本發(fā)明申請涉及基因工程，具體涉及一種山葡萄鈣結(jié)合蛋白基因 vamcp1、其編碼蛋白、表達載體及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、葡萄及其相關(guān)產(chǎn)品因其豐富的營養(yǎng)價值與多樣的應(yīng)用價值，在全球范圍內(nèi)被廣泛栽培。然而，極端溫度條件，特別是冷脅迫，對葡萄的生長和發(fā)育構(gòu)成了嚴(yán)重威脅，冷脅迫作為主要的非生物逆境之一，通常被細分為低溫脅迫（0℃～15℃）和冷凍脅迫（低于0℃）兩個層次。在遭遇低溫脅迫時，葡萄植株會經(jīng)歷一系列生理機能的下降，包括膜流動性的降低、蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的減弱、酶活性的抑制以及抗寒基因表達模式的改變，這些變化往往導(dǎo)致植物遭受不可逆的損害。

2、為了應(yīng)對低溫脅迫，植物細胞進化出了一套復(fù)雜的信號感知與傳導(dǎo)機制。當(dāng)植物接收到寒冷信號時，細胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)途徑會被激活，這些途徑涉及多種蛋白和非蛋白成分，它們相互作用，形成一個復(fù)雜的信號網(wǎng)絡(luò)。其中，鈣離子（ca2?）作為重要的第二信使，在植物的生長發(fā)育和對環(huán)境脅迫的響應(yīng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。當(dāng)植物面臨低溫脅迫時，ca2?會從細胞外迅速流入細胞質(zhì)，導(dǎo)致細胞內(nèi)ca2?水平顯著升高。這一變化被各種ca2?傳感器蛋白所識別、解碼和傳遞，進而引發(fā)一系列生理反應(yīng)以應(yīng)對寒冷環(huán)境。

3、除了ca2?信號外，低溫脅迫還伴隨著活性氧（ros）的積累。ros作為生物體內(nèi)的一種信號分子，在正常情況下發(fā)揮著重要作用，但過度積累會對植物細胞造成嚴(yán)重傷害。為了抵御這種傷害，植物體內(nèi)形成了一套抗氧化防御系統(tǒng)，主要由抗氧化劑和抗氧化酶組成，如超氧化物歧化酶（sod）、過氧化氫酶（cat）和過氧化物酶（pod）等，它們能夠清除細胞內(nèi)過多的ros，從而保護植物免受傷害。

4、在分子層面，低溫脅迫會誘導(dǎo)相關(guān)抗寒基因的表達。其中，ice-cbf-cor通路是一個重要的抗寒信號傳導(dǎo)途徑。該通路中的cbf基因?qū)儆赿reb家族，其編碼的蛋白質(zhì)能夠激活cor基因的表達，從而提高植物的耐凍性。此外，已經(jīng)在植物中鑒定出了多個參與調(diào)控抗低溫脅迫性的抗寒基因家族，如bhlh、myb、wrky等。

5、然而，目前關(guān)于葡萄中抗寒基因的功能研究仍相對有限。原產(chǎn)于中國的山葡萄是葡萄屬中最抗寒的品種，挖掘山葡萄中的抗寒相關(guān)基因，探究其功能和作用機理，并通過分子育種手段提高不抗寒葡萄抗低溫脅迫性意義重大。

6、公開于該背景技術(shù)部分的信息僅用于加深對本公開的背景技術(shù)的理解，而不應(yīng)當(dāng)被視為承認或以任何形式暗示該信息構(gòu)成本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的現(xiàn)有技術(shù)。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、發(fā)明人從抗寒的山葡萄“雙優(yōu)”中克隆出了一種鈣結(jié)合蛋白基因 vamcp1。為了驗證該基因在響應(yīng)低溫脅迫中的功能，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)，將 vamcp1基因轉(zhuǎn)化至模式植物擬南芥和栽培葡萄品種“霞多麗”中；通過觀測轉(zhuǎn)基因植株在低溫脅迫下的表現(xiàn)，評估驗證了 vamcp1基因?qū)μ岣咧参锟沟蜏孛{迫性具有的優(yōu)異效果，從而為開展葡萄抗逆分子育種、提高葡萄產(chǎn)量提供理論基礎(chǔ)和實踐指導(dǎo)。

2、具體而言，本公開提供一種山葡萄鈣結(jié)合蛋白基因 vamcp1，其dna序列如seq?idno.1所示。

3、根據(jù)本公開的第二方面，提供一種上述山葡萄鈣結(jié)合蛋白基因 vamcp1的編碼蛋白，其氨基酸序列如seq?id?no.2所示。

4、根據(jù)本公開的第三方面，提供一種含有上述山葡萄鈣結(jié)合蛋白基因 vamcp1或其片段的表達載體。

5、根據(jù)本公開的第四方面，將所述山葡萄鈣結(jié)合蛋白基因 vamcp1、所述編碼蛋白或所述表達載體應(yīng)用在提高植物抗氧化酶活性和/或脯氨酸含量中。

6、根據(jù)本公開的第五方面，將所述山葡萄鈣結(jié)合蛋白基因 vamcp1、所述編碼蛋白或所述表達載體應(yīng)用在降低植物丙二醛含量和/或?qū)щ娐手小?

