主題的方法和結(jié)果。這些實(shí)施例無(wú)意于嚢括本文所公開(kāi)主題的所有方面，而意在闡述代表性的方法和結(jié)果。這些實(shí)施例無(wú)意于排除對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言顯而易見(jiàn)的本發(fā)明的等價(jià)方案和變化方案。對(duì)于數(shù)字(例如數(shù)量、溫度等)，已經(jīng)努力確保其準(zhǔn)確性，但應(yīng)該考慮到會(huì)存在一些誤差和偏差。除非另有說(shuō)明，份數(shù)為重量份數(shù)，溫度以x:為單位或者為環(huán)境溫度，壓力等于或接近大氣壓。反應(yīng)條件例如組分濃度、所需溶劑、溶劑混合物、溫度、壓力和可用于使自所述方法獲得的產(chǎn)品純度和產(chǎn)量最優(yōu)化的反應(yīng)范圍和條件等可有很多變化和組合。優(yōu)化這些過(guò)程條件僅需要合理且常規(guī)的實(shí)驗(yàn)。作為對(duì)本發(fā)明進(jìn)行舉例說(shuō)明的模型體系，選擇了熱啟動(dòng)PCR和兩種可商購(gòu)的酶。由于兩種聚合酶由不同的化學(xué)修飾物所失活，因此這表現(xiàn)出本發(fā)明的屬間適應(yīng)性。AmpliTaqGold(AppliedBiosystems)可通過(guò)4吏用二羧酸酐以化學(xué)方式失活，而HotStarTaq(QIAGEN)可通過(guò)l吏用甲醛以化學(xué)方式失活。選擇熱啟動(dòng)PCR作為模型體系是基于如下理由(i)聚合酶鏈反應(yīng)是廣泛使用的分子生物學(xué)手段，因此可闡述本發(fā)明的經(jīng)濟(jì)價(jià)值；(ii)基于反應(yīng)所固有的高效率，PCR是一個(gè)很好的模型體系，該模型可表明本發(fā)明所使用的物質(zhì)并不會(huì)影響含有未修飾酶的反應(yīng)，并且在反應(yīng)中含有經(jīng)化學(xué)修飾的酶時(shí)還能更進(jìn)一步增強(qiáng)這類(lèi)反應(yīng)的效率。為容易地說(shuō)明酶反應(yīng)效率的提高，選擇了實(shí)時(shí)PCR。在實(shí)時(shí)PCR中，酶促反應(yīng)可通過(guò)測(cè)量整個(gè)反應(yīng)中的熒光信號(hào)而被連續(xù)監(jiān)測(cè)。PCR反應(yīng)期間可形成雙鏈DNA分子。通過(guò)^吏用僅選擇性結(jié)合dsDNA的SYBRGreenI熒光染料可檢測(cè)這些PCR產(chǎn)物。因此，熒光的增強(qiáng)表明PCR產(chǎn)物量的提高，由此表明包含在反應(yīng)中的DM聚合酶的活性提高。一旦總的熒光相對(duì)于背景熒光信號(hào)顯著增強(qiáng)，則達(dá)到了所謂的CT值。因此，CT值是在反應(yīng)中所含的酶活性的一個(gè)量度低CT值表明反應(yīng)中存在的酶活性較高，高Ct佳表明反應(yīng)中存在的酶活性較低。另外，另一個(gè)實(shí)施例示出通過(guò)產(chǎn)生的濃度依賴(lài)PCR產(chǎn)物產(chǎn)量對(duì)一種所選擇物質(zhì)(三唑)進(jìn)行的滴定測(cè)定及其對(duì)提高PCR中酶活性的作用。實(shí)施例1使用HotSUrTaqDNA聚合酶(QIAGEN)或AmpliTaqGold(A卯liedBiosystems)進(jìn)行基于SYBRGreenI的PCR反應(yīng)，同時(shí)使用未修飾的TaqDM聚合酶(QIAGEN)作為對(duì)照反應(yīng)。每個(gè)反應(yīng)含有0.625單位的各DNA聚合酶、各DNA聚合酶的1xPCR反應(yīng)緩沖系、每種dNTP各200一、0.5一引物A:5，-GTCACCTTCACCGTTCCAGT-3，(SEQIDNO:1)、0.5jiM引物B:5，-CTCTTCCAGCCTTCCTTCCT-3，(SEQIDNO:2)、PCR級(jí)水，在測(cè)試含氮化合物的實(shí)例中，加入終濃度為100mM的三唑。每個(gè)反應(yīng)包含作為擴(kuò)增底物的10ng人基因組DNA。以在951C進(jìn)行5分鐘酶激活步驟來(lái)開(kāi)始PCR反應(yīng)，隨后進(jìn)行50個(gè)如下循環(huán)94T，15秒；60n，60秒。