本發(fā)明屬于生物，具體涉及一種腎小球系膜區(qū)病理性iga沉積小鼠模型的構(gòu)建方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、igan動(dòng)物模型主要分為免疫誘導(dǎo)型、繼發(fā)病變型和自發(fā)病變型。免疫誘導(dǎo)的動(dòng)物模型主要可以分為三類：由免疫復(fù)合物引起的模型、由病原微生物誘導(dǎo)的模型，以及由異種蛋白激發(fā)的模型。ccl4混合物誘導(dǎo)的igan小鼠為異種蛋白誘導(dǎo)型。自發(fā)病變型主要為日本ddy小鼠品系在igan發(fā)生、發(fā)展等方面與人類igan相似，特別是后續(xù)開(kāi)發(fā)的higa小鼠、gddy小鼠在表型和病理方面與人類igan更為接近。higa小鼠表現(xiàn)出穩(wěn)定表達(dá)的高水平iga，然而，血清中iga的水平與腎小球損傷的程度以及腎病的發(fā)生率并沒(méi)有明顯的相關(guān)性。相比之下，gddy小鼠在出生約8周時(shí)就可以檢測(cè)出有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的蛋白尿，而在24周時(shí)則會(huì)出現(xiàn)明顯的血肌酐水平上升，并伴有嚴(yán)重的腎小球損害，系膜細(xì)胞增生、系膜基質(zhì)增殖以及腎小管間質(zhì)損傷。腎小球系膜區(qū)出現(xiàn)明顯的iga、igg和c3共同沉積。目前該小鼠有專利保護(hù)，國(guó)內(nèi)無(wú)ddy小鼠品系。繼發(fā)病變型由于模型動(dòng)物致死率高，當(dāng)前很少應(yīng)用。

2、目前國(guó)內(nèi)學(xué)者研究igan采用的動(dòng)物模型為傳統(tǒng)ccl4小鼠模型，建立這一動(dòng)物模型的主要原理基于以下理解：通過(guò)口服bsa(牛血清白蛋白)來(lái)促使小鼠體內(nèi)生成iga增加；lps(脂多糖)作為免疫佐劑，能夠破壞小鼠肝臟的內(nèi)皮網(wǎng)狀系統(tǒng)，從而減少機(jī)體對(duì)iga的清除；而ccl4(四氯化碳)混合物主要用于誘導(dǎo)肝硬化，以此進(jìn)一步降低對(duì)iga的清除能力。不過(guò)，對(duì)于構(gòu)建該動(dòng)物模型所需的時(shí)間長(zhǎng)度以及bsa等的具體用量方面，目前仍存在一定的爭(zhēng)議，導(dǎo)致所構(gòu)建模型的嚴(yán)重程度不一致。

3、tank結(jié)合激酶1(tbk1)通常被視為先天免疫反應(yīng)的一個(gè)激活因子，在固有免疫信號(hào)傳導(dǎo)途徑中充當(dāng)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)蛋白，對(duì)維持機(jī)體的免疫平衡至關(guān)重要。nf-κb是一個(gè)調(diào)節(jié)dna轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞因子產(chǎn)生和細(xì)胞存活的蛋白質(zhì)家族。它由五個(gè)成員組成：rela(p65)、relb、c-rel、p50/p105(nf-κb1)和p52/p100(nf-κb2)。這些蛋白可形成同源二聚體或異源二聚體，并與特定的dna序列(稱為κb位點(diǎn))結(jié)合，啟動(dòng)或調(diào)節(jié)目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄。nf-κb參與多種細(xì)胞反應(yīng)，包括但不限于炎癥、免疫反應(yīng)、細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞凋亡和應(yīng)激反應(yīng)。nf-κb通常通過(guò)與稱為iκb(κb抑制因子)的抑制蛋白結(jié)合而在細(xì)胞質(zhì)中保持非活性狀態(tài)。nf-κb的活化是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，可由細(xì)胞因子、自由基、紫外線輻射、細(xì)菌和病毒感染等多種刺激啟動(dòng)。nf-κb主要有兩種激活途徑：典型途徑和非典型途徑。非典型途徑也稱為非經(jīng)典途徑，主要由某些細(xì)胞因子(如cd40l或baff)激活。這種途徑依賴于nf-κb誘導(dǎo)激酶(nik)和ikkα的激活，從而導(dǎo)致p100部分降解為p52。這種途徑比典型途徑更慢、更持久，在b細(xì)胞成熟和淋巴器官形成等過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。非經(jīng)典途徑中的上游激酶是nf-κb誘導(dǎo)激酶(nik)。tbk1能夠促進(jìn)nik在ser862位點(diǎn)的磷酸化，而這一位點(diǎn)恰好位于nik的降解區(qū)域，磷酸化事件增強(qiáng)了nik的降解，從而阻止了非經(jīng)典nf-κb信號(hào)通路的激活。既往的研究已經(jīng)證明經(jīng)典nf-kb通路調(diào)節(jié)iga類別轉(zhuǎn)換，在調(diào)節(jié)iga成中發(fā)揮重要作。jin等免疫學(xué)團(tuán)隊(duì)將tbk1確定為經(jīng)典nf-kb通路的關(guān)鍵負(fù)調(diào)節(jié)因。tbk1基因缺失會(huì)導(dǎo)致血清iga水平異常升高。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明提供了一種腎小球系膜區(qū)病理性iga沉積小鼠模型的構(gòu)建方法及應(yīng)用，本發(fā)明中的tbk1-bko小鼠在生長(zhǎng)發(fā)育和存活方面較野生型小鼠無(wú)差異。tbk1-bko小鼠模型具有較高的穩(wěn)定性，能獲得基因型完全一致的動(dòng)物模型，同時(shí)其表型與人類iga腎病更加接近。

