本發(fā)明屬于反義寡核苷酸藥物領(lǐng)域，具體涉及一種反義寡核苷酸-正義寡核苷酸偶聯(lián)分子及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、反義寡核苷酸(antisense?oligonucleotides,aso)是一類能夠通過堿基互補配對與靶標rna結(jié)合并調(diào)控rna翻譯的短鏈核酸分子。aso可以利用rna酶h1介導(dǎo)的rna降解、雜交占位rna翻譯抑制以及外顯子跳躍等生物機制對疾病相關(guān)蛋白的表達進行精準的下調(diào)或上調(diào)。這些功能使得aso可以被用于疾病的精準治療，目前已有12款aso藥物被批準用于臨床。這些aso藥物在治療杜氏肌營養(yǎng)不良癥(dmd)、脊髓性肌萎縮癥(sma)、肌萎縮側(cè)索硬化癥(als)以及家族性乳糜微粒血癥綜合征(fcs)等疾病中展現(xiàn)出良好的療效。除此之外，還有大量的研究表明aso在傳染病、癌癥、心血管疾病以及自身免疫性疾病等疾病治療方面具有巨大的應(yīng)用前景(nat.rev.drug?discov.2021,20,427)。

2、然而aso藥物也存在嚴重的毒副作用問題，這是限制aso藥物大規(guī)模臨床應(yīng)用的一個重要因素(nucleic?acid?ther.2023,33,1)。已有多種aso藥物因嚴重的肝毒性問題被迫中止臨床研究(如用于治療前列腺癌的ezn-4176以及用于治療血脂異常的vupanorsen)。即使是已通過臨床審批的aso，在使用過程中也會造成肝損傷(如mipomersen、inotersen、volanesorsen等)。目前已知的造成aso藥物肝毒性的機制可分為兩類：一類是aso的化學(xué)成分引起的細胞蛋白紊亂；另一類是aso結(jié)合非靶標rna造成的rna功能紊亂，即脫靶效應(yīng)。對于第一類機制，已有多項研究表明通過特定化學(xué)修飾可以進行有效的抑制(nat.biotechnol.2019,37,640；nucleic?acids?res.2022,50,7224)。而對于脫靶效應(yīng)，目前并沒有非常有效的方法進行抑制。

3、雖然aso藥物被期望只作用于與其序列完全互補的rna底物，但這在實踐中卻很難實現(xiàn)。實際上，在生理條件下，aso也能夠與非完全互補的rna結(jié)合并影響rna翻譯。todm.woolf等人曾報道即使存在9個堿基的錯配，長度為25個堿基的aso仍能在活體中有效降解rna底物(proc.natl.acad.sci.u.s.a.1992,89,7305)。這種高錯配容忍度使aso藥物很容易影響正常蛋白的表達而產(chǎn)生脫靶毒性。此類aso脫靶毒性能夠引起細胞凋亡和肝毒性(nucleic?acids?res.2016,44,2093；mol.ther.nucleic?acids?2018,10,45)。針對這一問題，寡核苷酸安全工作小組(oligonucleotide?safety?working?group)建議要對aso序列進行計算機模擬篩選，選擇具有更少潛在脫靶位點的序列(nat.biotechnol.2012,30,920)。然而這一做法也難以避免脫靶毒性。一方面，人類基因組數(shù)量龐大，所產(chǎn)生的rna序列種類十分多樣；另一方面，rna酶h對dna/rna雙鏈錯配的容忍度高，使?jié)撛诘拿摪行蛄袛?shù)量也非常多。例如，對于長度為20個堿基的aso，與其序列有5個以內(nèi)堿基錯配的外顯子rna平均數(shù)量超過200個(genes?cells?2018,23,448)。所以開發(fā)抑制aso脫靶毒性的策略十分必要。湯新景課題組發(fā)現(xiàn)在模型反應(yīng)中環(huán)狀aso具有比線性aso更低的脫靶效應(yīng)，但其在細胞或活體層面的脫靶效應(yīng)未見報道(j.med.chem.2021,64,16046)。takao?inoue課題組報道，長度為18個堿基的gapmer?aso比長度為14個堿基的gapmer?aso具有更低的脫靶效應(yīng)，暗示可以通過增長aso長度降低脫靶效應(yīng)(mol.diagn.ther.2022,26,117)。但這一發(fā)現(xiàn)并不能形成一個通用的策略。這主要是由于aso長度增加會造成與rna結(jié)合力上升，對錯配的容忍度以及可能的錯配底物也快速增加，這反而有可能增加脫靶效應(yīng)。因此對于不同的aso，最佳的序列和長度仍需通過大量實驗篩選。最近，tsuyoshi?yamamoto課題組報，在aso鏈上通過堿基互補配對雜交一段肽核酸可以提升aso的特異性(nat.commun.2023,14,7972)。這一研究說明通過在aso鏈上預(yù)先雜交一段有義鏈可以提升aso鏈結(jié)合rna的選擇性。然而，這種分子間雜交的結(jié)構(gòu)并不穩(wěn)定，依賴于使用具有高親和力的特殊核酸鏈且無法保證正義鏈和aso鏈的比例固定，使得這一策略在實際應(yīng)用中有很大的不確定性?？傊?，雖然aso藥物的選擇性問題長期限制其臨床應(yīng)用，但目前仍沒有有效方法解決這一問題。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的一個目的在于提供一種具有新穎結(jié)構(gòu)形式的反義寡核苷酸分子，即反義寡核苷酸-正義寡核苷酸偶聯(lián)(assoc)分子。

