本發(fā)明屬于生物，具體涉及一種基于核酸飛行質(zhì)譜法檢測p53基因突變的方法、引物、試劑盒及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、人類的p53基因位于17號(hào)染色體短臂17p13.1，長度為20kb，由11個(gè)外顯子和10個(gè)內(nèi)含子組成。p53基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為2.5kb?mrna，編碼393個(gè)氨基酸的蛋白，分子量約53kda。p53基因是人類癌癥中突變最頻繁的基因(>50％)，p53突變會(huì)導(dǎo)致癌癥發(fā)展的風(fēng)險(xiǎn)大大增加。p53通過多種機(jī)制在細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡和基因組穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)或進(jìn)展中發(fā)揮作用，野生型的p53可以通過誘導(dǎo)各種形式的細(xì)胞死亡或衰老來促進(jìn)新生癌細(xì)胞的清除，這些反應(yīng)有助于限制腫瘤發(fā)展的能力。p53還可以在細(xì)胞損傷或應(yīng)激時(shí)誘導(dǎo)可逆的細(xì)胞周期停滯，一旦損傷或應(yīng)激得到解決，細(xì)胞就可以恢復(fù)增殖。而p53突變導(dǎo)致功能缺失時(shí)，其不僅喪失了原有的細(xì)胞周期阻滯、誘導(dǎo)凋亡發(fā)生、維持基因組穩(wěn)定和錯(cuò)配dna修復(fù)等抑癌功能。而且p53的突變體還可能在腫瘤發(fā)生與轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。

2、p53突變的類型包括基因片段缺失、插入、點(diǎn)突變引起的錯(cuò)義突變以及雜合性缺失，其中約有80％的突變是因?yàn)辄c(diǎn)突變引起的錯(cuò)義突變，主要涉及編碼p53蛋白dbd結(jié)構(gòu)域的部分。而在該區(qū)域內(nèi)，8個(gè)氨基酸突變(r175h、g245s、r248q、r248w、r249s、r273h、r273s和r282w)占人類癌癥中鑒定的所有突變p53蛋白的27％，被稱為熱點(diǎn)突變。突變后的p53可以使編碼產(chǎn)物的調(diào)節(jié)紊亂，細(xì)胞分化障礙，生長失控乃至癌變。

3、p53的異常表達(dá)與腫瘤的轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及不良預(yù)后相關(guān)，因此對于腫瘤病人p53基因突變情況的檢測意義重大。目前針對p53突變的檢測方法有很多，例如sanger測序，pcr，高通量測序等方法，其中sanger測序?qū)颖疽筝^高，檢測范圍有限，檢測靈敏度相對較低，通量低，檢測時(shí)間較長；而以pcr為基礎(chǔ)的檢測手段，諸如arms-pcr，熒光定量pcr、數(shù)字pcr等，操作簡便，快速，數(shù)據(jù)分析簡單，但是由于通量的限制，無法滿足臨床對p53多位點(diǎn)的檢測需求；而高通量測序雖然解決了通量的局限，能對p53的突變進(jìn)行全面檢測，但實(shí)驗(yàn)操作繁瑣，檢測周期長，成本高昂，且對實(shí)驗(yàn)操作及數(shù)據(jù)分析人員的技術(shù)要求門檻高。因此，亟需一種經(jīng)濟(jì)、快速、易操作的檢測方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種基于核酸飛行質(zhì)譜法檢測p53基因突變的方法、引物、試劑盒及應(yīng)用。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案：

3、本發(fā)明提供了一種基于核酸飛行質(zhì)譜法檢測p53基因突變的引物組合，所述引物組合包括擴(kuò)增引物組和用于p53基因突變檢測的延伸引物組，所述擴(kuò)增引物組包括seq?idno.1-seq?id?no.14所示的引物序列，所述延伸引物組包括seq?id?no.15-seq?id?no.39所示的引物序列。

4、優(yōu)選地，所述擴(kuò)增引物組包括w1?primer?mix、w2?primer?mix和w3?primer?mix，其中，w1?primer?mix包括seq?id?no.1-seq?id?no.10所示的引物序列，w2?primer?mix包括seq?id?no.1-seq?id?no.6和seq?id?no.11-seq?id?no.14所示的引物序列，w3primermix包括seq?id?no.1-seq?id?no.6所示的序列；所述延伸引物組包括w1?uep?mix、w2?uepmix和w3?uep?mix，其中，w1?uep?mix包括seq?id?no.15-seq?id?no.25所示的引物序列，w2uep?mix包括seq?id?no.26-seq?id?no.34所示的引物序列，w3?uep?mix包括seq?idno.35-seq?id?no.39所示的序列。

