本發(fā)明涉及動物病毒檢測，尤其涉及一種豬偽狂犬病毒全基因組的擴增引物和方法。

背景技術(shù)：

1、豬偽狂犬病(pseudorabies，pr)是由豬偽狂犬病毒(pseudorabies?virus，prv)引起的一種多種動物共患的、急性接觸性傳染病，主要癥狀為新生仔豬感染后出現(xiàn)神經(jīng)癥狀、死亡等，妊娠母可引起流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎及呼吸系統(tǒng)癥狀，育肥豬則主要表現(xiàn)為呼吸障礙和生長緩慢。該病毒自1902年被匈牙利學者aueszky發(fā)現(xiàn)以來，給世界范圍內(nèi)的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。迄今為止，該病毒已經(jīng)出現(xiàn)了一百多年，但在很多養(yǎng)豬國家仍然無法得到有效根除。1947年，我國獸醫(yī)行業(yè)的先驅(qū)劉永純先生首次在貓上發(fā)現(xiàn)偽狂犬病毒感染的案例，確認了該病在我國的存在。此后的數(shù)十年時間，prv給我國的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的損失，尤其是2011年以來，變異株偽狂犬病毒的出現(xiàn)和廣泛流行，嚴重制約了生豬產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。

2、至20世紀90年代，我國從匈牙利引進prv的經(jīng)典弱毒苗bartha～k61株，該疫苗毒力弱，免疫效果好，經(jīng)過大量生產(chǎn)并廣泛應用到各大豬場后，偽狂犬病在我國流行的狀況得到了有效控制，參照美國對prv的凈化方法，許多豬場還完成了對該病原的凈化。然而，在2011年，國內(nèi)的prv流行毒株再次發(fā)生了變異，新產(chǎn)生的毒株與經(jīng)典prv弱毒苗bartha～k61分別屬于不同的亞群，使現(xiàn)有的疫苗無法產(chǎn)生足夠的保護作用，進而導致了prv在國內(nèi)的再次流行。近年來prv一直處于變異和進化中，對prv感染進行快速鑒別診斷，并獲得其基因組信息，能為病毒早發(fā)現(xiàn)、早控制、溯源提供依據(jù)，盡可能減小其對養(yǎng)豬業(yè)帶來的經(jīng)濟損失。納米孔測序具有實時、便攜、長讀長、高通量等特點，可實現(xiàn)現(xiàn)場實時快速檢測，及時準確鑒別病原體，給出精準檢測結(jié)果；然而，目前尚無針對納米孔測序優(yōu)勢設計的prv的測序技術(shù)。因此，目前仍亟需一種基于三代納米孔測序的prv全基因組測序技術(shù)，快速獲得病原體全基因組序列，為病毒遺傳變異和流行病學分析提供重要參考和理論依據(jù)。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明設計了prv全基因組長pcr擴增特異性引物，并進一步提供一種納米孔測序的prv實時檢測方法，充分發(fā)揮納米孔測序在病原檢測中實時、便攜、長讀長、高通量等優(yōu)勢。該檢測方法可快速鑒別診斷prv的感染，同時得到其全基因組序列，獲得的全基因組序列可為病原變異監(jiān)控及分子流行病學研究提供信息。

2、為達到上述發(fā)明目的，本發(fā)明所采如下技術(shù)方案為：

3、一方面，本發(fā)明提供一種豬偽狂犬病毒的檢測引物組，所述檢測引物組包括271對擴增引物，具體序列如seq?id?no.1～542所示。

4、另一方面，本發(fā)明提供上述檢測引物組在制備檢測豬偽狂犬病毒的產(chǎn)品中的應用。

5、進一步地，所述產(chǎn)品包括試劑或試劑盒。

6、另一方面，本發(fā)明提供一種豬偽狂犬病毒的檢測試劑，包括上述檢測引物組。

7、進一步地，所述檢測試劑包括第一引物組和第二引物組，其中，第一引物組包括136對擴增引物，具體序列如seq?id?no.1～272所示；第二引物組包括135對擴增引物，具體序列如seq?id?no.273～542所示。

8、另一方面，本發(fā)明提供一種豬偽狂犬病毒的檢測試劑盒，包括上述檢測引物組。

9、進一步地，所述檢測試劑盒包括第一引物組和第二引物組，其中，第一引物組包括136對擴增引物，具體序列如seq?id?no.1～272所示；第二引物組包括135對擴增引物，具體序列如seq?id?no.273～542所示。