2、本發(fā)明的另一個目的在于提供此類分子的制備方法。

3、本發(fā)明的再一個目的在于提供一種藥物組合物，所述組合物包含本發(fā)明的反義寡核苷酸-正義寡核苷酸偶聯(lián)(assoc)分子以及藥學(xué)上可接受的載體。

4、本發(fā)明的又一個目的在于提供一種試劑盒，所述試劑盒包含本發(fā)明的反義寡核苷酸-正義寡核苷酸偶聯(lián)(assoc)分子。

5、本發(fā)明的還一個目的在于提供此類分子在反義核酸藥物領(lǐng)域中的應(yīng)用。

6、一方面，本發(fā)明提供一種以一級結(jié)構(gòu)形式的反義寡核苷酸-正義寡核苷酸偶聯(lián)分子，其包括以下3部分：

7、反義鏈(aso)；

8、正義鏈(so)，所述正義鏈包含能夠與反義鏈的部分或全部核苷酸序列形成反向互補的核苷酸序列；以及

9、用于連接反義鏈的一個末端和正義鏈的一個末端的不含堿基的連接鏈(l)，其結(jié)構(gòu)如下所示：

10、

11、其中，r表示c2-c30直鏈或支鏈亞烴基、或其他不含堿基的二價連接子，x為氧或硫，n為重復(fù)單元的個數(shù)，范圍為1到20的整數(shù)，

12、其中，所述正義鏈和所述反義鏈中，每個核苷酸各自獨立地為修飾或未修飾的核苷酸。

13、另一方面，本發(fā)明提供一種以二級結(jié)構(gòu)形式的反義寡核苷酸-正義寡核苷酸偶聯(lián)分子，其包括以下3部分：

14、反義鏈(aso)；

15、正義鏈(so)，所述正義鏈包含能夠與反義鏈的部分或全部核苷酸序列形成反向互補的核苷酸序列；以及

16、用于連接反義鏈的一個末端和正義鏈的一個末端的不含堿基的連接鏈(l)，其結(jié)構(gòu)如以下所示：

17、

18、其中，r表示c2-c30直鏈或支鏈亞烴基、或其他不含堿基的二價連接子，x為氧或硫，n為重復(fù)單元的個數(shù)，范圍為1到20的整數(shù)，

19、其中，所述正義鏈與所述反義鏈通過反向互補配對形成雜交區(qū)，即反義鏈的堿基被正義鏈完全或部分地通過堿基配對作用覆蓋，并且

20、其中，所述正義鏈和所述反義鏈中，每個核苷酸各自獨立地為修飾或未修飾的核苷酸。

21、需要說明的是，本技術(shù)的反義寡核苷酸-正義寡核苷酸偶聯(lián)分子的二級結(jié)構(gòu)的形成是可逆的，在特定環(huán)境下，例如在生理條件、pbs緩沖液、氯化鈉溶液、tris緩沖液、氯化鎂溶液等條件下，可以形成分子內(nèi)雜交結(jié)構(gòu)；而在尿素溶液或溶液中存在靶標rna時，分子內(nèi)雜交結(jié)構(gòu)被打開。

22、在一些實施方式中，所述其他不含堿基的二價連接子為具有-[(ch2)p-o]q-(ch2)p-所示結(jié)構(gòu)的二價連接子，其中，p為2-6之間的整數(shù)，q為1-20之間的整數(shù)。在具體實例中，p為2、3、4、5、6，在具體實例中，q為1-15、1-12、1-10、1-5或1-3之間的整數(shù)。

