本發(fā)明涉及一種檢測高血壓個體化用藥基因位點多態(tài)性的引物組、試劑盒和方法。

背景技術(shù)：

1、高血壓是最常見的慢性非感染性疾病，會引起心、腦、腎等臟器的并發(fā)癥，是心血管病最重要的危險因素。據(jù)《2018中國心血管病報告》顯示，我國心血管病死亡人數(shù)占居民疾病整體死亡構(gòu)成的40％以上，已位居首位，高于腫瘤。研究表明，高血壓是很多心血管疾病的重要危險因素，例如，79.8％的腦卒中與高血壓有關(guān)，控制血壓在正常水平可減少40-50％腦卒中的發(fā)生。因此，控制高血壓可有效降低心血管疾病死亡率。

2、高血壓的發(fā)病機制復(fù)雜，除了家族遺傳因素，肥胖、高鹽飲食、缺乏運動、抽煙、酗酒、精神壓力等都與之有關(guān)。此外，目前高血壓用藥種類繁多，而人群藥物代謝基因也具有多態(tài)性，同一種藥物的敏感性和代謝速度各有不同?；颊邆€體差異會造成藥物代謝能力不同，同一藥物不同患者的用藥反應(yīng)也有很大差別。因此，目前高血壓控制率如此低，除了患者服藥依從性差等原因，未根據(jù)基因多態(tài)性進行個性化用藥也是重要影響因素。

3、高血壓可選藥物眾多，各個藥物的代謝和轉(zhuǎn)運過程又由多個不同的基因調(diào)控，因而高血壓個體化用藥基因的檢測涉及位點較多，普通的檢測方法比如熒光pcr、高通量測序等技術(shù)都各有短板。其中熒光pcr單次檢測位點數(shù)較少，高通量測序技術(shù)雖然通量高但是單樣本檢測成本也高。隨著分子檢測技術(shù)的不斷發(fā)展，一批次檢測多位點/多藥物的個體化用藥檢測項目已成為主流檢測趨勢。因此，有必要開發(fā)高通量，低成本，同時兼?zhèn)涓邷?zhǔn)確性的個體化用藥基因位點多態(tài)性的檢測方案。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于，提供一種檢測高血壓個體化用藥基因位點多態(tài)性的引物組和試劑盒，本發(fā)明的高血壓個體化用藥基因檢測試劑盒使用核酸質(zhì)譜技術(shù)，可實現(xiàn)一次對藥物敏感性及代謝能力相關(guān)的多個snp位點進行檢測，從而指導(dǎo)患者進行個體化用藥，提升高血壓的控制率。

2、本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

3、一種檢測高血壓個體化用藥基因位點多態(tài)性的引物組，包括多重pcr擴增引物，所述多重pcr擴增引物的序列如seq?no1～seq?no30所示，用于擴增15個高血壓疾病用藥相關(guān)基因位點：

4、

5、所述引物組還包括用于單堿基延伸反應(yīng)的uep引物，序列如seq?no31～seq?no45所示：

6、

7、進一步，本發(fā)明還提供一種檢測高血壓個體化用藥基因位點多態(tài)性的試劑盒，所述試劑盒包括上述多重pcr擴增引物和uep引物。

8、進一步，所述試劑盒包括多重pcr擴增反應(yīng)體系、蝦堿性磷酸酶(sap)純化反應(yīng)體系、單堿基延伸反應(yīng)體系。

9、所述多重pcr擴增反應(yīng)液包括多重pcr擴增引物、pcr緩沖液、脫氧酸核苷三磷混合物(dntp)、dna聚合酶，mgcl2。

10、所述sap純化反應(yīng)體系包括sap酶和sap緩沖液。

11、sap酶和sap緩沖液可購自agena公司。

12、所述單堿基延伸反應(yīng)體系包括uep引物、iplex?buffer?plus、iplex?terminationmix和iplex?pro?enzyme。

13、所述iplex?buffer?plus、iplex?termination?mix和iplex?pro?enzyme購自agena公司。

14、本發(fā)明還提供利用所述試劑盒，在檢測高血壓個體化用藥基因位點多態(tài)性中的應(yīng)用。

15、所述高血壓藥物包括23種：阿替洛爾、賴諾普利、坎地沙坦、呋塞米、阿米洛利、依那普利、維拉帕米、貝那普利、尼群地平、螺內(nèi)酯、替米沙坦、氯沙坦、比索洛爾、培哚普利、氨氯地平、布美他尼、美托洛爾、葉酸、卡托普利、厄貝沙坦、硝苯地平、氫氯噻嗪、卡維地洛。

16、進一步，所述基因包括14種：adrb2、cacna1c、acy3、ace、cyp2c9、agtr1、cyp3a5、add1、nppa-as1、cyp4a11、gnb3、cyp2d6、adrb1、mthfr。