通過(guò)比較未添加三喳和添加100mM三哇的反應(yīng)，可從三個(gè)重復(fù)反應(yīng)中測(cè)定平均Ct但。<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>結(jié)果在使用TaqDNA聚合酶時(shí)，加入三唑?qū)γ富钚詻](méi)有影響，但是在使用經(jīng)化學(xué)修飾的酶HotStarTaqDNA聚合酶和AmpliTaqGold時(shí)，含有三唑的反應(yīng)表現(xiàn)出明顯較高的酶活性。實(shí)施例2在不存在三唑以及存在濃度遞增的三唑的情況下，進(jìn)行了含有經(jīng)化學(xué)修飾的HotStarTaqDNA聚合酶的、循環(huán)時(shí)間顯著縮短的快速PCR反應(yīng)。每個(gè)PCR反應(yīng)含有1.5單位HotStarTaqDNA聚合酶、10ng模;fclA基因組DM、每種dNTP各200—、Q.5—引物A:5，-CACACAGCGATGGCAGCTATGC-3，(SEQIDNO:3)、0.5引物B:5，-CCCAGTGATGGGCCAGCTC-3，(SEQIDNO:4)、PCR級(jí)水，并且在測(cè)試含氮化合物的實(shí)例中，加入終濃度為100mM、200mM、300mM、400mM和500mM的三峻。以在進(jìn)行5分鐘酶激活步驟來(lái)開(kāi)始PCR反應(yīng)，隨后進(jìn)行35個(gè)如下循環(huán)96匸，5秒；60°C，5秒和68X:，30秒。在1%TAE瓊脂糖凝膠上分析PCR產(chǎn)物(圖1)。結(jié)果不存在三唑的快速PCR顯示僅形成非特異性副產(chǎn)物，而即便是在快速循環(huán)PCR條件下，加入其中任一濃度的三唑均會(huì)顯著提高形成所需PCR產(chǎn)物的酶活性。實(shí)施例34吏用HotStarTaqDNA聚合酶(QIAGEN)進(jìn)4亍基于SYBRGreenI的PCR反應(yīng)，同時(shí)使用未修飾的TaqDNA聚合酶(QIAGEN)作為對(duì)照反應(yīng)。每個(gè)反應(yīng)(反應(yīng)體積20jiL)含有不含HotStarTAQDNA聚合酶和(冊(cè)4)2304的QuantiTectSYBRGreenPCRMasterMix、1.0單位的各腿聚合酶和0.5MM引物A:5，-GTCACCTTCACCGTTCCAGT-3，(SEQIDNO:5)、0.5引物B:5，-CTCTTCCAGCCTTCCTTCCT-3，(SEQIDNO:6)、PCR級(jí)水，并且在測(cè)試含氨化合物的實(shí)例中，加入不同的氨化合物(氨化合物和濃度參見(jiàn)表)。每個(gè)反應(yīng)含有作為擴(kuò)增底物的10ng人基因組DNA。以在951C進(jìn)行10分鐘(該時(shí)間較QIAGENQuantiTectSYBRGreen實(shí)驗(yàn)規(guī)程中所述的時(shí)間短5分鐘)酶激活步驟來(lái)開(kāi)始PCR反應(yīng)，隨后進(jìn)行40個(gè)如下循環(huán)94。C,15秒；551C，39秒和721C，40秒。通過(guò)比較未添加氨化合物和添加了不同濃度的氨化合物的反應(yīng)，可從三個(gè)重復(fù)反應(yīng)中測(cè)定平均CT值(氨化合物和濃度參見(jiàn)圖2)。結(jié)果在使用未修飾TaqDNA聚合酶時(shí)，添加氨化合物對(duì)酶活性沒(méi)有影響(或者在較高濃度時(shí)起抑制作用)，但是在使用經(jīng)化學(xué)修飾的酶如HotStarTaqDNA聚合酶時(shí)，含有氨化合物的反應(yīng)表現(xiàn)出明顯較高的酶活性。實(shí)施例4在不存在氯化銨(對(duì)照反應(yīng)，0mM氯化銨)以及存在濃度遞增的氯化銨(最終反應(yīng)混合物中的濃度為10、20和30mM)的情況下，進(jìn)行了含有經(jīng)化學(xué)修飾的HotStarTaqDNA聚合酶的、循環(huán)時(shí)間顯著縮短的快速PCR反應(yīng)。