2、本發(fā)明的技術(shù)方案如下所述：

3、一種腎小球系膜區(qū)病理性iga沉積小鼠模型的構(gòu)建方法，包括如下步驟：

4、步驟1、grna設(shè)計(jì)

5、步驟2、donor載體構(gòu)建、凝膠回收、連接與轉(zhuǎn)化、菌落篩選、陽(yáng)性克隆質(zhì)粒提取、酶切鑒定和測(cè)序、注射用質(zhì)粒制備；

6、步驟3、grna合成

7、步驟4、rnp復(fù)合物制備：

8、步驟5、受精卵準(zhǔn)備：

9、步驟6、原核顯微注射：

10、步驟7、代孕鼠準(zhǔn)備及胚胎移植：

11、步驟8、f0代小鼠鑒定：

12、步驟9、轉(zhuǎn)基因小鼠繁殖與建系。

13、在上述技術(shù)方案中，在步驟1中，通過(guò)訪問(wèn)http://crispor.tefor.net/網(wǎng)站，設(shè)計(jì)grna，并選擇評(píng)分較高的序列。

14、在上述技術(shù)方案中，在步驟2中，donor載體構(gòu)建：片段擴(kuò)增(5’arm、cko、3’arm)：使用諾唯贊公司的p515高保真酶，按照50μl體積進(jìn)行pcr擴(kuò)增，循環(huán)次數(shù)設(shè)定為30次；凝膠回收：將pcr產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析，利用qiagen膠回收試劑盒(編號(hào)：28706)回收目標(biāo)片段；連接與轉(zhuǎn)化：使用諾唯贊的c115連接酶連接回收片段，并借助takara?stellar感受態(tài)細(xì)胞將連接產(chǎn)物導(dǎo)入大腸桿菌，在37℃條件下過(guò)夜培養(yǎng)；菌落篩選：挑選16個(gè)生長(zhǎng)良好的菌落，使用諾唯贊的p222?taq酶進(jìn)行25μl體積的pcr擴(kuò)增，確認(rèn)插入片段正確的菌落，接種至4ml?lb液體培養(yǎng)基進(jìn)行小規(guī)模發(fā)酵；陽(yáng)性克隆質(zhì)粒提?。翰捎脡A裂解法提取質(zhì)粒dna；酶切鑒定和測(cè)序：選用合適的neb限制性內(nèi)切酶，按20μl體系進(jìn)行酶切鑒定，確認(rèn)正確的質(zhì)粒送測(cè)序；注射用質(zhì)粒制備：對(duì)測(cè)序正確的克隆進(jìn)行大規(guī)模發(fā)酵(22.5ml?lb培養(yǎng)基)，并使用qiagen質(zhì)粒提取試劑盒(編號(hào)：27106)提取質(zhì)粒，供注射使用。

15、在上述技術(shù)方案中，在步驟3中，crrna(crispr?rna)由idt公司合成；tracrrna(trans-activating?crrna)由金斯瑞生物科技股份有限公司提供；crrna和tracrrna結(jié)合形成grna。

16、在上述技術(shù)方案中，在步驟4中，管1溶液：將0.8μl?100pmol/μl?crrna和0.6μl100pmol/μl?tracrrna溶解于5.2μl?rnase-free水中，混勻后于室溫孵育5分鐘，再加入0.2μl?neb的cas9蛋白(編號(hào)：m0646m)，室溫孵育10分鐘后即得管1溶液；管2溶液：將donor質(zhì)粒稀釋至15ng/μl；將管1溶液與管2溶液混合，制備成rnp注射復(fù)合物。

