本發(fā)明屬于合成生物學(xué)，涉及一種引入外源咖啡酸合成通路以提高植物發(fā)光強(qiáng)度的方法。

背景技術(shù)：

1、以咖啡酸為底物催化生成熒光素過(guò)程如下：

2、步驟1：咖啡酸與丙酰輔酶a反應(yīng)生成牛奶樹(shù)堿

3、催化酶：牛奶樹(shù)堿合酶(hispidin?synthase,hisps)

4、反應(yīng)描述：咖啡酸在牛奶樹(shù)堿合酶的催化下，與丙酰輔酶a結(jié)合生成牛奶樹(shù)堿(hispidin)

5、咖啡酸+2丙酰輔酶a+2atp→牛奶樹(shù)堿+2co2+h2o+2amp

6、步驟2：牛奶樹(shù)堿羥化生成3-羥基牛奶樹(shù)堿

7、催化酶：牛奶樹(shù)堿羥化酶(hispidin?hydroxylase,h3h)

8、反應(yīng)描述：牛奶樹(shù)堿在牛奶樹(shù)堿羥化酶的作用下發(fā)生羥化反應(yīng)，生成3-羥基牛奶樹(shù)堿

9、牛奶樹(shù)堿+o2+nadph+h+→3-羥基牛奶樹(shù)堿+h2o+nadp+

10、步驟3：3-羥基牛奶樹(shù)堿氧化生成咖啡酰丙酮酸

11、催化酶：熒光素酶(luciferase,luz)

12、反應(yīng)描述：3-羥基牛奶樹(shù)堿在熒光素酶的催化下，被氧化生成熒光素(luciferin)，并伴隨發(fā)光。

13、

14、通過(guò)這三步反應(yīng)，咖啡酸和丙酮酸通過(guò)酶促反應(yīng)轉(zhuǎn)化為咖啡酰丙酮酸，實(shí)現(xiàn)生物發(fā)光。

15、步驟4：3-羥基牛奶樹(shù)堿氧化生成咖啡酰丙酮酸

16、催化酶：咖啡酰丙酮酸水解酶(caffeoyl?pyruvate?hydrolase,cph)

17、反應(yīng)描述：咖啡酰丙酮酸在咖啡酰丙酮酸水解酶的催化下，生成咖啡酸酸，從而實(shí)現(xiàn)咖啡酸的再生，實(shí)現(xiàn)循環(huán)發(fā)光的目的。

18、咖啡酰丙酮酸+h2o→咖啡酸+丙酮酸。

19、這一過(guò)程在真菌和轉(zhuǎn)基因植物中得到了應(yīng)用。咖啡酸是催化生成熒光素的重要底物，咖啡酸的供應(yīng)充足與否直接關(guān)系到發(fā)光植物的發(fā)光強(qiáng)度，在植物內(nèi)源咖啡酸供應(yīng)不足的情況下，發(fā)光強(qiáng)度大打折扣。

20、咖啡酸的生物合成途徑可分為兩個(gè)模塊(如圖1所示)：

21、(1)l-酪氨酸由碳源通過(guò)糖酵解途徑、磷酸戊糖途徑和莽草酸酯途徑合成(圖1中a)；

22、(2)咖啡酸是由l-酪氨酸的連續(xù)脫氨和羥基化生成的(圖1中b)。

23、由于植物中的內(nèi)源咖啡酸含量很低，而咖啡酸是植物發(fā)光的底物，因此發(fā)光強(qiáng)度受植物內(nèi)源咖啡酸的影響，發(fā)光強(qiáng)度一般。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種引入外源咖啡酸合成通路以提高植物發(fā)光強(qiáng)度的方法。

2、為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

3、一種引入外源咖啡酸合成通路以提高植物發(fā)光強(qiáng)度的方法，將tal基因(來(lái)自約氏黃桿菌，flavobacterium?johnsoniae)和p450基因(來(lái)自甜菜，beta?vulgaris)引入植物體內(nèi)，tal基因的核苷酸序列如seq?id?no.1所示，p450基因的核苷酸序列如seq?id?no.2所示。

4、作為優(yōu)選的技術(shù)方案之一，所述植物為本氏煙草(nicotiana?benthamiana)。

5、作為優(yōu)選的技術(shù)方案之一，具體步驟如下：

6、(1)基因克隆和載體構(gòu)建：將luz基因、h3h基因、cph基因、hisps基因、tal基因、p450基因連接在pcambia2300載體上；

7、(2)轉(zhuǎn)化和篩選；

8、(3)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化；

9、(4)植物轉(zhuǎn)化。

10、作為進(jìn)一步優(yōu)選的技術(shù)方案之一，步驟(1)的具體方法為：

11、(1-1)設(shè)計(jì)引物，使用高保真聚合酶對(duì)基因進(jìn)行pcr擴(kuò)增；

12、(1-2)雙酶切，連接反應(yīng)，載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌。

13、作為更進(jìn)一步優(yōu)選的技術(shù)方案之一，步驟(1-1)中，所述引物如下：

14、public-f：acagctatgaccatgattacgaattc，如seq?id?no.3所示；

15、public-r：agtcacgacgttgtaaaacgacgg，如seq?id?no.4所示。

16、作為更進(jìn)一步優(yōu)選的技術(shù)方案之一，步驟(1-1)中，pcr擴(kuò)增體系和反應(yīng)條件見(jiàn)表1。

17、表1.基因克隆反應(yīng)體系

18、

19、pcr反應(yīng)結(jié)束后，將dna進(jìn)行切膠回收，回收方法按照諾唯贊膠回收試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，回收后的產(chǎn)物送至北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行sanger測(cè)序，確定基因序列。引物序列和檢測(cè)序列見(jiàn)表2。

