本發(fā)明屬于小麥基因檢測(cè)，具體涉及一種與小麥抗條銹病基因yr85連鎖的kasp分子標(biāo)記及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、小麥?zhǔn)俏覈?guó)重要的糧食作物，其生產(chǎn)與國(guó)家糧食安全密切相關(guān)。小麥條銹病是由條形柄銹菌小麥?；?puccinia?striiformis?f.sp.tritici,pst)導(dǎo)致的重要?dú)鈧魅~部病害之一，常常導(dǎo)致的小麥產(chǎn)量損失能夠達(dá)到5～25％，而在條銹病重發(fā)年份還可能導(dǎo)致其100％絕收。而目前，小麥條銹病的防治主要有兩種方法：化學(xué)防治和種植抗病品種。但是化學(xué)防治往往給環(huán)境造成嚴(yán)重污染，而種植抗病品種是最為有效、經(jīng)濟(jì)、環(huán)保的策略。

2、目前，已有86個(gè)抗條銹病基因和超過(guò)380個(gè)qtl被定位和報(bào)道，但其多數(shù)處于初定位階段，存在定位區(qū)間不夠精確，連鎖累贅等問(wèn)題，在生產(chǎn)上成功應(yīng)用的并不多。另外，條銹菌還存在毒性變異現(xiàn)象，這會(huì)導(dǎo)致新的生理小種的出現(xiàn)，而這往往造成抗病品種抗銹性的喪失。例如伴隨cyr32、cyr33和cyr34等強(qiáng)致病小種的出現(xiàn)，使得我國(guó)廣泛使用的抗病基因yr9、yr26和yrzh84等相繼喪失抗病性。因此，迫切需要發(fā)掘和利用新的抗病基因資源以及相應(yīng)基因的分子標(biāo)記，進(jìn)一步加快小麥抗病分子輔助育種的進(jìn)程。

3、而小麥抗條銹病基因yr85是一個(gè)asr基因，最早在美國(guó)冬小麥品種tres中被發(fā)現(xiàn)，對(duì)我國(guó)主要流行的條銹菌生理小種，如cyr32、cyr33和cyr34等具有廣譜抗性，在田間自然發(fā)病條件下一直保持高度抗病，在我國(guó)小麥抗病育種中具有大的應(yīng)用潛力。截止目前對(duì)于yr85的研究還較少，限制了該基因在育種中的應(yīng)用。因此，開(kāi)發(fā)一種與小麥抗條銹病基因yr85共分離kasp分子標(biāo)記，對(duì)于促進(jìn)yr85基因在分子育種中的應(yīng)用進(jìn)程具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，提供了一種與小麥抗條銹病基因yr85連鎖的kasp分子標(biāo)記及其應(yīng)用，其kasp分子標(biāo)記與抗條銹病基因yr85緊密連鎖，能夠準(zhǔn)確鑒別出抗小麥條銹病植株，對(duì)于小麥種質(zhì)資源抗條銹病基因yr85的篩查、小麥抗條銹病材料創(chuàng)制或小麥抗條銹病的分子輔助育種具有重要意義。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案如下：

3、一種與小麥抗條銹病基因yr85連鎖的kasp分子標(biāo)記，所述kasp分子標(biāo)記包含xk1b-63和/或xk1b-65；所述xk1b-63的核苷酸序列如seq?id?no.1所示，xk1b-63的多態(tài)性為c/g；所述xk1b-65的核苷酸序列如seq?id?no.2所示，xk1b-65的多態(tài)性為a/g。

4、作為進(jìn)一步的技術(shù)方案，所述kasp分子標(biāo)記與小麥抗條銹病基因yr85共定位于小麥1bs染色體上。

5、一種擴(kuò)增所述kasp分子標(biāo)記的引物組，包括xk1b-63擴(kuò)增引物組和xk1b-65擴(kuò)增引物組；其中，xk1b-63擴(kuò)增引物組包括：核苷酸序列如seq?id?no.3所示的抗病位點(diǎn)正向引物xk1b-63-hex；核苷酸序列如seq?id?no.4所示的感病位點(diǎn)正向引物xk1b-63-fam；核苷酸序列如seq?id?no.5所示的共用反向引物xk1b-63-common；