23、在具體實施方式中，r為c2-c30、c2-c15、c2-c10、c2-c7或c2-c5直鏈亞烷基，例如為亞乙基、亞丙基、亞丁基、亞戊基等。

24、在一些實施方式中，連接鏈l用于連接反義鏈的3’端與正義鏈的5’端，或用于連接反義鏈的5’端與正義鏈的3’端。

25、在一些實施方式中，在連接鏈l中，n選自3、4、5、6、7、8、9或10，例如n為3。

26、在一些實施方式中，正義鏈的部分堿基與反義鏈的部分堿基互補配對。

27、在一些實施方式中，正義鏈的全部堿基與反義鏈的部分堿基完全互補配對，或者正義鏈的全部堿基與反義鏈的全部堿基完全互補配對。

28、在一些實施方式中，連接鏈l通過硫代磷酸二酯鍵或磷酸二酯鍵連接反義鏈和正義鏈。在一些實施方式中，反義鏈的長度可以為13～23nt，正義鏈長度取決于正義鏈與反義鏈的結(jié)合能。理論上只要正義鏈和反義鏈之間的結(jié)合力足夠強即可，考慮到aso的功能，優(yōu)選地，結(jié)合力與靶標rna和反義鏈之間的結(jié)合力接近時更好。在具體實施方式中，反義鏈和正義鏈互補配對的堿基數(shù)至少為1，例如，反義鏈與正義鏈互補配對的堿基數(shù)為1-20范圍內(nèi)的任意整數(shù)，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20。為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，正義鏈與反義鏈雜交的熔解溫度應(yīng)等于或小于靶標rna鏈與反義鏈雜交的熔解溫度，二者溶解溫度之間的差異應(yīng)小于15℃。

29、在一些實施方式中，反義鏈可為單鏈dna分子；正義鏈可為單鏈dna分子、單鏈rna分子或單鏈dna-rna雜合分子。

30、本發(fā)明中，在所述assoc分子中，每個核苷酸各自獨立地為修飾或未修飾的核苷酸。核苷酸的修飾方式為本領(lǐng)域所熟知的，例如，2’-f、2’-ome、2’-moe、pmo、gna、una、pna、5’-vp、lna(例如，可以參見，nat.rev.drug?discov.2020,19,673；nucleic?acidsres.2023,51,2529，其通過引用的方式并入本文中)。優(yōu)選地，核苷酸的修飾方式為2’-ome、2’-moe、lna。例如，在反義鏈的5’端以5’-vp修飾或使用gna/pna/una作為正義鏈與反義鏈進行堿基互補配對。

31、在一些實施方式中，本發(fā)明的assoc分子可以包含至少一個修飾的核苷酸和/或至少一個鏈間修飾。

32、在一些實施方式中，正義鏈上全部的核苷酸是修飾的核苷酸。

33、在一些實施方式中，反義鏈上全部的核苷酸是修飾的核苷酸。

34、在一些實施方式中，正義鏈和反義鏈基本上全部的核苷酸是修飾的核苷酸。

35、在一些實施方式中，正義鏈的全部核苷酸和反義鏈的全部核苷酸是修飾的核苷酸。

36、在一些實施方式中，所述修飾的核苷酸包括2’-f、2’-ome、2’-moe、pmo、gna、una、pna、5’-vp、lna修飾的核苷酸。

37、在一些實施方式中，所述修飾的核苷酸包括鎖核酸修飾。

38、在一些實施方式中，所述鏈間修飾包括硫代磷酸酯、pmo、pna修飾。

39、在特別優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的assoc分子包括硫代磷酸酯鏈間修飾，優(yōu)選地，本發(fā)明的assoc分子中的所有核苷酸和核苷酸之間以及核苷酸和乙二醇單元之間均包括硫代磷酸酯鏈間修飾。

40、在一些實施方式中，本發(fā)明的assoc分子進一步包含與分子的5’端和/或3’端連接的綴合基團。所述綴合基團可由本領(lǐng)域的技術(shù)人員常規(guī)選擇，以便提供相應(yīng)的靶向、成像、進胞效率、體內(nèi)循環(huán)等功能。

41、在一些實施方式中，所述assoc分子選自以下之一：

42、myd88?assoc-16nt：5’-c*a*c*a*t*t*c*c*t*t*g*c*t*c*t*g*e*e*e*c*a*g*a*g*c*a*a*g*g*a*a*t*g*t*g-3’；

43、myd88?assoc-15nt：5’-c*a*c*a*t*t*c*c*t*t*g*c*t*c*t*g*e*e*e*a*g*a*g*c*a*a*g*g*a*a*t*g*t*g-3’；

44、myd88?assoc-14nt：5’-c*a*c*a*t*t*c*c*t*t*g*c*t*c*t*g*e*e*e*a*g*a*g*c*a*a*g*g*a*a*t*g*t-3’；

45、myd88?assoc-13nt：5’-c*a*c*a*t*t*c*c*t*t*g*c*t*c*t*g*e*e*e*g*a*g*c*a*a*g*g*a*a*t*g*t-3’；