每個(gè)PCR反應(yīng)含有1.5單位HotStarTaqDNA聚合酶、10ng模板人或小鼠基因組DNA、每種dNTP各200一、每個(gè)不同PCR分析的各個(gè)引物各0.5(分析A,引物Al:5，-GCTTGAGCAACCTGGCTAAGATAGAGG-3,(SEQIDNO:7),引物A2:5，-GAGTTAGCAGGAGGCTGGATGCAGATG-3，(SEQIDNO:8);分析B,引物Bl:5'-CCACAATGGACATCACACAAGTGAG-3，(SEQIDNO:9)、引物B2:5，一GATCTTTCTGCCCAGATACCATTCG-3，(SEQIDNO:10);分析C,引物CI:5，-CCTTGCCTTAGATGTGTCGGCA-3，(SEQIDNO:11)、引物C2:5，-CCCAAACCCAACCCATACACAC-3，(SEQIDNO:12))以及PCR級(jí)水。以在95。C進(jìn)行5分鐘酶激活步驟來(lái)開(kāi)始PCR反應(yīng)，隨后進(jìn)行35個(gè)如下循環(huán)96°C,5秒；60C5秒和681C，30秒/kbPCR產(chǎn)物大小。在1%TAE瓊脂糖凝膠上分析PCR產(chǎn)物。M:DNA分子大小標(biāo)記(ladder)(圖3)。結(jié)果與不含任何氨化合物的反應(yīng)相比較，加入含量逐漸增加的氯化銨會(huì)引起經(jīng)化學(xué)失活的酶的總體酶活性增加。實(shí)施例5為了證明氨化合物和氮雜五元環(huán)的組合物的協(xié)同累積效應(yīng)，在存在20mM氯化銨、不存在三唑(對(duì)照反應(yīng)0)和存在濃度遞增的三唑(最終反應(yīng)混合物濃度為100、200、300、400和500mM)的情況下，進(jìn)4亍了含有經(jīng)化學(xué)修飾的HotStarTaqDNA聚合酶、循環(huán)時(shí)間顯著縮短的快速PCR反應(yīng)。將實(shí)施例4所示的體系C選作模型體系。每個(gè)PCR反應(yīng)含有1.5單位HotStarTaqDNA聚合酶、10ng模板人基因組DNA、每種dNTP各200^M、每種引物各0.5jiM,引物A:5，-CCTTGCCTTAGATGTGTCGGCA-3，(SEQIDNO:11)、引物B:5，-CCCAAACCCAACCCATACACAC-3，(SEQIDNO:12)和PCR級(jí)水。以在95C進(jìn)行5分鐘酶激活步驟達(dá)來(lái)開(kāi)始PCR反應(yīng)，隨后進(jìn)行35個(gè)如下循環(huán)96°C,5秒；60'C，5秒和68。C，45秒。在1%TAE瓊脂糖凝膠上對(duì)來(lái)自?xún)蓚€(gè)重復(fù)反應(yīng)的PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析。M:DNA分子大小標(biāo)記。由于在PCR設(shè)置期間的操作錯(cuò)誤，在200mM三唑存在下指示分析的反應(yīng)未給出結(jié)果(圖4)。結(jié)果與僅含20mM氯化銨、不含三唑的反應(yīng)相比較，三唑的加入表現(xiàn)出對(duì)經(jīng)化學(xué)修飾酶的酶活性具有明顯益處。盡管在500mM的極高濃度時(shí)，三唑的作用開(kāi)始變得不太顯著，但是該活性依然高于未加入三唑的反應(yīng)中的酶活性。該實(shí)施例表明氨化合物和氮雜五元環(huán)的組合物可協(xié)同增強(qiáng)經(jīng)化學(xué)修飾酶的酶活性。其它經(jīng)測(cè)試但為表現(xiàn)出改進(jìn)的化合物為C6H17NA(檸檬酸銨)、H9N204P(磷酸氬二銨)、C7H9N02(苯甲酸銨)、(NH4)2C03(碳酸銨)、(NH4)2S04(硫酸銨)。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是，只要不背離本發(fā)明的范圍和精神，可對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種修改和變動(dòng)。通過(guò)考慮本文所一&開(kāi)發(fā)明的說(shuō)明書(shū)和實(shí)施本文公開(kāi)的發(fā)明，本發(fā)明的其他實(shí)施方案對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的。本說(shuō)明書(shū)和實(shí)施例應(yīng)僅看作示例性的，本發(fā)明真正的范圍和精神在所附的權(quán)利要求書(shū)中說(shuō)明。