20、表2.引物序列和檢測(cè)序列

21、

22、作為更進(jìn)一步優(yōu)選的技術(shù)方案之一，步驟(1-2)中，利用限制性?xún)?nèi)切酶ecori和hindiii的進(jìn)行雙酶切處理。

23、作為更進(jìn)一步優(yōu)選的技術(shù)方案之一，步驟(1-2)中，使用無(wú)縫克隆試劑盒將擴(kuò)增的基因與酶切的載體連接，每個(gè)基因都帶有35s啟動(dòng)子和camv?poly(a)終止子。

24、作為更進(jìn)一步優(yōu)選的技術(shù)方案之一，步驟(1-2)中，將連接產(chǎn)物用熱激法轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌dh5α中，并在含有50mg/l?kan的lb平板上篩選陽(yáng)性克隆。

25、作為進(jìn)一步優(yōu)選的技術(shù)方案之一，步驟(2)的具體方法為：

26、(2-1)大腸桿菌培養(yǎng)：挑選陽(yáng)性克隆，用10ml含50mg/l?kan的lb進(jìn)行液體培養(yǎng)；

27、(2-2)質(zhì)粒提?。菏褂觅|(zhì)粒小提套件提取重組質(zhì)粒；

28、(2-3)質(zhì)粒保存：將質(zhì)粒凍存在冰箱中，-20℃保存，備用。

29、作為進(jìn)一步優(yōu)選的技術(shù)方案之一，步驟(3)的具體方法為：

30、(3-1)將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌gv3101農(nóng)桿菌感受態(tài)中；

31、(3-2)篩選轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌：在含有抗生素(50mg/l?kan，25mg/l?rif，50mg/lgen)的yep平板上篩選轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌。

32、作為進(jìn)一步優(yōu)選的技術(shù)方案之一，步驟(4)的具體方法為：

33、(4-1)植物材料準(zhǔn)備：選擇適合轉(zhuǎn)化的煙草葉片，將葉片切為0.5cm*0.5cm大?。?/p>

34、(4-2)葉盤(pán)法轉(zhuǎn)化：使用農(nóng)桿菌懸濁液28℃浸泡植物葉盤(pán)，充分浸泡30min后轉(zhuǎn)移到共培養(yǎng)培養(yǎng)基；

35、(4-3)共培養(yǎng)和篩選：在共培養(yǎng)培養(yǎng)基上28℃暗培養(yǎng)2天，然后轉(zhuǎn)移到含有選擇性抗生素的選擇培養(yǎng)基；

36、(4-4)再生和根化：大約2-3周后，篩選出抗性芽，并在生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根；

37、(4-5)煙草的移栽與生長(zhǎng)：將生根后的煙草移栽到土壤中，進(jìn)行溫室管理，光照6000lx、16h/天；

38、(4-6)轉(zhuǎn)基因鑒定：將移栽后的煙草進(jìn)行取樣，并用ctab法進(jìn)行dna提取，以及pcr陽(yáng)性鑒定。

39、作為更進(jìn)一步優(yōu)選的技術(shù)方案之一，步驟(4-6)中，pcr陽(yáng)性鑒定的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件見(jiàn)表3。

40、表3.轉(zhuǎn)基因鑒定

41、

42、本發(fā)明的有益效果在于：

43、由于植物中的內(nèi)源咖啡酸含量很低，而咖啡酸是植物發(fā)光的底物，因此發(fā)光強(qiáng)度受植物內(nèi)源咖啡酸的影響。引入外源咖啡酸合成路徑，能夠增強(qiáng)咖啡酸的合成，從而增加發(fā)光底物濃度，從而增強(qiáng)植物發(fā)光強(qiáng)度。

44、為了提高植物內(nèi)咖啡酸表達(dá)量以達(dá)到更好的發(fā)光效果，本發(fā)明在植物自身合成的咖啡酸以外，引入了額外的咖啡酸合成通路，提高熒光素合成過(guò)程中至關(guān)重要的咖啡酸的含量，從而提高發(fā)光強(qiáng)度。

45、具體地，本發(fā)明引入tal基因和p450基因，申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)，與單獨(dú)引入tal基因或p450基因相比，同時(shí)將tal基因和p450基因引入到植物體內(nèi)獲得了顯著的咖啡酸表達(dá)量上調(diào)的效果。這可能是因?yàn)?，tal基因和p450基因的引入促進(jìn)了l-dopa的脫氨，提高了l-dopa的積累量，進(jìn)而有效提高植物內(nèi)咖啡酸表達(dá)量?；诖送罚沟弥参飪?nèi)熒光素的合成增加，以增強(qiáng)植物發(fā)光強(qiáng)度。