本發(fā)明屬于生物，具體地，本發(fā)明涉及一種基于era技術(shù)的kpc基因的檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

1、細(xì)菌耐藥已經(jīng)成為全球公共衛(wèi)生領(lǐng)域的重大挑戰(zhàn)，在臨床面臨的諸多耐藥菌種，最重要的是近年迅速增加的碳青霉烯耐藥腸桿菌科細(xì)菌(cre)。cre感染多發(fā)生于有嚴(yán)重基礎(chǔ)疾病、免疫缺陷和(或)長(zhǎng)期反復(fù)使用廣譜抗菌藥物的患者，預(yù)后差，尤其是cre血流感染患者，其病死率高達(dá)50％以上。2019年美國(guó)疾病預(yù)防控制中心將cre列為耐藥菌威脅人類健康的“緊急威脅”級(jí)病原菌。

2、腸桿菌科細(xì)菌對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥的最主要原因之一為產(chǎn)碳青霉烯酶。碳青霉烯酶分為a、b、d三類，kpc屬于a類酶(絲氨酸碳青霉烯酶)，是全球腸桿菌科細(xì)菌尤其肺炎克雷伯菌中流行最廣泛的碳青霉烯酶。研究發(fā)現(xiàn)，blakpc基因常位于接合質(zhì)粒上，該質(zhì)?？山雍限D(zhuǎn)移至其他細(xì)菌，形成多重耐藥菌，使耐藥性廣泛傳播。因此，面對(duì)產(chǎn)kpc細(xì)菌感染，建立一種快速、準(zhǔn)確、靈敏度高的檢測(cè)方法，盡早篩查和診斷出這類超級(jí)細(xì)菌，采取有效的治療方案，避免進(jìn)一步耐藥的發(fā)生，則顯得尤為重要。

3、目前檢測(cè)kpc的方法分為表型檢測(cè)和基因型檢測(cè)。表型檢測(cè)方法包括carba?np試驗(yàn)、mcim和ecim、碳青霉烯酶抑制劑增強(qiáng)試驗(yàn)和時(shí)間飛行質(zhì)譜技術(shù)等，這些方法多存在耗時(shí)長(zhǎng)及操作繁瑣等缺點(diǎn)。基因型檢測(cè)方法包括酶免疫層析技術(shù)和分子檢測(cè)技術(shù)，傳統(tǒng)的基因鑒定方法為pcr法和dna測(cè)序法，其中傳統(tǒng)的pcr法需要成本較高的熱循環(huán)儀器，操作復(fù)雜且耗時(shí)長(zhǎng)；sanger?dna測(cè)序法對(duì)引物特異性要求較高，且價(jià)格較昂貴，后期數(shù)據(jù)分析較復(fù)雜，不適合臨床推廣用。

4、因此，急需開發(fā)一種操作簡(jiǎn)便、耗時(shí)短、靈敏度高、特異性強(qiáng)且適用于常溫現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的kpc基因檢測(cè)方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種操作簡(jiǎn)便、耗時(shí)短、靈敏度高、特異性強(qiáng)且適用于常溫現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的kpc基因的檢測(cè)方法。

2、在本發(fā)明的第一方面，提供了一種非診斷且非治療性kpc基因的擴(kuò)增方法，所述擴(kuò)增方法包括步驟：在反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增，所述反應(yīng)體系含有擴(kuò)增kpc基因的特異性引物對(duì)，所述引物對(duì)包括：如seq?id?no:1所示的序列，和如seq?id?no:6所示的序列。

3、在另一優(yōu)選例中，所述方法的kpc最低檢測(cè)濃度為0.005-0.015ng/μl。

4、在另一優(yōu)選例中，所述方法的kpc最低檢測(cè)濃度為0.01ng/μl。

5、在另一優(yōu)選例中，所述反應(yīng)體系還包括一探針，所述探針包括如seq?id?no:19所示的序列。

6、在另一優(yōu)選例中，所述探針標(biāo)記有熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)。

7、在另一優(yōu)選例中，所述探針5’端標(biāo)記熒光基因fam，3’端標(biāo)記淬滅基團(tuán)bhq。

8、在另一優(yōu)選例中，所述引物對(duì)包括如seq?id?no:11所示的序列或其互補(bǔ)鏈，和如seq?id?no:17所示的序列或其互補(bǔ)鏈。

