本發(fā)明涉及免疫學，具體涉及綿羊清道夫受體a抗原多肽及其多克隆抗體、制備方法和應用。

背景技術：

1、清道夫受體a(sra)，又稱巨噬細胞清道夫受體1(msr1)或cd204，屬于一類主要在巨噬細胞表達的模式識別受體。清道夫受體a是清道夫受體家族中的一員，sra以3種類型存在：i型、ii型和iii型，它們來源于同一個基因的選擇性剪接。i型和ii型異構體是功能受體，能夠介導低密度脂蛋白的內吞作用，iii型異構體沒有嵌入到膜上，沒有攝取的功能。但當其共同表達時，iii型異構體可以抑制i型和ii型異構體的功能，暗示了巨噬細胞中清道夫受體活性的調節(jié)機制。

2、1979年首次發(fā)現(xiàn)了巨噬細胞清道夫受體，隨后，根據(jù)清道夫受體的結構對其進行了分類，并與后來相繼出現(xiàn)的其他幾個清道夫受體共同組成了清道夫受體家族。清道夫受體家族包括12個不同的亞類(a-l)。sra最先被鑒定，一個卷曲的線圈區(qū)域、一個膠原樣區(qū)域和一個c末端的球狀結構域組成三聚體結構。其中膠原區(qū)域為與配體結合的主要位點。sra各個成員結構比較接近，一般都是由n-末端胞漿區(qū)域、跨膜螺旋和c末端胞外部分組成。sra蛋白的3種不同異構體主要區(qū)別在于：i型分子有富含半胱氨酸的α-螺旋卷曲結構域，ii型則缺乏富含半胱氨酸的c末端區(qū)域。雖然這2個同分異構體結構略有差異，但是它們的功能基本相同，而iii型則陷在內質網(wǎng)中，沒有介導吞噬的功能。

3、目前，人、豬等的sra基因已被克隆鑒定，但是綿羊的sra研究較少，缺乏制備抗體的抗原多肽。

技術實現(xiàn)思路

1、為解決上述技術問題，本發(fā)明提供了綿羊清道夫受體a抗原多肽及其多克隆抗體、制備方法和應用。

2、一種綿羊清道夫受體a抗原多肽，所述抗原多肽的氨基酸序列為ksldekqvhleqelkg。

3、一種清道夫受體a多克隆抗體的制備方法，包括以下步驟：以血藍蛋白與權利要求1中所述抗原多肽的偶聯(lián)物為免疫原免疫動物，從所述動物中獲得清道夫受體a多克隆抗體。

4、優(yōu)選的，將所述抗原多肽與半胱氨酸連接后與血藍蛋白偶聯(lián)，得完全抗原；

5、乳化所述完全抗原，用乳化后的完全抗原免疫大白兔；

6、收集免疫后的大白兔的血清，得到所述清道夫受體a多克隆抗體。

7、優(yōu)選的，免疫大白兔的方法為第一次免疫后每隔兩周免疫一次，免疫7次。

8、優(yōu)選的，第一次的免疫量為450μg/只～500μg/只，之后的免疫量為200μg/只～300μg/只。

9、優(yōu)選的，收集含有所述清道夫受體a多克隆抗體的大白兔血液，4℃靜置12h～24h，分離得到血清，即得到所述清道夫受體a多克隆抗體。

10、優(yōu)選的，將偶聯(lián)好的清道夫受體a抗原多肽1×pbs溶解，與弗氏完全佐劑混勻，在冰上用乳化儀將其乳化。

11、一種綿羊清道夫受體a多克隆抗體，其是通過所述制備方法制得的。

12、所述的綿羊清道夫受體a多克隆抗體在制備檢測綿羊清道夫受體a蛋白的試劑中的應用。

13、sra是在細胞表面形成同源三聚體的ii型跨膜糖蛋白，細胞膜表面蛋白在細胞信號轉導、物質的轉運以及細胞與細胞之間的相互作用中扮演著重要的角色。sra具有非常短的細胞質尾巴，沒有可識別的信號域，因此被認為是通過形成一個多分子信號復合體來發(fā)揮作用的。但是不能排除sra直接通過其細胞質尾巴來進行信號轉導的可能，人源sra有一條50個氨基酸長的細胞質尾巴，小鼠的有55個氨基酸。對sra蛋白序列的in?silico分析顯示，在人類和小鼠中存在一個保守的絲氨酸殘基，根據(jù)uniprot，該殘基可以被磷酸化，這暗示了下游的磷酸化級聯(lián)反應。

