本發(fā)明涉及固定化酶法制備l-2-氨基丁酸的，尤其涉及一種用于制備l-2-氨基丁酸的共固定化三酶體系，以及該共固定化酶的制備及利用該共固定化三酶體系催化反應(yīng)制備l-2-氨基丁酸的方法。

背景技術(shù)：

1、l-2-氨基丁酸是一種能抑制人體神經(jīng)信息傳遞并促進腦細胞代謝的非天然手性氨基酸，也是重要的化工原料和醫(yī)藥中間體，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、農(nóng)藥及食品領(lǐng)域，其中在醫(yī)藥領(lǐng)域，廣泛用于多種手性藥物的合成，例如l-2-氨基丁酸是合成新型抗癲癇藥左乙拉西坦的主要生產(chǎn)原料，也是合成抑菌抗結(jié)核藥乙胺丁醇鹽酸鹽的關(guān)鍵手性前體。

2、目前制備l-2-氨基丁酸主要有化學法與生物法。傳統(tǒng)的化學制備法主要采用酮丁酸還原法、脫硫反應(yīng)法、鹵代氨解法、化學拆分法等，化學法的缺點是易形成消旋體，不利于手性化合物的合成，且反應(yīng)條件嚴苛、環(huán)境污染嚴重，不符合工業(yè)發(fā)展趨勢。生物制備法多采用的是生物酶法，以氨基?；?、氨基酸氧化酶、腈水合酶、轉(zhuǎn)氨酶、脫氫酶等生物酶作為催化劑，反應(yīng)條件溫和、立體選擇性高，而且綠色環(huán)保，具備化學合成法無可比擬的優(yōu)勢，但用作催化劑的游離酶存在催化劑成本高、難以回收再利用，酶活力穩(wěn)定性差、易失活，與產(chǎn)物混在一起增加分離純化負擔等缺點。例如目前轉(zhuǎn)化率較高的一種生物酶法制備l-2-氨基丁酸是同時采用蘇氨酸脫氨酶、亮氨酸脫氫酶和甲酸脫氫酶三種游離酶，這三種游離酶共同使用較難回收再利用，且輔酶再生效率低，產(chǎn)物純化復雜。為解決游離酶的缺陷，人們通常采用固定化酶的方式，但多種游離酶的相互影響給共固定化體系帶來技術(shù)難度，故現(xiàn)有技術(shù)尚未出現(xiàn)對蘇氨酸脫氨酶、亮氨酸脫氫酶和甲酸脫氫酶這三種游離酶成功進行共固定化的報道，而是通過改變用作催化劑的游離酶種類，如由醇脫氫酶、蘇氨酸醛脫氫酶和l-氨基酸脫氫酶替代亮氨酸脫氫酶，利用共固定化多酶體系和共固定化輔酶體系來生產(chǎn)l-2-氨基丁酸，詳見中國專利申請cn112522336a，雖然該制備法成功采用了固定化酶體系，但增加了酶的種類和成本，復雜了反應(yīng)步驟，不利于工業(yè)化生產(chǎn)，故如何將蘇氨酸脫氨酶、亮氨酸脫氫酶和甲酸脫氫酶這三種游離酶進行有效共固定，以實現(xiàn)反應(yīng)的高轉(zhuǎn)化率和固定化酶的高循環(huán)利用率，對于l-2-氨基丁酸的生產(chǎn)具有極大促進意義。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、為解決現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，本發(fā)明提供了一種共固定化三酶體系，用于催化生產(chǎn)l-2-氨基丁酸。本發(fā)明的共固定化三酶體系成功將l-蘇氨酸脫氨酶、l-亮氨酸脫氫酶和甲酸脫氫酶這三種酶共同固定在同一載體即多孔型二氧化硅納米花上，以實現(xiàn)對l-2-氨基丁酸的高效催化合成、產(chǎn)物有效分離、輔酶循環(huán)再生和酶的重復利用。

2、本發(fā)明的用于制備l-2-氨基丁酸的共固定化三酶體系，由l-蘇氨酸脫氨酶(ltd)、l-亮氨酸脫氫酶(ldh)和甲酸脫氫酶(fdh)共同固定在多孔型載體二氧化硅納米花上得到，制備共固定化三酶體系所用l-蘇氨酸脫氨酶、l-亮氨酸脫氫酶和甲酸脫氫酶的質(zhì)量比為(0.1～2):1:(1～10)。