17、所述基因位點15種，包括rs1042713、rs5063、rs1051375、rs1126742、rs2514036、rs5443、rs1799752、rs1065852、rs1057910、rs766507177、rs5186、rs1801253、rs776746、rs1801133、rs4961。

18、本發(fā)明還提供利用所述試劑盒，檢測高血壓個體化用藥基因位點多態(tài)性的方法，所述方法包括以下步驟：

19、(1)多重pcr擴增反應(yīng)：

20、提取樣本的模板dna，配制多重pcr擴增反應(yīng)體系，進行多重pcr擴增反應(yīng)，得到多重pcr擴增產(chǎn)物；

21、多重pcr擴增反應(yīng)體系為5μl反應(yīng)體系，包括以下組分：

22、超純水0.8μl、10xpcr?buffer?0.5μl、25mm?mgcl2?0.4μl、dntp?0.1μl、p?mix1μl、pcr?enzyme?0.2μl，dna模板2μl；

23、所述p?mix為seq?no1至seq?no30的引物序列，每條引物的濃度為0.5μm；

24、多重pcr擴增反應(yīng)的反應(yīng)條件為95℃2分鐘；95℃30秒，56℃30秒，72℃60秒，45個循環(huán)；然后72度5分鐘。

25、(2)蝦堿性磷酸酶(sap)純化反應(yīng)：

26、將多重pcr擴增產(chǎn)物用sap酶純化，sap純化反應(yīng)體系包括以下組分：超純水1.53μl、sap?buffer?0.17μl、sap?enzyme?0.3μl、擴增產(chǎn)物5μl，總計7μl反應(yīng)體系；反應(yīng)后得到純化產(chǎn)物；

27、純化反應(yīng)的反應(yīng)條件為37度40分鐘，80度5分鐘。

28、(3)單堿基延伸反應(yīng)

29、步驟(2)的純化產(chǎn)物進行單堿基延伸反應(yīng)，單堿基延伸反應(yīng)體系包括以下組分：超純水0.62μl、iplex?buffer?plus?0.2μl、iplex?termination?mix?0.2μl、uep?mix?0.94μl、iplex?pro?enzyme?0.04μl、純化產(chǎn)物7μl，總計9μl反應(yīng)體系；反應(yīng)得到延伸產(chǎn)物；

30、uep?mix為seq?no31至seq?no45的引物序列，每條引物的濃度為0.7μm；

31、所述單堿基延伸反應(yīng)的反應(yīng)程序為94℃30s,{94℃5s,(41℃5s,80℃5s)5個內(nèi)部循環(huán)}39個外部循環(huán)，72℃3min。

32、(4)核酸質(zhì)譜檢測分析

33、延伸產(chǎn)物中加入35μl去離子水，然后用核酸質(zhì)譜儀進行檢測，得到高血壓個體化用藥基因位點多態(tài)性。

34、所述核酸質(zhì)譜儀一般為maldi-tof?ms基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時間質(zhì)譜儀。

35、核酸質(zhì)譜儀檢測器將電信號轉(zhuǎn)化為可視的峰圖，每一種基因型有特有的分子量，軟件自動分析對應(yīng)的堿基類型，從而得到最后的基因分型結(jié)果。

36、本發(fā)明先通過自主設(shè)計的引物進行pcr擴增，之后sap純化，最后再利用自主設(shè)計的探針進行目標(biāo)堿基的延伸反應(yīng)。獲得的延伸產(chǎn)物進行核酸質(zhì)譜檢測，最終得到相關(guān)基因型信息。

37、本發(fā)明的高血壓個體化用藥基因位點多態(tài)性檢測試劑盒具有高準(zhǔn)確性、高通量、低成本、短周期的優(yōu)點，相對于常規(guī)的sanger測序、焦磷酸測序以及實時熒光pcr技術(shù)，具備了顯著的高通量優(yōu)勢，可以一批次檢測96個樣本(96孔板)或384個樣本(384孔板)，每個樣本可測14個基因15個目標(biāo)位點；而相比二代測序ngs，本發(fā)明一批次樣本只需8-10小時即可完成，用時短，提高了檢測效率，同時也兼?zhèn)涓佑H民的價格。本試劑盒可以檢測15個高血壓個體化用藥相關(guān)基因位點，涉及23種藥物，靈敏度高，只需微量基因組dna即可得到檢測結(jié)果，檢測結(jié)果可指導(dǎo)臨床選擇適當(dāng)?shù)乃幬?，使用適當(dāng)?shù)挠盟巹┝?，使患者既能獲得最佳治療效果，又能減少藥物不良反應(yīng)，真正達到精準(zhǔn)用藥的目的。