本發(fā)明屬于生物材料制備領(lǐng)域，具體涉及一種負(fù)載cao2納米粒子的自供氧水凝膠細(xì)胞支架的制備方法及所得產(chǎn)品、應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、隨著生物技術(shù)的發(fā)展，研究者發(fā)現(xiàn)細(xì)胞球體的培養(yǎng)能更好的反應(yīng)組織的特性，由此而產(chǎn)生了血多細(xì)胞球體的培養(yǎng)。最為令人矚目的是類器官球體的成功培育，可以近乎完美的展現(xiàn)了微型組織或者器官的結(jié)構(gòu)。類器官是一種在體外環(huán)境下由多能干細(xì)胞或成體干細(xì)胞分化產(chǎn)生的器官特異性細(xì)胞組成的具備三維結(jié)構(gòu)的球體微器官，擁有高度模擬真實(shí)器官的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，并能部分模擬來(lái)源組織或器官的生理功能。而且，干細(xì)胞在3d環(huán)境中能夠通過(guò)類似于體內(nèi)的方式進(jìn)行細(xì)胞分選和空間限制性譜系分化，?從而自組織為類似體內(nèi)器官或組織的3d結(jié)構(gòu)。借助類器官，研究人員可深入觀察人體組織的變化，更好地理解發(fā)育過(guò)程，并可用于藥物的療效篩選以及病理研究。

2、此外，類器官能為再生醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域提供一種介于動(dòng)物模型和人體臨床實(shí)驗(yàn)的理想生理模型，具有重要的科學(xué)和應(yīng)用價(jià)值。目前，研究者已經(jīng)成功構(gòu)建了對(duì)應(yīng)不同器官的類器官，包括心臟、肝臟、腎臟、腸和大腦等，用于在體外研究不同器官的功能。然而，當(dāng)類器官體積逐漸增大時(shí)，缺氧和缺乏營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)所致的組織壞死是亟需解決的問(wèn)題。然而，現(xiàn)有技術(shù)在氧氣供應(yīng)和支架機(jī)械性能提升方面存在局限，導(dǎo)致類器官培養(yǎng)過(guò)程中出現(xiàn)中心細(xì)胞凋亡的現(xiàn)象。

3、目前，基質(zhì)膠(matrigel)是類器官模型培養(yǎng)最常用的膠體，該基質(zhì)膠成分不明確、批次間差異較大，而且成分復(fù)雜，不易調(diào)控組成成分以研究對(duì)類器官的影響，因此，模式化神經(jīng)管類器官制備的重復(fù)性差，難以再對(duì)該基質(zhì)膠成分進(jìn)行調(diào)節(jié)以提高類器官模式化的效率。同時(shí)，該基質(zhì)膠國(guó)內(nèi)主要通過(guò)進(jìn)口，價(jià)格昂貴、價(jià)格浮動(dòng)大的問(wèn)題。?此外，該基質(zhì)膠來(lái)源于小鼠肉瘤，可能攜帶免疫原、致病基因或病毒，在類器官培養(yǎng)用于藥物篩選和再生醫(yī)學(xué)產(chǎn)生嚴(yán)重影響。這些問(wèn)題極大阻礙了神經(jīng)類器官制備的重復(fù)性及其在發(fā)育機(jī)制、藥物篩選、神經(jīng)疾病模型構(gòu)建和再生醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了解決現(xiàn)有技術(shù)中神經(jīng)類器官模型的制備在生長(zhǎng)過(guò)程中缺氧，依賴鼠源的matrigel基質(zhì)膠的問(wèn)題，本發(fā)明提供一種‘自供氧’的復(fù)合水凝膠的制備方法，該方法制備的水凝膠成分非常明確，其中有效成分為甲基丙烯?；酃劝彼醦-ma、半胱氨酸功能化聚谷氨酸p-cys、甲基丙烯?；痠-型膠原蛋白colma、cao2和光引發(fā)劑lap。

2、本發(fā)明還提供了一種利用上述制備方法制備得到的復(fù)合水凝膠，該‘自供氧’復(fù)合水凝膠可以解決類器官缺氧的問(wèn)題，而且在未來(lái)替代成分不明確、價(jià)格昂貴、攜帶病原體或免疫原的基質(zhì)膠matirgel的潛力，同時(shí)還可以用于其他2維和3維細(xì)胞培養(yǎng)的再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。

3、本發(fā)明進(jìn)一步的提供了上述復(fù)合水凝膠在細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用。

4、本發(fā)明為了實(shí)現(xiàn)上述目的所采用的技術(shù)方案為：

5、本發(fā)明提供了一種自供氧水凝膠細(xì)胞支架的制備方法，包括以下步驟：

6、s1，將甲基丙烯酸甘油酯修飾的γ-聚谷氨酸固體p-ma和半胱氨酸修飾的γ-聚谷氨酸固體p-cys粉末加入pbs緩沖液中，超聲溶解，得到p-mc溶液；

7、s2，?向p-mc溶液中加入甲基丙烯酸苷修飾的i型膠原蛋白colma固體和光引發(fā)劑，室溫下震蕩渦旋至完全溶解，得混合溶液；

8、s3，將混合溶液過(guò)濾，得凝膠溶液，然后加入聚乙二醇（peg）包裹的cao2納米粒子peg-cao2，超聲后得復(fù)合水凝膠溶液；

9、s4，將復(fù)合水凝膠溶液進(jìn)行固化處理，得到水凝膠細(xì)胞支架p-mc-ca。

10、進(jìn)一步的，s1中，所述p-ma和p-cys的質(zhì)量比為1：1；所述p-ma和p-cys的質(zhì)量體積濃度分別為2.5％～5％。

11、進(jìn)一步的，s1中，所述超聲的條件為：45赫兆茲，25℃下超聲10分鐘。

12、進(jìn)一步的，s2中，混合溶液中，colma的濃度范圍為5mg/ml～20mg/ml；所述光引發(fā)劑為lap或i2959；所述光引發(fā)劑在混合溶液中的質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為0.1％。