3、利用特定多孔型載體二氧化硅納米花，實現(xiàn)對ltd、ldh和fdh這三種酶的共同固定，有效提高了ltd對2-酮丁酸的底物耐受性、三種酶穩(wěn)定性及重復使用性。使用該共固定化三酶體系催化生產(chǎn)l-2-氨基丁酸，不僅反應(yīng)產(chǎn)率高，而且產(chǎn)物便于分離，能夠簡化合成與后續(xù)分離純化步驟，有效降低生產(chǎn)成本。

4、作為對上述技術(shù)方案的限定，l-蘇氨酸脫氨酶、l-亮氨酸脫氫酶和甲酸脫氫酶依照下述任一種方式固定在載體二氧化硅納米花上：

5、(1)、按先后順序依次將l-蘇氨酸脫氨酶、l-亮氨酸脫氫酶和甲酸脫氫酶固定在載體二氧化硅納米花上，記為ltd+ldh+fdh；

6、(2)、按先后順序依次將l-亮氨酸脫氫酶、l-蘇氨酸脫氨酶和甲酸脫氫酶固定在載體二氧化硅納米花上，記為ldh+ltd+fdh；

7、(3)、將l-蘇氨酸脫氨酶、l-亮氨酸脫氫酶和甲酸脫氫酶同時固定在載體二氧化硅納米花上，記為(ltd+ldh+fdh)；

8、(4)、在載體二氧化硅納米花上先固定l-蘇氨酸脫氨酶，再同時固定l-亮氨酸脫氫酶和甲酸脫氫酶，記為ltd+(ldh+fdh)；

9、(5)、在載體二氧化硅納米花上先固定l-亮氨酸脫氫酶，再同時固定l-蘇氨酸脫氨酶和甲酸脫氫酶，記為ldh+(ltd+fdh)。

10、作為對上述技術(shù)方案的限定，制備共固定化三酶體系所用l-蘇氨酸脫氨酶、l-亮氨酸脫氫酶和甲酸脫氫酶的質(zhì)量比為(0.5～1):1:(1～10)。

11、作為對上述技術(shù)方案的限定，載體二氧化硅納米花是以十六烷基三甲基溴化銨為模板，硅酸四乙酯為硅源，正丁醇和環(huán)己烷為有機相，水為溶劑，尿素為表面活性劑，在60～80℃下攪拌反應(yīng)后烘干、煅燒制得。

12、作為對上述技術(shù)方案的限定，l-蘇氨酸脫氨酶、l-亮氨酸脫氫酶、甲酸脫氫酶與載體混合后，在25～35℃、ph?7.0～9.0的條件下充分震蕩進行固定化。

13、進一步完善共固定化酶的條件，為酶創(chuàng)造適宜的催化環(huán)境，從而優(yōu)化固定化酶性能，使其具備催化率高、穩(wěn)定性高、容易回收與重復使用等優(yōu)勢。

14、同時，本發(fā)明還提供了如上所述共固定化三酶體系的制備方法，包括以下操作步驟：將經(jīng)過戊二醛活化后的多孔型載體二氧化硅納米花，與pbs緩沖溶液以及l(fā)-蘇氨酸脫氨酶、l-亮氨酸脫氫酶、甲酸脫氫酶三種酶混合，得到的混懸液在25～35℃、ph?7.0～9.0的條件下充分震蕩進行固定化，得到共固定化酶體系。

15、作為對上述技術(shù)方案的限定，固定化過程載體與總酶量的質(zhì)量比為1:0.6～1.2。

16、共固定化三酶體系的制備簡單便捷，條件溫和，利于該共固定化酶在l-2-氨基丁酸的生產(chǎn)應(yīng)用。

17、另外，本發(fā)明還提供了一種l-2-氨基丁酸的制備方法，是將上述共固定化三酶體系用作由l-蘇氨酸制備l-2-氨基丁酸的合成反應(yīng)催化劑。

18、作為對上述技術(shù)方案的限定，合成反應(yīng)條件為將100～500mm?l-蘇氨酸、0.4～2m甲酸鈉、質(zhì)量濃度0.25～2.5％的nadh、ph?7.0～9.0的緩沖溶液以及適量的共固定化酶，在25～35℃震蕩反應(yīng)12～20h。

19、使用本發(fā)明的共固定化酶催化合成l-2-氨基丁酸，產(chǎn)率達到92％以上，并能實現(xiàn)反應(yīng)后產(chǎn)物的有效分離、酶的回收再利用以及輔酶循環(huán)再生，可有效簡化合成步驟與后續(xù)分離純化步驟，降低生產(chǎn)成本。