14、為了檢測綿羊sra的表達，本發(fā)明通過多個軟件預測sra的抗原表位，要避免磷酸化位點、糖基化位點等出現(xiàn)在抗原表位上，抗原多肽不能太長，一般為12aa～15aa，長了增長成本，太短影響抗體特異性；篩選出優(yōu)勢抗原表位偶聯(lián)血藍蛋白免疫新西蘭大白兔和昆明鼠制備針對sra的多克隆抗體。使用合成肽免疫動物產(chǎn)生抗體提高了針對目標抗原的抗體的特異性?？乖嚯呐c載體蛋白的結合是抗體制備成功的關鍵之一，抗原多肽偶聯(lián)血藍蛋白(klh)增強其免疫原性，且klh與哺乳動物的蛋白質在系統(tǒng)發(fā)育上相距甚遠，這減少了免疫哺乳動物制備抗體中假陽性的產(chǎn)生。值得注意的是，在免疫動物前應該將動物正常飼養(yǎng)1周，觀察其精神及飲食狀態(tài)，確保動物健康后再進行免疫，免疫的有效性與動物福利是獲得抗血清的關鍵。

15、為檢測綿羊清道夫受體a蛋白表達量，利用化學合成的方法制備sra抗原多肽免疫新西蘭大白兔和昆明小鼠制備多克隆抗體，間接elisa檢測其效價，ifa及westernblot檢測其特異性。

16、與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果在于：

17、本發(fā)明成功制備了兔源sra和鼠源sra的多克隆抗體，間接elisa結果顯示鼠源sra和兔源sra都具有良好的反應性，兔源sra抗體效價超過了105，該多克隆抗體還能應用于ifa特異性驗證，在sra過表達的細胞中能觀察到熒光陽性的細胞。因此，抗原多肽制備抗體應該以免疫大白兔為主，免疫小鼠制備的抗體反應性稍弱。針對sra多克隆抗體的制備不僅可以應用于檢測sra的表達，還對sra的功能研究非常重要。

技術特征：

1.一種綿羊清道夫受體a抗原多肽，其特征在于，所述抗原多肽的氨基酸序列為ksldekqvhleqelkg。

2.一種清道夫受體a多克隆抗體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：以血藍蛋白與權利要求1中所述抗原多肽的偶聯(lián)物為免疫原免疫動物，從所述動物中獲得清道夫受體a多克隆抗體。

3.根據(jù)權利要求2所述的制備方法，其特征在于，將所述抗原多肽與半胱氨酸連接后與血藍蛋白偶聯(lián)，得完全抗原；

4.根據(jù)權利要求3所述的制備方法，其特征在于，免疫大白兔的方法為第一次免疫后每隔兩周免疫一次，免疫7次。

5.根據(jù)權利要求4所述的制備方法，其特征在于，第一次的免疫量為450μg/只～500μg/只，之后的免疫量為200μg/只～300μg/只。

6.根據(jù)權利要求3所述的制備方法，其特征在于，收集含有所述清道夫受體a多克隆抗體的大白兔血液，4℃靜置12h～24h，分離得到血清，即得到所述清道夫受體a多克隆抗體。

7.根據(jù)權利要求3所述的制備方法，其特征在于，將偶聯(lián)好的清道夫受體a抗原多肽1×pbs溶解，與弗氏完全佐劑混勻，在冰上用乳化儀將其乳化。

8.一種綿羊清道夫受體a多克隆抗體，其特征在于，其是通過如權利要求2-7中任一項所述制備方法制得的。

9.權利要求8所述的綿羊清道夫受體a多克隆抗體在制備檢測綿羊清道夫受體a蛋白的試劑中的應用。

技術總結
本發(fā)明屬于免疫學技術領域，具體為綿羊清道夫受體A抗原多肽及其多克隆抗體、制備方法和應用，一種綿羊SRA抗原多肽的氨基酸序列為KSLDEKQVHLEQELKG，利用所述抗原多肽制備得到兔源SRA多克隆抗體，兔源SRA多克隆抗體具有良好的反應性和特異性，可用于檢測綿羊SRA蛋白。

技術研發(fā)人員：張彥兵,孫延鳴,盛金良,王鋼,趙廣新,成國杰,周雨蝶,張秦川,曹鑫艷,張石磊,賀筍
受保護的技術使用者：石河子大學
技術研發(fā)日：
技術公布日：2024/12/30