序列表<110>Q工AGENGmbHDIRKL加FERTRALFPEISTPATRICKBAUMHOF<120>熱穩(wěn)定可逆失活酶類(lèi)再激活的增強(qiáng)<130>17140.0010CN1<140>Unassigned<141>2007_05_22<150>60/817,043<151>2006-06-28<150>60/852,804<151〉2006_10_19<160>12<170>FastSEQforWindowsVersion4.0<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序歹!j<220><223>人工序列的描述；注=合成構(gòu)建體<400〉1gtcaccttcaccgttccagt20<210〉2<211>20<212>DNA<213〉人工序歹U<220><223>人工序列的描述；注=合成構(gòu)建體<400>2ctcttccsgccttccttcct20<210〉3<211>22<212>DNA<213>人工序歹U<220><223>人T.序列的描述；注=合成構(gòu)建體<400>3C3C3C3gcg3tggcsgct3tgc22<210><211><212><213><220>419DNA人工序列人工序列的描述；注=合成構(gòu)建體<400>4cccagtgatgggccagctc19<210><212><213><220><223>520DNA人工序列人工序列的描述；注=合成構(gòu)建體<400>5gtcaccttcaccgttccagt20<210><211><212〉<213>620DNA人工序列人工序列的描述；注=合成構(gòu)建體<400〉6ctcttccsgccttccttcct20<210>7<211>27<212>DNA<213>人工序列<223>人工序列的描述；注=合成構(gòu)建體<400>7gcttgsgcsscctggctssgatsgsgg27<210>8<211>27<212>DNA<213>人工序歹U<220><223>人工序列的描述；注=合成構(gòu)建體<400>8gagttagcaggaggctggatgcagatg27<210>9<211>25<212>DNA<213>人工序歹U<220><223>人工序列的描述；注=合成構(gòu)建體<400>9ccacaatggacatcacacaagtgag<210><211><212><213><220><223>1025DNA人工序列人工序列的描述；注=合成構(gòu)建體<400>10gatctttctgcccagataccattcg<210><211><212><213><220><223>1122DNA人工序列人工序列的描述；注=合成構(gòu)建體<400>11ccttgccttagatgtgtcggca<210><212><213><220><223>1222DNA人工序列人T序列的描述；注=合成構(gòu)建體<400>12CCC333CCC33CCC3t3C3C3C2525222權(quán)利要求1.一種使熱穩(wěn)定可逆失活酶的再激活增強(qiáng)的方法，包括在氮雜五元環(huán)的存在下再激活至少一種熱穩(wěn)定可逆失活酶。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述氮雜五元環(huán)包括具有式1的含氮五元環(huán)化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>其中每個(gè)X各自獨(dú)立地為CH、CR或N;并且R為H，取代的或未取代的烷基、鏈烯基、炔基、烷M^l芳基，羥基，氨基，硝基，羧酸，酯,磺酸，醚或卣素基團(tuán)。3.權(quán)利要求1的方法，其中所述氮雜五元環(huán)包括具有式2的含氮五元環(huán)化合物，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>其中每個(gè)X各自獨(dú)立地為CH、CR、N、0或S;并且每個(gè)R各自獨(dú)立地為H,:^代的或未^c代的絲、,基、姊、烷IU^l芳基，鞋基，絲，硝基，羧酸，酯，磺酸，醚或囟素基團(tuán)。4.權(quán)利要求3的方法，其中每個(gè)X各自獨(dú)立地為任意組合的CH或N。5.