20、綜上所述，本發(fā)明成功將l-蘇氨酸脫氨酶、l-亮氨酸脫氫酶與甲酸脫氫酶共固定于多孔型載體二氧化硅納米上，形成的共固定化三酶體系提高了l-亮氨酸脫氫酶對2-酮丁酸的底物耐受性、三種天然酶的穩(wěn)定性與貯藏性以及重復使用性。利用本發(fā)明的共固定化三酶體系催化合成l-2-氨基丁酸，可以實現(xiàn)酶的回收再利用與輔酶循環(huán)再生，簡化合成步驟與后續(xù)分離純化步驟，優(yōu)化工藝過程，降低生產(chǎn)成本。

技術(shù)特征：

1.一種用于制備l-2-氨基丁酸的共固定化三酶體系，其特征在于：該共固定化三酶體系由l-蘇氨酸脫氨酶、l-亮氨酸脫氫酶和甲酸脫氫酶共同固定在多孔型載體二氧化硅納米花上得到，制備共固定化三酶體系所用l-蘇氨酸脫氨酶、l-亮氨酸脫氫酶和甲酸脫氫酶的質(zhì)量比為(0.1～2):1:(1～10)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述用于制備l-2-氨基丁酸的共固定化三酶體系，其特征在于，l-蘇氨酸脫氨酶、l-亮氨酸脫氫酶和甲酸脫氫酶依照下述任一種方式固定在載體二氧化硅納米花上：

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述用于制備l-2-氨基丁酸的共固定化三酶體系，其特征在于：制備共固定化三酶體系所用l-蘇氨酸脫氨酶、l-亮氨酸脫氫酶和甲酸脫氫酶的質(zhì)量比為(0.5～1):1:(1～10)。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述用于制備l-2-氨基丁酸的共固定化三酶體系，其特征在于：載體二氧化硅納米花是以十六烷基三甲基溴化銨為模板，硅酸四乙酯為硅源，正丁醇和環(huán)己烷為有機相，水為溶劑，尿素為表面活性劑，在60～80℃下攪拌反應(yīng)后烘干、煅燒制得。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述用于制備l-2-氨基丁酸的共固定化三酶體系，其特征在于：l-蘇氨酸脫氨酶、l-亮氨酸脫氫酶、甲酸脫氫酶與載體混合后，在25～35℃、ph?7.0～9.0的條件下充分震蕩進行固定化。

6.如權(quán)利要求1～5中任一項所述共固定化三酶體系的制備方法，其特征在于，包括以下操作步驟：

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述共固定化三酶體系的制備方法，其特征在于：固定化過程載體與總酶量的質(zhì)量比為1:0.6～1.2。

8.一種l-2-氨基丁酸的制備方法，其特征在于：將權(quán)利要求1～5中任一項所述共固定化三酶體系用作由l-蘇氨酸制備l-2-氨基丁酸的合成反應(yīng)催化劑。

9.根據(jù)權(quán)利要求7所述l-2-氨基丁酸的制備方法，其特征在于：合成反應(yīng)條件為將100～500mm?l-蘇氨酸、0.4～2m甲酸鈉、質(zhì)量濃度0.25～2.5％的nadh、ph?7.0～9.0的緩沖溶液以及共固定化酶，在25～35℃震蕩反應(yīng)12～20h。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種用于制備L?2?氨基丁酸的共固定化三酶體系，由L?蘇氨酸脫氨酶、L?亮氨酸脫氫酶和甲酸脫氫酶共同固定在載體二氧化硅納米花上得到，制備共固定化三酶體系所用L?蘇氨酸脫氨酶、L?亮氨酸脫氫酶和甲酸脫氫酶的質(zhì)量比為(0.1～2):1:(1～10)。本發(fā)明成功將L?蘇氨酸脫氨酶、L?亮氨酸脫氫酶、甲酸脫氫酶這三種酶共同固定在同一載體上，不僅提高了三種酶的穩(wěn)定性與重復使用性，而且使用該共固定化三酶體系催化制備L?2?氨基丁酸的反應(yīng)產(chǎn)率能夠達到92％以上，同時實現(xiàn)共固定化酶與產(chǎn)物的有效分離以及酶的回收再利用和輔酶循環(huán)再生，從而可以簡化生產(chǎn)L?2?氨基丁酸的合成反應(yīng)步驟與后續(xù)分離純化步驟，優(yōu)化生產(chǎn)工序，降低生產(chǎn)成本。

技術(shù)研發(fā)人員：姜艷軍,賈紅薇,劉運亭,周麗亞,賀瑩,馬麗,鄭曉冰,劉冠華
受保護的技術(shù)使用者：河北工業(yè)大學
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/30