6、xk1b-65擴(kuò)增引物組包括：核苷酸序列如seq?id?no.6所示的感病位點(diǎn)正向引物xk1b-65-fam；核苷酸序列如seq?id?no.7所示的抗病位點(diǎn)正向引物xk1b-65-hex；核苷酸序列如seq?id?no.8所示的共用反向引物xk1b-65-common。

7、一種檢測(cè)所述的kasp分子標(biāo)記的試劑盒，包含所述kasp分子標(biāo)記的引物組。

8、一種檢測(cè)小麥?zhǔn)欠窈锌箺l銹病基因yr85的方法，包括以下步驟：

9、以待測(cè)小麥材料基因組dna為模板，利用所述kasp分子標(biāo)記的引物組進(jìn)行擴(kuò)增，并將擴(kuò)增產(chǎn)物移至酶標(biāo)儀中讀取熒光數(shù)據(jù)，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光數(shù)據(jù)判斷待測(cè)小麥?zhǔn)欠窈箺l銹病基因yr85。

10、作為進(jìn)一步的技術(shù)方案，利用所述kasp分子標(biāo)記的引物組進(jìn)行擴(kuò)增，所采用的分子反應(yīng)體系為：待測(cè)小麥材料dna為0.2μg，2×kaspv4.0?master?mix?2μl，引物混合液0.0448μl，ddh2o?1.9552μl；

11、作為進(jìn)一步的技術(shù)方案，利用所述kasp分子標(biāo)記的引物組進(jìn)行擴(kuò)增，所采用的反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性15min；94℃變性20s，65℃退火60s，10個(gè)循環(huán)，每循環(huán)退火溫度降低0.6℃；94℃變性20s，55℃退火60s，32個(gè)循環(huán)。

12、作為進(jìn)一步的技術(shù)方案，所述引物混合液中，正向引物與反向引物的濃度均為12μm，共用反向引物的濃度為30μm。

13、作為進(jìn)一步的技術(shù)方案，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光數(shù)據(jù)判斷待測(cè)小麥?zhǔn)欠窈箺l銹病基因yr85，包括：

14、將所述熒光數(shù)據(jù)導(dǎo)入klustercaller軟件進(jìn)行分析，獲得基因型，根據(jù)基因型判斷待測(cè)小麥材料是否含有抗條銹病基因yr85；

15、當(dāng)xk1b-63的基因型和/或xk1b-65的基因型為帶有hex熒光的純合等位基因基因型或雜合體基因型時(shí)，說(shuō)明待測(cè)小麥材料含抗條銹病基因yr85；當(dāng)xk1b-63基因型和/或xk1b-65的基因型為帶有fam熒光的純合等位基因基因型時(shí)，則待測(cè)小麥材料不含有抗條銹病基因yr85。

16、作為進(jìn)一步的技術(shù)方案，帶有hex熒光的純合等位基因基因型為“y:y”，帶有fam熒光的純合等位基因基因型為“x:x”，雜合體基因型為“x:y”或者“y:x”；

17、xk1b-63中，基因型為“y:y”或“x:y”或“y:x”，則待測(cè)小麥材料含有抗條銹病基因yr85；基因型為“x:x”，則待測(cè)小麥材料不含有抗條銹病基因yr85；

18、xk1b-65中，基因型為“y:y”或“x:y”或“y:x”，則待測(cè)小麥材料含有抗條銹病基因yr85，基因型為“x:x”，則待測(cè)小麥材料不含有抗條銹病基因yr85。

19、所述kasp分子標(biāo)記或所述的試劑盒在鑒定小麥材料中是否含有抗條銹病基因yr85、小麥抗條銹病基因yr85的種質(zhì)資源篩查、小麥抗條銹病材料篩選，小麥抗條銹病材料創(chuàng)制或小麥抗條銹病分子輔助育種中的應(yīng)用。