17、在上述技術(shù)方案中，在步驟5中，選擇3-4周齡的c57bl/6雌鼠，分別注射孕馬血清(pmsg)與絨毛膜促性腺激素(hcg)，兩次注射間隔46-48小時(shí)；hcg注射后將雌鼠與成年雄鼠交配；次日，對(duì)雌鼠實(shí)施安樂(lè)死，并從輸卵管收集受精卵，置于37℃、5％?co2的培養(yǎng)箱中備用。

18、在上述技術(shù)方案中，在步驟6中，制備顯微注射針和固定針；將rnp復(fù)合物與質(zhì)粒dna混合，稀釋后裝入顯微注射針；在倒置顯微鏡下(放大倍數(shù)200-400倍)，將外源基因注入受精卵細(xì)胞核；注射后的受精卵移至m16培養(yǎng)基中，繼續(xù)在37℃、5％?co2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)0.5-1小時(shí)，隨后移植或培養(yǎng)至2細(xì)胞階段再移植。

19、在上述技術(shù)方案中，在步驟7中，使用適齡母鼠與結(jié)扎雄鼠交配，制造假孕狀態(tài)；將攜帶外源基因的受精卵移植至假孕母鼠輸卵管；移植后將母鼠安置在保溫環(huán)境下直至恢復(fù)；手術(shù)后19-20天，母鼠產(chǎn)仔；小鼠出生一周后進(jìn)行標(biāo)記并初步鑒定。

20、在上述技術(shù)方案中，在步驟8中，收集1-2周齡幼鼠組織樣本；提取基因組dna并進(jìn)行pcr擴(kuò)增及電泳檢測(cè)；篩選整合外源基因的后代；確認(rèn)整合的個(gè)體(即首建鼠)，并進(jìn)行后續(xù)繁殖和表型分析。

21、在上述技術(shù)方案中，在步驟9中，將攜帶外源基因的小鼠與野生型小鼠交配繁殖；對(duì)f1代小鼠進(jìn)行基因型鑒定；f1代陽(yáng)性小鼠可用于實(shí)驗(yàn)及進(jìn)一步繁殖；為獲得純合子，可讓f1代陽(yáng)性個(gè)體雜交產(chǎn)生f2代，其中25％可能為純合子；確認(rèn)表達(dá)目的基因的小鼠并建立品系，記錄繁殖情況和譜系信息。

22、有益效果

23、iga腎病是發(fā)達(dá)國(guó)家特發(fā)性腎小球腎炎最常見(jiàn)的原因。早期認(rèn)為igan的病程為良性，但隨著臨床觀察研究發(fā)現(xiàn)，至少20％以上的患者有進(jìn)展至慢性腎臟病5期的風(fēng)險(xiǎn)。igan的發(fā)生是多因素共同作用的結(jié)果，其進(jìn)展和預(yù)后與患者血壓、年齡、尿蛋白水平、血尿嚴(yán)重程度、種族、腎臟病理改變、就診時(shí)的egfr以及是否接受正常治療相關(guān)。動(dòng)物模型的建立在探究其發(fā)病機(jī)制方面具有十分重要的意義。本研究部分2月齡、3月齡的tbk1-bko小鼠腎小球系膜區(qū)可以觀察到有輕微的iga沉積，5月齡、8月齡、12月齡研究小鼠腎小球系膜區(qū)均可見(jiàn)團(tuán)塊狀iga、igg沉積。同wt小鼠和傳統(tǒng)ccl4小鼠相對(duì)照，2月齡時(shí)tbk1-bko小鼠部分腎小球開(kāi)始出現(xiàn)系膜細(xì)胞增生、系膜基質(zhì)增多，并且隨著月齡增長(zhǎng)，腎小球系膜區(qū)的改變逐漸加重。本研究小鼠腎功能損害晚于腎臟病理改變，8月齡開(kāi)始血肌酐、尿白蛋白肌酐比和wt小鼠差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。tbk1-bko小鼠在生長(zhǎng)發(fā)育和存活方面較野生型小鼠無(wú)差異。tbk1-bko小鼠模型具有穩(wěn)定性高，能獲得基因型完全一致的動(dòng)物模型，同時(shí)其表型與人類iga腎病更加接近。本發(fā)明方法從模擬igan的發(fā)病機(jī)制出發(fā)，為篩選能夠分解系膜區(qū)免疫復(fù)合物沉積的藥物、探究早期iga清除機(jī)制，以及采用生物學(xué)方法清除異常沉積的iga從而達(dá)到治療iga腎病的研究提供一種簡(jiǎn)單易行的動(dòng)物模型。