13、進(jìn)一步的，s3中，所述peg-cao2在混合溶液中的濃度為200μg/ml～800μg/ml。

14、進(jìn)一步的，s3中，過(guò)濾采用0.22μm的無(wú)菌膜進(jìn)行。

15、進(jìn)一步的，s4中，所述固化處理采用波長(zhǎng)為365nm紫外燈照射20s～60s。

16、本發(fā)明還提供了一種利用上述制備方法制備得到的水凝膠細(xì)胞支架p-mc-ca。

17、本發(fā)明還提供了上述水凝膠細(xì)胞支架p-mc-ca在細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用

18、本發(fā)明還提供了上述水凝膠細(xì)胞支架p-mc-ca在神經(jīng)細(xì)胞球三維培養(yǎng)中的應(yīng)用。

19、上述方案的進(jìn)一步改進(jìn)，所述甲基丙烯?；痠-型膠原蛋白colma來(lái)源于牛跟腱，濃度范圍為3mg/ml～10mg/ml。

20、上述方案的進(jìn)一步改進(jìn)，所述步驟s1具體為將70mg甲基丙烯酰化聚谷氨酸粉末和70mg半胱氨酸修飾的聚谷氨酸加入2ml的磷酸緩沖鹽溶液，攪拌溶解，得到p-mc溶液。然后，在p-mc溶液中加入10mg的colma和100微升濃度為2mg/ml的peg-cao2納米粒子，并渦旋混合均勻，得到復(fù)合水凝膠溶液。

21、本發(fā)明將制備的‘自供氧’復(fù)合水凝膠用于培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞球，具體采用以下步驟：

22、（1）復(fù)合水凝膠的制備：稱取70mg?p-ma和70mg?p-cys溶解于2ml?pbs緩沖溶液中溶解，隨后依次將10mg甲基丙烯?；痠-型膠原蛋白colma和2mg光引發(fā)劑lap加入到上述混合溶液中，室溫下震蕩渦旋，直至固體完全溶解形成透明的液體。然后，利用0.22?μm無(wú)菌膜對(duì)復(fù)合水凝膠溶液進(jìn)行過(guò)濾，得到無(wú)菌的凝膠溶液。隨后加入紫外滅菌（20min）的peg-cao2納米粒子固體，并進(jìn)行震蕩使之均勻分散得到‘自供氧’復(fù)合水凝膠溶液p-mc-ca。

23、（2）多能神經(jīng)干細(xì)胞球包埋：將復(fù)合水凝膠溶液進(jìn)行震蕩渦旋，分別將不同濃度凝膠溶液移取300μl到不同的24孔板的孔中，搖晃使之完全覆蓋孔板底部，然后用365nm紫外燈照射30s固化。然后再分別將300μl不同濃度凝膠溶液加到裝有神經(jīng)球的ep管中，重懸得到水凝膠細(xì)胞溶液中，并加到對(duì)應(yīng)鋪有不同濃度的凝膠孔中，并用紫外燈照射30s固化，并加入1ml培養(yǎng)基進(jìn)行三維培養(yǎng)，每2天換一次培養(yǎng)基。

24、（3）將制備出來(lái)的p-mc-ca復(fù)合水凝膠接入神經(jīng)干細(xì)胞三維培養(yǎng)，并于第1天、第3天和第6天觀察神經(jīng)球生長(zhǎng)狀態(tài)，初步確定適合神經(jīng)干細(xì)胞球生長(zhǎng)的凝膠的最佳濃度。其次在神經(jīng)球分化的第3天和第6天分別觀察神經(jīng)管類器官的結(jié)構(gòu)，并檢測(cè)神經(jīng)管類器官相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)情況以及類器官的結(jié)構(gòu)，以確定適合神經(jīng)球分化長(zhǎng)出神經(jīng)管的最佳凝膠濃度，并進(jìn)行拍照觀察出芽狀態(tài)。繼續(xù)培養(yǎng)一周后，進(jìn)行免疫熒光染色分析分化形成的細(xì)胞種類。

25、本發(fā)明的有益效果在于：

26、（1）本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有細(xì)胞球或類器官球在3d培養(yǎng)過(guò)程中內(nèi)部缺氧和來(lái)源于老鼠肉瘤的基質(zhì)膠(matrigel)存在的成分不明確等問(wèn)題，在此提供一種成分明確的‘自供氧’復(fù)合凝膠用于代替matrigel進(jìn)行細(xì)胞球的3d培養(yǎng)，本發(fā)明制備的復(fù)合水凝膠具有優(yōu)異的生物相容性，可以解決類器官缺氧的問(wèn)題，而且在未來(lái)替代成分不明確、價(jià)格昂貴、攜帶病原體或免疫原的基質(zhì)膠matirgel的潛力，同時(shí)還可以用于其他2維和3維細(xì)胞培養(yǎng)的再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域；

27、（2）本發(fā)明提供的方法不僅可以實(shí)現(xiàn)供氧功能，還可以通過(guò)細(xì)胞分泌的還原酶降解動(dòng)態(tài)共價(jià)鍵用于調(diào)節(jié)凝膠的力學(xué)性能該自供氧水凝膠材料有望應(yīng)用于其他細(xì)胞球或類器官球3d培養(yǎng)。