9、在另一優(yōu)選例中，所述引物對(duì)包括如seq?id?no:3所示的序列或其互補(bǔ)鏈，和如seq?id?no:6所示的序列或其互補(bǔ)鏈。

10、在另一優(yōu)選例中，所述引物對(duì)包括如seq?id?no:3所示的序列或其互補(bǔ)鏈，和如seq?id?no:8所示的序列或其互補(bǔ)鏈。

11、在另一優(yōu)選例中，所述引物對(duì)包括如seq?id?no:1所示的序列或其互補(bǔ)鏈，和如seq?id?no:9所示的序列或其互補(bǔ)鏈。

12、在另一優(yōu)選例中，所述引物對(duì)包括如seq?id?no:2所示的序列或其互補(bǔ)鏈，和如seq?id?no:6所示的序列或其互補(bǔ)鏈。

13、在另一優(yōu)選例中，所述引物對(duì)包括如seq?id?no:4所示的序列或其互補(bǔ)鏈，和如seq?id?no:6所示的序列或其互補(bǔ)鏈。

14、在另一優(yōu)選例中，所述引物對(duì)包括如seq?id?no:4所示的序列或其互補(bǔ)鏈，和如seq?id?no:9所示的序列或其互補(bǔ)鏈。

15、在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括：在另一陽(yáng)性(對(duì)照)反應(yīng)體系或陰性(對(duì)照)反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。

16、在另一優(yōu)選例中，陽(yáng)性反應(yīng)體系包含表達(dá)kpc的肺炎克雷伯菌耐藥菌的基因組dna。

17、在另一優(yōu)選例中，所述反應(yīng)體系還包括dna聚合酶、單鏈結(jié)合蛋白、核酸內(nèi)切酶iv、重組酶和輔助蛋白等擴(kuò)增元件。

18、在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括步驟：在擴(kuò)增反應(yīng)過程之中或之后，檢測(cè)特異性探針發(fā)出的熒光信號(hào)。

19、在另一優(yōu)選例中，所述方法是酶促等溫?cái)U(kuò)增法(era)。

20、在另一優(yōu)選例中，所述era的反應(yīng)試劑還包括：era反應(yīng)體系通用溶解劑、激活劑、熒光擴(kuò)增試劑、ddh2o中的一種或多種。

21、在另一優(yōu)選例中，所述era等溫?cái)U(kuò)增的反應(yīng)溫度為36℃～42℃，優(yōu)選為37℃～39℃。

22、在另一優(yōu)選例中，所述era等溫?cái)U(kuò)增的反應(yīng)時(shí)間為15-60分鐘，優(yōu)選為15-20分鐘。

23、在本發(fā)明的第二方面，提供了一種非診斷性kpc基因的檢測(cè)方法，所述方法包括步驟：

24、(a)用本發(fā)明第一方面所述的方法擴(kuò)增待測(cè)樣品；和

25、(b)進(jìn)行信號(hào)檢測(cè)。

26、在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行處理，獲得基因組dna，再通過本發(fā)明第一方面所述的方法擴(kuò)增目標(biāo)dna。

27、在另一優(yōu)選例中，所述待測(cè)樣品是人類排泄物樣品的核酸。

28、在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括設(shè)置一個(gè)或多個(gè)對(duì)照組。

29、在另一優(yōu)選例中，所述對(duì)照組包括陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組。

30、在另一優(yōu)選例中，所述陽(yáng)性對(duì)照組包括產(chǎn)kpc的肺炎克雷伯菌耐藥菌株。

31、在另一優(yōu)選例中，所述方法包括定性檢測(cè)和定量檢測(cè)。

32、在另一優(yōu)選例中，所述方法的kpc最低檢測(cè)濃度為0.005-0.015ng/μl。

33、在另一優(yōu)選例中，所述方法的最低檢測(cè)濃度約0.01ng/μl。

34、在另一優(yōu)選例中，所述方法是非診斷非治療性的。

35、在另一優(yōu)選例中，所述檢測(cè)包括熒光信號(hào)檢測(cè)。

36、在另一優(yōu)選例中，所述熒光檢測(cè)包括使用熒光定量pcr儀或使用手持式熒光檢測(cè)儀進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)。