7、根據(jù)本公開的第六方面，將所述山葡萄鈣結(jié)合蛋白基因 vamcp1、所述編碼蛋白或所述表達載體應(yīng)用在提高植物低溫脅迫抗性、活性氧清除能力和/或抗氧化能力中。

8、根據(jù)本公開的第七方面，將所述山葡萄鈣結(jié)合蛋白基因 vamcp1、所述編碼蛋白或所述表達載體應(yīng)用在選育/鑒定有關(guān)植物抗低溫脅迫性狀的品種/品系中。

9、根據(jù)本公開的第八方面，將所述山葡萄鈣結(jié)合蛋白基因 vamcp1或所述表達載體應(yīng)用在調(diào)控植物cbf/cor基因表達中。

10、根據(jù)本公開的第九方面，將所述山葡萄鈣結(jié)合蛋白基因 vamcp1或所述表達載體應(yīng)用在抗低溫脅迫的轉(zhuǎn)基因植物構(gòu)建或選育中。

11、在本公開的一些實施例中，使所述山葡萄鈣結(jié)合蛋白基因 vamcp1在植物中過表達。

12、本申請實施例中提供的一個或多個技術(shù)方案，至少具有如下任一技術(shù)效果或優(yōu)點：

13、篩選鑒定出了山葡萄“雙優(yōu)”鈣結(jié)合蛋白基因 vamcp1，該基因完整開放閱讀框序列全長582bp，編碼193個氨基酸，具有三個ef?hand結(jié)構(gòu)域，符合鈣結(jié)合蛋白的高度保守性，其定位于質(zhì)膜和細胞核，具有高水平的轉(zhuǎn)錄自激活活性，在山葡萄響應(yīng)低溫脅迫24?h時達到表達峰值，且在山葡萄的葉片組織中表達量最高。該基因能夠提高滲透調(diào)節(jié)化合物（脯氨酸）含量、提高抗氧化酶（pod、sod、cat）活性、降低丙二醛和相對電導(dǎo)率水平，還能夠調(diào)控cbf和cor基因的表達水平。 vamcp1基因的過表達通過誘導(dǎo)相關(guān)耐寒基因的表達和清除過量的ros來增強植物的抗低溫脅迫性，為葡萄耐寒分子育種提供了基礎(chǔ)。

技術(shù)特征：

1.一種山葡萄鈣結(jié)合蛋白基因vamcp1，其dna序列如seq?id?no.1所示。

2.權(quán)利要求1所述山葡萄鈣結(jié)合蛋白基因vamcp1的編碼蛋白，其氨基酸序列如seq?idno.2所示。

3.含有權(quán)利要求1所述山葡萄鈣結(jié)合蛋白基因vamcp1或其片段的表達載體。

4.權(quán)利要求1所述山葡萄鈣結(jié)合蛋白基因vamcp1、權(quán)利要求2所述編碼蛋白或權(quán)利要求3所述表達載體在提高植物抗氧化酶活性和/或脯氨酸含量中的應(yīng)用。

5.權(quán)利要求1所述山葡萄鈣結(jié)合蛋白基因vamcp1、權(quán)利要求2所述編碼蛋白或權(quán)利要求3所述表達載體在降低植物丙二醛含量和/或?qū)щ娐手械膽?yīng)用。

6.權(quán)利要求1所述山葡萄鈣結(jié)合蛋白基因vamcp1、權(quán)利要求2所述編碼蛋白或權(quán)利要求3所述表達載體在提高植物低溫脅迫抗性、活性氧清除能力和/或抗氧化能力中的應(yīng)用。

7.權(quán)利要求1所述山葡萄鈣結(jié)合蛋白基因vamcp1、權(quán)利要求2所述編碼蛋白或權(quán)利要求3所述表達載體在選育/鑒定有關(guān)植物抗低溫脅迫性狀的品種/品系中的應(yīng)用。

8.權(quán)利要求1所述山葡萄鈣結(jié)合蛋白基因vamcp1或權(quán)利要求3所述表達載體在植物cbf/cor基因表達調(diào)控中的應(yīng)用。

9.權(quán)利要求1所述山葡萄鈣結(jié)合蛋白基因vamcp1或權(quán)利要求3所述表達載體在抗低溫脅迫的轉(zhuǎn)基因植物構(gòu)建或選育中的應(yīng)用。

10.根據(jù)權(quán)利要求4-9中任一項所述的應(yīng)用，其特征在于，使所述山葡萄鈣結(jié)合蛋白基因vamcp1過表達。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明申請公開了一種山葡萄鈣結(jié)合蛋白基因VamCP1、其編碼蛋白、表達載體及應(yīng)用。本申請構(gòu)建了pCAMBIA2300?VamCP1?GFP過表達載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花序侵染法和瞬時轉(zhuǎn)化法分別將其轉(zhuǎn)化至擬南芥與“霞多麗”葡萄中，研究鈣結(jié)合蛋白VamCP1的轉(zhuǎn)基因植株在低溫脅迫下的抗性。結(jié)果表明VamCP1基因能夠提高抗氧化酶活性及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量，減輕植物細胞膜的損壞并減少電解質(zhì)的滲透。該基因通過誘導(dǎo)相關(guān)耐寒基因的表達和清除過量的ROS來增強植物的抗低溫脅迫性能。

技術(shù)研發(fā)人員：張修銘,丁芳,徐偉榮,郝新意,楊始錦
受保護的技術(shù)使用者：寧夏大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/30