權(quán)利要求1的方法，其中所述氮雜五元環(huán)包括具有式3的含氮二環(huán)化合物，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>其中每個(gè)X各自獨(dú)立地為CH、CR、N、0或S;并且每個(gè)R各自獨(dú)立地合物6.7.8.9.10.11.12.13.為H,取代的或未取代的烷基、^#基、炔基、烷M^芳基，羥基，絲，硝基，羧酸，酯，磺酸，醚或面素基團(tuán)。權(quán)利要求1的方法，其中絲銨鹽的存在下進(jìn)行再激活。權(quán)利要求1的方法，其中所述氮雜五元環(huán)的濃度約2inM至約1M。權(quán)利要求1的方法，其中所述氮雜五元環(huán)的濃度為0.5慮至約0.5M。一種增強(qiáng)熱穩(wěn)定可逆失活酶再激活的方法，包括在具有式4的吡咬4^物的存在下再激活至少一種熱穩(wěn)定可逆失活酶，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>其中每個(gè)X各自獨(dú)立地為CH、CR或N;并且R為羥基、氨基、Sii^絲錄基團(tuán)。權(quán)利要求9的方法，其中i^E銨鹽的存在下進(jìn)行再激活。權(quán)利要求9的方法，其中所述p比咬化合物的濃度為約2mM至約lM。權(quán)利要求9的方法，其中所述他咬化^的濃度為約0.5mM至約0.5M。一種增強(qiáng)熱穩(wěn)定可逆失活酶再激活的方法，包括在包括具有式5的N-氫氧化物的化合物的存在下再激活至少一種熱穩(wěn)定可逆失活酶，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>式5其中每個(gè)R各自獨(dú)立地為H，^L代的或未:lL代的;^、,基、g、烷l^芳基，或iti^其衍生物。14.權(quán)利要求13的方法，其中絲銨鹽的存在下進(jìn)行再激活。15.權(quán)利要求13的方法，其中所述N-氫氧化物化合物的濃度為約2mM至約1M。16.權(quán)利要求13的方法，其中所述N-氫氧化物化^的濃度為約0.5mM至約0.5M。17.—種增強(qiáng)熱穩(wěn)定可逆失活酶再激活的方法，包括在包括具有式6的肼的化合物的存在下再激活至少一種熱穩(wěn)定可逆失活酶，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>式6其中每個(gè)R各自獨(dú)立地為H,取代的或未取代的烷基、鏈烯基、炔基、烷|1芳基，或ittil^^f生物。18.權(quán)利要求17的方法，其中M銨鹽的存在下進(jìn)行再激活。19.權(quán)利要求17的方法，其中所i^JM匕合物的濃度為約2mM至約lM。20.權(quán)利要求17的方法，其中所^4^物的濃度為約0.5慮至約0.5M。21.—種增強(qiáng)熱穩(wěn)定可逆失活酶再激活的方法，包括在包括銨鹽的化^的存在下再激活至少一種熱穩(wěn)定可逆失活酶。22.權(quán)利要求21的方法，其中所述銨鹽包括無(wú)機(jī)反荷離子、有機(jī)Jl荷離子、金屬氧化物反荷離子或4，屬?gòu)?fù)^^^荷離子。23.權(quán)利要求21的方法，其中所述銨鹽的濃度為約2mM至約lM。24.權(quán)利要求21的方法，其中所述銨鹽的濃度為約0.5mM至約0.5M。25.—種試劑盒，含有至少一種熱穩(wěn)定可逆失活酶和至少一種選自下列的化合物具有式l、式2或式3的氮雜五元環(huán)、具有式4的吡啶、具有式5的N-氫氧/f匕物或具有式6的肼，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>其中每個(gè)X各自獨(dú)立地為CH、CR、N、0或S;并且每個(gè)R各自獨(dú)立地為H，^代的或未^^代的絲、^)^基、錄、烷M^芳基，羥基，絲，硝基，羧酸，酯，磺酸，醚或囟素基團(tuán)。全文摘要公開(kāi)了增強(qiáng)熱穩(wěn)定可逆失活酶再激活的方法，包括在一種或多種含氮化合物的存在下再激活至少一種熱穩(wěn)定可逆失活酶。文檔編號(hào)C12N9/96GK101100662SQ200710123109公開(kāi)日2008年1月9日申請(qǐng)日期2007年6月28日優(yōu)先權(quán)日2006年6月28日發(fā)明者D·羅福特,P·鮑姆霍夫,R·派斯特申請(qǐng)人:奇亞根有限公司