本發(fā)明屬于生物，具體涉及一種昆蟲(chóng)腺苷三磷酸結(jié)合盒超家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、農(nóng)業(yè)病蟲(chóng)害問(wèn)題是農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要限制因素，我國(guó)常發(fā)性農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)有730多種,其中20多種屬于重大農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)，重發(fā)時(shí)害蟲(chóng)為害造成農(nóng)作物產(chǎn)量損失高達(dá)30％以上。目前，化學(xué)農(nóng)藥防治仍然是現(xiàn)階段防治大多數(shù)害蟲(chóng)的最重要和最廣泛的策略。然而，近年來(lái)的研究表明，很多昆蟲(chóng)進(jìn)化出多種耐藥機(jī)制，能夠?qū)σ幌盗袣⑾x(chóng)藥物產(chǎn)生抗性。農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)抗性機(jī)制的研究對(duì)于合理使用農(nóng)藥，有效治理蟲(chóng)害具有重要的理論意義。腺苷三磷酸結(jié)合盒超家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(abc?transporters)是生物體中最大的跨膜蛋白家族之一，利用atp的水解提供能量促進(jìn)多種物質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。根據(jù)序列相似性和保守結(jié)構(gòu)域,可以把a(bǔ)bc轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族分為8個(gè)亞家族(abca-abch)，每個(gè)亞家族的成員數(shù)及功能不同。這類(lèi)蛋白在各種生物體內(nèi)均有分布，其主要功能包括轉(zhuǎn)運(yùn)物質(zhì)，信號(hào)傳導(dǎo)，細(xì)胞表面受體及參與細(xì)胞內(nèi)dna修復(fù)，轉(zhuǎn)錄及調(diào)節(jié)基因的表達(dá)過(guò)程等。近年來(lái)的研究表明，abc轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的突變或過(guò)表達(dá)不僅與節(jié)肢動(dòng)物對(duì)化學(xué)農(nóng)藥的抗藥性密切相關(guān)，而且在抗bt毒素方面也起著非常重要的作用。abch亞家族轉(zhuǎn)蛋白是節(jié)肢動(dòng)物特有的abc轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，可作為一種潛在的抗藥性篩選靶標(biāo)，闡明害蟲(chóng)通過(guò)abch轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將農(nóng)藥分子運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞外的機(jī)制對(duì)于應(yīng)對(duì)殺蟲(chóng)劑抗藥性問(wèn)題具有十分重要的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、鑒于現(xiàn)有技術(shù)的需求，本發(fā)明提供一種基于atpase活性的abch轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白農(nóng)藥分子底物的篩選方法，赤擬谷盜腺苷三磷酸結(jié)合盒超家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白abch以及其與農(nóng)藥小分子復(fù)合物的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，通過(guò)三維結(jié)構(gòu)解析和結(jié)構(gòu)分析獲得的結(jié)構(gòu)信息，可進(jìn)行殺蟲(chóng)劑設(shè)計(jì)，在防治蟲(chóng)害領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

2、本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題的技術(shù)方案如下：

3、昆蟲(chóng)腺苷三磷酸結(jié)合盒超家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白abch，為三維立體結(jié)構(gòu)，其中蛋白結(jié)構(gòu)為同源二聚體，具有c2對(duì)稱(chēng)性；所述蛋白結(jié)構(gòu)的每個(gè)單體具有一個(gè)腺苷三磷酸結(jié)合和水解結(jié)構(gòu)域，一個(gè)包含6個(gè)跨膜螺旋的跨膜結(jié)構(gòu)域和一個(gè)胞外結(jié)構(gòu)域，其中蛋白結(jié)構(gòu)的跨膜結(jié)構(gòu)域中，由每個(gè)單體的螺旋1、螺旋2、螺旋5形成了一個(gè)“拱形”底物結(jié)合通道。

4、所述“拱形”底物結(jié)合通道的螺旋序列為：螺旋1序列為nvgvmlfifalpvmqvilfclai、螺旋2序列為ftdfvapgviltivfflavaltssaliier、螺旋5序列為ernaiqlalgsfyptlll。

5、所述的昆蟲(chóng)腺苷三磷酸結(jié)合盒超家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白abch，所述昆蟲(chóng)為赤擬谷盜(triboliumcastaneumherbst)；所述昆蟲(chóng)腺苷三磷酸結(jié)合盒超家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的氨基酸序列如seq?id?no.1所示。