37、在本發(fā)明的第三方面，提供了一種快速檢測(cè)kpc基因的檢測(cè)試劑盒，所述檢測(cè)試劑盒包括：

38、一容器，及容器內(nèi)的針對(duì)kpc基因的特異性引物對(duì)和探針，所述特異性引物對(duì)包括如seq?id?no:1所示的序列，和如seq?id?no:6所示的序列；所述探針包括如seq?id?no:19所示的序列。

39、在另一優(yōu)選例中，所述檢測(cè)試劑盒還包括dna聚合酶、單鏈結(jié)合蛋白、核酸內(nèi)切酶iv、重組酶和輔助蛋白等元件。

40、在另一優(yōu)選例中，所述檢測(cè)試劑盒還包括樣本處理試劑，所述樣本處理試劑包括細(xì)胞裂解液、核酸提取液、洗滌液等。

41、在另一優(yōu)選例中，所述檢測(cè)試劑盒還包括era反應(yīng)試劑，所述era反應(yīng)試劑包括通用溶解劑、激活劑、熒光擴(kuò)增試劑、ddh2o中的一種或多種。

42、在另一優(yōu)選例中，所述檢測(cè)試劑盒還包括kpc陽(yáng)性對(duì)照和kpc陰性對(duì)照。

43、在另一優(yōu)選例中，所述檢測(cè)試劑盒還包括一說明書，所述說明書用于指導(dǎo)檢測(cè)kpc基因。

44、在本發(fā)明的第四方面，提供了一種如第三方面所述的檢測(cè)試劑盒的用途，用于非診斷且非治療性地檢測(cè)待測(cè)樣品中是否含有kpc型碳青霉烯酶耐藥菌。

45、在另一優(yōu)選例中，所述待測(cè)樣品是人類排泄物樣品的核酸。

46、在另一優(yōu)選例中，所述試劑盒用于鑒別待測(cè)樣本中是否含有kpc型碳青霉烯酶耐藥菌。通過檢測(cè)待測(cè)樣品的kpc基因含量c0和陰性對(duì)照樣品中的kpc基因含量c1，若c0＞c1或c0/c1>1.5，較佳地>2，更佳地>3，則提示待測(cè)樣品中可能含有kpc型碳青霉烯酶耐藥菌。

47、在另一優(yōu)選例中，所述試劑盒還用于評(píng)價(jià)針對(duì)kpc型碳青霉烯酶耐藥菌的藥物的抑菌效果。檢測(cè)使用kpc型碳青霉烯酶耐藥菌的藥物治療之后，樣本中的kpc基因含量z0，以及未使用上述藥物的樣品中的kpc基因含量z1；若z0/z1之比≤2/3，較佳地≤1/2，更佳地≤1/3，則提示該藥物具有抑制kpc型碳青霉烯酶耐藥菌的效果。

48、在本發(fā)明的第五方面，提供了一種擴(kuò)增kpc基因的特異性引物對(duì)，所述引物對(duì)包括如seq?id?no:1所示的序列，和如seq?id?no:6所示的序列。

49、在另一優(yōu)選例中，所述引物對(duì)包括如seq?id?no:11所示的序列或其互補(bǔ)鏈，和如seq?id?no:17所示的序列或其互補(bǔ)鏈。

50、在另一優(yōu)選例中，所述引物對(duì)包括如seq?id?no:3所示的序列或其互補(bǔ)鏈，和如seq?id?no:6所示的序列或其互補(bǔ)鏈。

51、在另一優(yōu)選例中，所述引物對(duì)包括如seq?id?no:3所示的序列或其互補(bǔ)鏈，和如seq?id?no:8所示的序列或其互補(bǔ)鏈。

52、在另一優(yōu)選例中，所述引物對(duì)包括如seq?id?no:1所示的序列或其互補(bǔ)鏈，和如seq?id?no:9所示的序列或其互補(bǔ)鏈。

53、在另一優(yōu)選例中，所述引物對(duì)包括如seq?id?no:2所示的序列或其互補(bǔ)鏈，和如seq?id?no:6所示的序列或其互補(bǔ)鏈。

54、在另一優(yōu)選例中，所述引物對(duì)包括如seq?id?no:4所示的序列或其互補(bǔ)鏈，和如seq?id?no:6所示的序列或其互補(bǔ)鏈。

55、在另一優(yōu)選例中，所述引物對(duì)包括如seq?id?no:4所示的序列或其互補(bǔ)鏈，和如seq?id?no:9所示的序列或其互補(bǔ)鏈。

56、應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。