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一種腎小球系膜區(qū)病理性IgA沉積小鼠模型的構建方法及應用與流程

文檔序號:40537641發(fā)布日期:2025-01-03 10:56閱讀:來源:國知局

技術特征:

1.一種腎小球系膜區(qū)病理性iga沉積小鼠模型的構建方法,其特征在于,包括如下步驟:

2.根據權利要求1所述的一種腎小球系膜區(qū)病理性iga沉積小鼠模型的構建方法,其特征在于:在步驟2中,donor載體構建:片段擴增使用諾唯贊公司的p515高保真酶,按照50μl體積進行pcr擴增,循環(huán)次數設定為30次;凝膠回收:將pcr產物進行電泳分析,利用qiagen膠回收試劑盒回收目標片段;連接與轉化:使用諾唯贊的c115連接酶連接回收片段,并借助takara?stellar感受態(tài)細胞將連接產物導入大腸桿菌,在37℃條件下過夜培養(yǎng);菌落篩選:挑選16個生長良好的菌落,使用諾唯贊的p222?taq酶進行25μl體積的pcr擴增,確認插入片段正確的菌落,接種至4ml?lb液體培養(yǎng)基進行小規(guī)模發(fā)酵;陽性克隆質粒提?。翰捎脡A裂解法提取質粒dna;酶切鑒定和測序:選用合適的neb限制性內切酶,按20μl體系進行酶切鑒定,確認正確的質粒送測序;注射用質粒制備:對測序正確的克隆進行大規(guī)模發(fā)酵,并使用qiagen質粒提取試劑盒提取質粒,供注射使用。

3.根據權利要求1所述的一種腎小球系膜區(qū)病理性iga沉積小鼠模型的構建方法,其特征在于:在步驟3中,crrna由idt公司合成;tracrrna由金斯瑞生物科技股份有限公司提供;crrna和tracrrna結合形成grna。

4.根據權利要求1所述的一種腎小球系膜區(qū)病理性iga沉積小鼠模型的構建方法,其特征在于:在步驟4中,管1溶液:將0.8μl?100pmol/μl?crrna和0.6μl?100pmol/μl?tracrrna溶解于5.2μl?rnase-free水中,混勻后于室溫孵育5分鐘,再加入0.2μl?neb的cas9蛋白,室溫孵育10分鐘后即得管1溶液;管2溶液:將donor質粒稀釋至15ng/μl;將管1溶液與管2溶液混合,制備成rnp注射復合物。

5.根據權利要求1所述的一種腎小球系膜區(qū)病理性iga沉積小鼠模型的構建方法,其特征在于:在步驟5中,選擇3-4周齡的c57bl/6雌鼠,分別注射孕馬血清與絨毛膜促性腺激素,兩次注射間隔46-48小時;hcg注射后將雌鼠與成年雄鼠交配;次日,對雌鼠實施安樂死,并從輸卵管收集受精卵,置于37℃、5%co2的培養(yǎng)箱中備用。

6.根據權利要求1所述的一種腎小球系膜區(qū)病理性iga沉積小鼠模型的構建方法,其特征在于:在步驟6中,制備顯微注射針和固定針;將rnp復合物與質粒dna混合,稀釋后裝入顯微注射針;在倒置顯微鏡下(放大倍數200-400倍),將外源基因注入受精卵細胞核;注射后的受精卵移至m16培養(yǎng)基中,繼續(xù)在37℃、5%co2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)0.5-1小時,隨后移植或培養(yǎng)至2細胞階段再移植。

7.根據權利要求1所述的一種腎小球系膜區(qū)病理性iga沉積小鼠模型的構建方法,其特征在于:在步驟7中,使用適齡母鼠與結扎雄鼠交配,制造假孕狀態(tài);將攜帶外源基因的受精卵移植至假孕母鼠輸卵管;移植后將母鼠安置在保溫環(huán)境下直至恢復;手術后19-20天,母鼠產仔;小鼠出生一周后進行標記并初步鑒定。

8.根據權利要求1所述的一種腎小球系膜區(qū)病理性iga沉積小鼠模型的構建方法,其特征在于:在步驟8中,收集1-2周齡幼鼠組織樣本;提取基因組dna并進行pcr擴增及電泳檢測;篩選整合外源基因的后代;確認整合的個體,并進行后續(xù)繁殖和表型分析。

9.一種權利要求1-8所述的方法制備的動物模型。

10.權利要求9所述的動物模型在篩選iga腎病藥物中的應用。


技術總結
本發(fā)明公開了一種腎小球系膜區(qū)病理性IgA沉積小鼠模型的構建方法及應用,屬于生物技術領域,本發(fā)明包括如下步驟:步驟1、gRNA設計;步驟2、Donor載體構建、凝膠回收、連接與轉化、菌落篩選、陽性克隆質粒提取、酶切鑒定和測序、注射用質粒制備;步驟3、gRNA合成;步驟4、RNP復合物制備;步驟5、受精卵準備;步驟6、原核顯微注射;步驟7、代孕鼠準備及胚胎移植;步驟8、F0代小鼠鑒定;步驟9、轉基因小鼠繁殖與建系。本發(fā)明方法從模擬IgAN的發(fā)病機制出發(fā),為篩選能夠分解系膜區(qū)免疫復合物沉積的藥物、探究早期IgA清除機制,以及采用生物學方法清除異常沉積的IgA從而達到治療IgA腎病的研究提供一種簡單易行的動物模型。

技術研發(fā)人員:朱伯成,葛國軍,王星霞,朱曉峰,管曉陽
受保護的技術使用者:中國人民解放軍聯勤保障部隊第九〇三醫(yī)院
技術研發(fā)日:
技術公布日:2025/1/2
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