6、昆蟲(chóng)腺苷三磷酸結(jié)合盒超家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白abch的制備方法，包括如下步驟：

7、1)abch蛋白的表達(dá)純化

8、利用hek293f細(xì)胞重組表達(dá)abch蛋白，將收集的表達(dá)abch的細(xì)胞破碎后，利用親和層析和凝膠過(guò)濾層析獲得高純度的abch蛋白；

9、2)冷凍電鏡樣品制備

10、(1)將高純度的abch蛋白濃縮至5mg/ml；(2)將quantifoil公司的r1.2/1.3，300目金載網(wǎng)輝光放電處理30秒，輝光放電氣體為h2、o2；(3)使用fei公司的vitrobot?mark?iv進(jìn)行制樣，設(shè)置冷凍制樣條件：blot-time：3s，wait-time：5s，drain-time：0s，blot-force：3，(4)取3μl蛋白，加在載網(wǎng)表面，vitrobot?mark?iv執(zhí)行制樣程序結(jié)束后，樣品迅速置入液態(tài)乙烷，隨后至于液氮中保存；

11、3)冷凍樣品在冷凍電子顯微鏡下收集數(shù)據(jù)和解析，得到蛋白abch的三維立體結(jié)構(gòu)。

12、所述步驟1)中的重組表達(dá)abch蛋白為采用表達(dá)載體為pcdna3.1，利用線(xiàn)性pei轉(zhuǎn)染方法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至hek293f細(xì)胞中，在37℃，150rpm,5％?co2的條件下進(jìn)行蛋白的表達(dá)。

13、所述步驟1)中高純度的abch蛋白的制備方法，包括如下步驟：

14、(a)將收集的含abch蛋白質(zhì)粒的hek293f細(xì)胞用ph8.0、20mm?tris-hcl,150mmnacl緩沖液進(jìn)行懸浮，用高壓勻漿機(jī)破碎細(xì)胞，隨后用離心機(jī)在13000rpm條件下離心30min，取上清，在150000g條件下進(jìn)行超速離心，收集細(xì)胞膜，將細(xì)胞膜在ph8.0、20mmtris-hcl,150mm?nacl，1％glyco-diosgenin條件下溶解1h，使細(xì)胞膜上的目的蛋白充分溶解，混合組分在150000g條件下進(jìn)行超速離心，收集上清；

15、(b)對(duì)上清組分采用strep親和層析對(duì)目的蛋白進(jìn)行富集，上清流穿strep親和層析柱后，用含有ph8.0、20mm?tris-hcl,150mm?nacl，1％?glyco-diosgenin的緩沖液清洗雜蛋白，隨后立即用含有ph8.0、20mm?tris-hcl,150mm?nacl，1％?glyco-diosgenin，50mm生物素的緩沖液洗脫目的蛋白；

16、(c)將蛋白收集后，濃縮至500μl，用superose?6凝膠過(guò)濾層析柱進(jìn)行進(jìn)一步純化，獲得高純度的目的蛋白。

17、昆蟲(chóng)腺苷三磷酸結(jié)合盒超家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白abch在篩選小分子農(nóng)藥底物中的應(yīng)用。

18、昆蟲(chóng)腺苷三磷酸結(jié)合盒超家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白abch作為殺蟲(chóng)劑抗性靶標(biāo)的應(yīng)用。

19、根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，包括如下步驟：

20、(a)基于底物對(duì)atp水解活性的激活原理，將篩選昆蟲(chóng)腺苷三磷酸結(jié)合盒超家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白abch的小分子農(nóng)藥底物，

21、(b)復(fù)合物冷凍電鏡樣品制備

22、(i)將高純度的abch蛋白濃縮至5mg/ml，加入終濃度為100μμ小分子農(nóng)藥底物；(ii)將quantifoil公司的r1.2/1.3，300目金載網(wǎng)輝光放電處理30秒，輝光放電氣體為h2、o2；(iii)使用fei公司的vitrobot?mark?iv進(jìn)行制樣，設(shè)置冷凍制樣條件：blot-time：3s，wait-time：5s，drain-time：0s，blot-force：3，(iv)取3μl蛋白，加在載網(wǎng)表面，vitrobotmark?iv執(zhí)行制樣程序結(jié)束后，樣品迅速置入液態(tài)乙烷，隨后至于液氮中保存；

23、(c)冷凍樣品在冷凍電子顯微鏡下收集數(shù)據(jù)和解析，得到蛋白abch的三維立體結(jié)構(gòu)與小分子農(nóng)藥底物結(jié)合位點(diǎn)；