5、本發(fā)明還提供了上述檢測p53基因突變的引物組合在制備p53基因突變檢測產(chǎn)品中的應(yīng)用。

6、本發(fā)明還提供了一種p53基因突變檢測試劑盒，所述p53基因突變檢測試劑盒包括上述檢測p53基因突變的引物組合。

7、本發(fā)明還提供了應(yīng)用上述檢測p53基因突變的引物組合檢測p53基因突變的方法，所述方法包括如下：

8、s1、引物配置：配置擴(kuò)增引物組和延伸引物組，其中，擴(kuò)增引物組合包括w1?primermix、w2?primer?mix、w3?primer?mix，延伸引物組包括w1?uep?mix、w2?uep?mix、w3?uepmix；所述擴(kuò)增引物組和延伸引物組的具體信息為：

9、

10、

11、

12、s2、多重pcr擴(kuò)增反應(yīng)：根據(jù)檢測份數(shù)配制pcr混液，分別加入w1?primer?mix、w2primer?mix和w3?primer?mix配制w1，w2和w3反應(yīng)體系，分裝到96孔板；將待檢測的樣本dna分別加入到w1，w2和w3反應(yīng)體系；將96孔板用膜封好，渦旋震蕩和離心后，將96孔板放上pcr儀進(jìn)行pcr擴(kuò)增反應(yīng)；

13、s3、sap反應(yīng)：使用sap酶除去pcr反應(yīng)體系中殘留的dntps；

14、s4、延伸反應(yīng)：配制iplex延伸混液，分別加入w1?uep?mix、w2?uep?mix和w3?uepmix配制w1、w2和w3反應(yīng)體系的iplex延伸混液；每一個(gè)反應(yīng)孔加入對應(yīng)的iplex延伸混液并混合；將96孔板用膜封好，渦旋震蕩和離心后，將96孔板放上pcr儀進(jìn)行熱循環(huán)反應(yīng)進(jìn)行單堿基延伸；

15、s5、飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測：在96孔板的每一個(gè)有樣本的孔里加入41μl?ddh2o,然后離心；使用cpm進(jìn)行樣本脫鹽，點(diǎn)樣到芯片以及質(zhì)譜儀進(jìn)行飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測獲得數(shù)據(jù)，根據(jù)產(chǎn)物分子量大小對應(yīng)的峰位來確定對應(yīng)位點(diǎn)的突變情況。

16、優(yōu)選地，所述s2多重pcr擴(kuò)增反應(yīng)中，pcr混液配制為：

17、

18、w1、w2和w3反應(yīng)體系分裝體積為3μl每孔，待檢測的樣本dna濃度為5ng/μl，待檢測的樣本dna加入體積為2μl；

19、pcr擴(kuò)增反應(yīng)條件為：

20、

21、優(yōu)選地，所述s3?sap反應(yīng)中，sap反應(yīng)液配制為：

22、

23、sap反應(yīng)條件為：加入2μl?sap混液到96孔板反應(yīng)孔，加sap混液后總體積：7μl；將96孔板用膜封好，渦旋震蕩和離心，離心條件為：4000rpm?5秒；將96孔板放上pcr儀進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為：

24、 溫度 時(shí)間 stage?1 37℃ 40min stage?2 85℃ 5min stage?3 4℃ hold

25、優(yōu)選地，所述s4延伸反應(yīng)中，iplex延伸混液配制為：

26、

27、iplex延伸混液加入體積為2μl；

28、延伸反應(yīng)條件為：

29、

30、本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明公開了一種基于核酸飛行質(zhì)譜法檢測p53基因突變的方法、引物、試劑盒及應(yīng)用，所述引物組合包括擴(kuò)增引物組和用于p53基因突變檢測的延伸引物組，所述擴(kuò)增引物組包括seq?id?no.1-seq?id?no.14所示的引物序列，所述延伸引物組包括seq?id?no.15-seq?id?no.39所示的引物序列。本發(fā)明公開的檢測p53基因突變的引物組合能夠?qū)崿F(xiàn)對p53基因突變進(jìn)行準(zhǔn)確的檢測，同時(shí)達(dá)到質(zhì)譜檢測技術(shù)的要求，實(shí)現(xiàn)應(yīng)用massarray系統(tǒng)對待測樣品的p53基因突變進(jìn)行快速有效的檢測。同時(shí)，本發(fā)明公開的檢測p53基因突變的引物組合覆蓋了p53基因的25個(gè)snp位點(diǎn)中共47種突變類型，相較于傳統(tǒng)pcr方法檢測位點(diǎn)更全面。本發(fā)明提供的應(yīng)用檢測p53基因突變的引物組合檢測p53基因突變的方法，與目前市面上的檢測方法相比，還具有準(zhǔn)確性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好以及成本低、檢測周期短、檢測位點(diǎn)更全面、結(jié)果直觀無需生信分析等優(yōu)勢。