20、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于：

21、本發(fā)明通過(guò)研究獲得了與小麥抗條銹病基因yr85緊密連鎖的snp位點(diǎn)，基于該snp位點(diǎn)，開(kāi)發(fā)出與yr85緊密連鎖的kasp標(biāo)記，其具有共分離特征，其檢測(cè)過(guò)程簡(jiǎn)便、快速、通量高，能夠準(zhǔn)確鑒別出含有yr85基因的小麥抗條銹病植株，對(duì)于小麥種質(zhì)資源抗條銹病基因篩查、小麥抗條銹病材料創(chuàng)制或小麥抗條銹病分子輔助育種具有重要意義。

技術(shù)特征：

1.一種與小麥抗條銹病基因yr85連鎖的kasp分子標(biāo)記，其特征在于，所述kasp分子標(biāo)記包含xk1b-63和/或xk1b-65；所述xk1b-63的核苷酸序列如seq?id?no.1所示，xk1b-63的多態(tài)性為c/g；所述xk1b-65的核苷酸序列如seq?id?no.2所示，xk1b-65的多態(tài)性為a/g。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種與小麥抗條銹病基因yr85連鎖的kasp分子標(biāo)記，其特征在于，所述kasp分子標(biāo)記與小麥抗條銹病基因yr85共定位于小麥1bs染色體上。

3.一種擴(kuò)增如權(quán)利要求1或2所述kasp分子標(biāo)記的引物組，其特征在于，包括xk1b-63擴(kuò)增引物組和xk1b-65擴(kuò)增引物組；其中，

4.一種檢測(cè)如權(quán)利要求1所述的kasp分子標(biāo)記的試劑盒，其特征在于，包含權(quán)利要求3所述kasp分子標(biāo)記的引物組。

5.一種檢測(cè)小麥?zhǔn)欠窈锌箺l銹病基因yr85的方法，其特征在于，包括以下步驟：

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種檢測(cè)小麥?zhǔn)欠窈锌箺l銹病基因yr85的方法，其特征在于，利用權(quán)利要求3所述kasp分子標(biāo)記的引物組進(jìn)行擴(kuò)增，所采用的分子反應(yīng)體系為：待測(cè)小麥材料dna為0.2μg，2×kaspv4.0?master?mix?2μl，引物混合液0.0448μl，ddh2o?1.9552μl；

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種檢測(cè)小麥?zhǔn)欠窈锌箺l銹病基因yr85的方法，其特征在于，所述引物混合液中，正向引物與反向引物的濃度均為12μm，共用反向引物的濃度為30cm。

8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種檢測(cè)小麥?zhǔn)欠窈锌箺l銹病基因yr85的方法，其特征在于，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光數(shù)據(jù)判斷待測(cè)小麥?zhǔn)欠窈箺l銹病基因yr85，包括：

9.如權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述kasp分子標(biāo)記或如權(quán)利要求4所述的試劑盒在鑒定小麥材料中是否含有抗條銹病基因yr85、小麥抗條銹病基因yr85的種質(zhì)資源篩查、小麥抗條銹病材料篩選，小麥抗條銹病材料創(chuàng)制或小麥抗條銹病分子輔助育種中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及一種與小麥抗條銹病基因Yr85連鎖的KASP分子標(biāo)記及其應(yīng)用，所述KASP分子標(biāo)記包含XK1B?63和/或XK1B?65；所述KASP分子標(biāo)記與小麥抗條銹病基因Yr85共定位于小麥1BS染色體上，所述XK1B?63的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，XK1B?63的多態(tài)性為C/G；所述XK1B?65的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示，XK1B?65的多態(tài)性為A/G。本發(fā)明KASP分子標(biāo)記與抗條銹病基因Yr85緊密連鎖，能夠準(zhǔn)確鑒別抗小麥條銹病植株，對(duì)小麥種質(zhì)資源抗條銹病基因篩查、小麥抗條銹病材料創(chuàng)制或分子輔助育種具有重要意義。

技術(shù)研發(fā)人員：劉勝杰,程相瑞,李槐舟,張一博,曾慶東,吳建輝,韓德俊,李春蓮,鄭煒君,康振生
受保護(hù)的技術(shù)使用者：西北農(nóng)林科技大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/6