24、(d)以三維立體結(jié)構(gòu)中的“拱形”通道以及小分子農(nóng)藥底物結(jié)合位點(diǎn)作為靶點(diǎn)指導(dǎo)靶向abch的耐藥性逆轉(zhuǎn)劑的設(shè)計(jì)與開(kāi)發(fā)。

25、所述小分子農(nóng)藥底物為苯氧威，所述結(jié)合位點(diǎn)為arg404、met405、val411、phe414、phe608、ser616、ile707、gln708、ala710。

26、本發(fā)明基于底物對(duì)atp水解活性的激活原理，通過(guò)檢測(cè)15種農(nóng)藥小分子對(duì)abch的atpase活性的激活效應(yīng)，篩選到苯氧威作為abch的潛在農(nóng)藥小分子底物。

27、通過(guò)冷凍電鏡技術(shù)解析了昆蟲(chóng)腺苷三磷酸結(jié)合盒超家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白abch以及abch與苯氧威復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)，為三維立體結(jié)構(gòu)，蛋白結(jié)構(gòu)為同源二聚體，具有c2對(duì)稱(chēng)性；所述蛋白結(jié)構(gòu)的每個(gè)單體具有一個(gè)腺苷三磷酸結(jié)合和水解結(jié)構(gòu)域，一個(gè)包含6個(gè)跨膜螺旋的跨膜結(jié)構(gòu)域和一個(gè)胞外結(jié)構(gòu)域；所述蛋白結(jié)構(gòu)的跨膜結(jié)構(gòu)域中，由每個(gè)單體的螺旋1、螺旋2、螺旋5形成了一個(gè)“拱形”底物結(jié)合通道，所述“拱形”底物結(jié)合通道的螺旋序列為：nvgvmlfifalpvmqvilfclai(螺旋1)、ftdfvapgviltivfflavaltssaliier(螺旋2)、ernaiqlalgsfyptlll(螺旋5)。該“拱形”底物結(jié)合通道的兩個(gè)胞內(nèi)側(cè)末端，分別結(jié)合一分子苯氧威，該結(jié)合口袋由arg404、met405、val411、phe414、phe608、ser616、ile707、gln708、ala710構(gòu)成(圖5)。

28、本發(fā)明同時(shí)評(píng)估了abch對(duì)苯氧威的外排活性。轉(zhuǎn)染了abch或egfp(對(duì)照組)的細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)后，加入苯氧威，繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)后，使用cck8試劑盒為評(píng)估細(xì)胞活力，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染了abch的細(xì)胞對(duì)苯氧威產(chǎn)生明顯的解毒能力，說(shuō)明abch可以外排苯氧威(圖7)。

29、本發(fā)明以赤擬谷盜腺苷三磷酸結(jié)合盒超家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白abch為對(duì)象，提供了一種基于親和層析、凝膠篩分兩步法的高效、普適的重組蛋白表達(dá)制備方法，獲得高純度蛋白，并制備得到了冷凍電鏡樣品，通過(guò)冷凍電鏡技術(shù)解析了這一蛋白的完整的結(jié)構(gòu)。

30、本技術(shù)基于底物對(duì)atp水解活性的激活原理的篩選，發(fā)現(xiàn)了苯氧威分子可能是abch的底物，進(jìn)一步解析了abch與苯氧威復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)底物轉(zhuǎn)運(yùn)通道中確實(shí)存在苯氧威，表明苯氧威確實(shí)是abch的底物。同時(shí)通過(guò)基于細(xì)胞毒性的外排實(shí)驗(yàn)，表明abch對(duì)苯氧威具有解毒能力，即abch通過(guò)外排苯氧威，介導(dǎo)殺蟲(chóng)劑抗性的形成。昆蟲(chóng)腺苷三磷酸結(jié)合盒超家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白abch的結(jié)構(gòu)具有狹長(zhǎng)的“拱形”底物結(jié)合通道，農(nóng)藥底物通過(guò)該結(jié)合通道與轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白abch結(jié)合，并通過(guò)該通道排出體外，因此該通道可作為殺蟲(chóng)劑抗性的靶標(biāo)，指導(dǎo)高效抑制劑的設(shè)計(jì)和開(kāi)發(fā)。

31、另外，本發(fā)明提供的應(yīng)用方法可以擴(kuò)展應(yīng)用到所有abc轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族成員。