46、myd88?assoc-12nt：5’-c*a*c*a*t*t*c*c*t*t*g*c*t*c*t*g*e*e*e*g*a*g*c*a*a*g*g*a*a*t*g-3’；

47、myd88?assoc-11nt：5’-c*a*c*a*t*t*c*c*t*t*g*c*t*c*t*g*e*e*e*a*g*c*a*a*g*g*a*a*t*g-3’；

48、myd88?assoc-10nt：5’-c*a*c*a*t*t*c*c*t*t*g*c*t*c*t*g*e*e*e*a*g*c*a*a*g*g*a*a*t-3’；

49、apob?assoc-13nt：5’-a*a*t*g*g*c*c*a*g*c*t*t*g*e*e*e*c*a*a*g*c*t*g*g*c*c*a*t*t-3’；

50、apob?assoc-12nt：5’-a*a*t*g*g*c*c*a*g*c*t*t*g*e*e*e*a*a*g*c*t*g*g*c*c*a*t*t-3’；

51、apob?assoc-11nt：5’-a*a*t*g*g*c*c*a*g*c*t*t*g*e*e*e*a*a*g*c*t*g*g*c*c*a*t-3’；

52、apob?assoc-10nt：5’-a*a*t*g*g*c*c*a*g*c*t*t*g*e*e*e*a*g*c*t*g*g*c*c*a*t-3’；

53、apob?assoc-9nt：5’-a*a*t*g*g*c*c*a*g*c*t*t*g*e*e*e*a*g*c*t*g*g*c*c*a-3’；

54、apob?assoc-8nt：5’-a*a*t*g*g*c*c*a*g*c*t*t*g*e*e*e*g*c*t*g*g*c*c*a-3’；

55、apob?assoc-7nt：5’-a*a*t*g*g*c*c*a*g*c*t*t*g*e*e*e*g*c*t*g*g*c*c-3’；

56、apob?assoc-6nt：5’-a*a*t*g*g*c*c*a*g*c*t*t*g*e*e*e*c*t*g*g*c*c-3’；

57、apob?assoc-5nt：5’-a*a*t*g*g*c*c*a*g*c*t*t*g*e*e*e*c*t*g*g*c-3’；

58、其中，加粗字體為鎖核酸堿基，e為乙二醇連接鏈單元，*表示硫代磷酸酯骨架。

59、再一方面，本發(fā)明提供上述assoc分子的制備方法，所述方法包括：

60、在未修飾或修飾的核酸單體及如下結(jié)構(gòu)的連接單體存在下通過核酸自動合成來合成所述assoc分子，

61、

62、其中r的定義如上文所定義。

63、再一方面，本發(fā)明提供一種藥物組合物，所述組合物包含本發(fā)明的反義寡核苷酸-正義寡核苷酸偶聯(lián)(assoc)分子，以及藥學(xué)上可接受的載體。

64、再一方面，本發(fā)明提供一種試劑盒，所述試劑盒包含本發(fā)明的反義寡核苷酸-正義寡核苷酸偶聯(lián)(assoc)分子。

65、另一方面，本發(fā)明提供上述assoc分子在制備反義寡核苷酸藥物中的應(yīng)用。

66、再一方面，本發(fā)明提供一種調(diào)節(jié)細胞中靶基因表達的方法，所述方法包括：使上述assoc分子與細胞接觸的步驟。

67、在具體實施方式中，所述調(diào)節(jié)包括降低靶基因的表達。

68、有益效果

69、本發(fā)明設(shè)計了一類反義寡核苷酸-正義寡核苷酸偶聯(lián)(antisenseoligonucleotide-sense?oligonucleotide?conjugate，assoc)分子，通過構(gòu)建分子內(nèi)雜交結(jié)構(gòu)，從而穩(wěn)定地提高aso對底物序列的選擇性，有效降低其脫靶效應(yīng)。實驗證明這一類分子不但能夠保留高效的靶標rna降解能力，還具有比傳統(tǒng)aso分子顯著更低的脫靶毒性。與文獻報道的對單鏈aso進行化學(xué)修飾的策略相比，本發(fā)明的策略具有更好的效果魯棒性。而與文獻報道的分子間雜交策略(例如，使用肽核酸特殊核酸鏈，其與aso鏈親和力很高)相比，本發(fā)明的分子內(nèi)雜交策略使so鏈結(jié)合aso鏈的能力更強，無需使用親和力高的特殊核酸鏈，所需的so鏈長度更短且使用前無需退火。本發(fā)明可以被應(yīng)用于下一代高效、低毒aso藥物的開發(fā)，在反義寡核苷酸藥物領(lǐng)域具有重要價值。