10、另一方面，本發(fā)明提供一種豬偽狂犬病毒測序片段的制備方法，利用上述檢測引物組對待檢測樣本抽提得到的dna進行擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)純化得到測序片段。

11、進一步地，利用第一引物組和第二引物組分別對待檢測樣本得到的dna進行擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)純化得到測序片段；

12、其中，第一引物組包括136對擴增引物，具體序列如seq?id?no.1～272所示；第二引物組包括135對擴增引物，具體序列如seq?id?no.273～542所示。

13、進一步地，測序樣本適用于二代或三代測序。

14、進一步地，待檢測樣本包括臨床樣本或環(huán)境樣本；

15、優(yōu)選地，臨床樣本包括血液、精液或扁桃體等。

16、進一步地，上述檢測步驟包括：

17、1)利用上述引物組對待檢測樣本逆轉(zhuǎn)錄得到的cdna進行擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)純化得到測序片段。

18、2)利用第一引物組和第二引物組分別對待檢測樣本逆轉(zhuǎn)錄得到的cdna進行多重pcr擴增；其中，第一引物組包括136對擴增引物，具體序列如seq?id?no.1～272所示；第二引物組包括135對擴增引物，具體序列如seq?id?no.273～542所示。

19、3)將兩組引物的擴增產(chǎn)物合并，經(jīng)純化得到測序片段。

20、4)測序獲得豬偽狂犬病毒的基因組片段序列。

21、5)經(jīng)與參考基因組比對和/或組裝獲得豬偽狂犬病毒的基因組全長序列。

22、進一步地，所述豬偽狂犬病毒的非疾病診斷檢測為檢測環(huán)境樣本或無生命的生物個體的血液、精液或扁桃體樣本。

23、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：

24、根據(jù)美國生物技術(shù)信息中心基因序列數(shù)據(jù)庫genbank中已公開的prv的全基因組序列，按照基因組位置設計得到271對擴增引物，具體序列如seq?id?no.1～542所示。本發(fā)明的檢測方法可獲取prv全基因組序列信息。本發(fā)明利用納米孔測序?qū)崟r、便攜、長讀長、高通量的優(yōu)勢，實現(xiàn)快速鑒別診斷prv的感染，最快15h；同時得到其全基因組序列，獲得的基因組序列能為病毒溯源、病原變異追蹤、新型毒株識別和預警等提供科學依據(jù)。

技術(shù)特征：

1.一種豬偽狂犬病毒的檢測引物組，其特征在于，所述檢測引物組包括271對擴增引物，具體序列如seq?id?no.1～542所示。

2.權(quán)利要求1所述的檢測引物組在制備檢測豬偽狂犬病毒的產(chǎn)品中的應用。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應用，其特征在于，所述產(chǎn)品包括試劑或試劑盒。

4.一種豬偽狂犬病毒的檢測試劑，其特征在于，包括權(quán)利要求1所述的檢測引物組。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測試劑，其特征在于，所述檢測試劑包括第一引物組和第二引物組，其中，第一引物組包括136對擴增引物，具體序列如seq?id?no.1～272所示；第二引物組包括135對擴增引物，具體序列如seq?id?no.273～542所示。

6.一種豬偽狂犬病毒的檢測試劑盒，其特征在于，包括權(quán)利要求1所述的檢測引物組。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述檢測試劑盒包括第一引物組和第二引物組，其中，第一引物組包括136對擴增引物，具體序列如seq?id?no.1～272所示；第二引物組包括135對擴增引物，具體序列如seq?id?no.273～542所示。

8.一種豬偽狂犬病毒測序片段的制備方法，其特征在于，利用權(quán)利要求1所述的檢測引物組對待檢測樣本抽提得到dna核酸進行擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)純化得到測序片段。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于，利用第一引物組和第二引物組分別對待檢測樣本逆轉(zhuǎn)錄得到的cdna進行擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)純化得到測序片段；其中，第一引物組包括136對擴增引物，具體序列如seq?id?no.1～272所示；第二引物組包括135對擴增引物，具體序列如seq?id?no.273～542所示。

10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于，所述測序樣本適用于三代測序。

11.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于，所述待檢測樣本包括臨床樣本或環(huán)境樣本。

12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的制備方法，其特征在于，所述臨床樣本包括血液、精液或扁桃體等。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供了一種豬偽狂犬病毒全基因組的擴增引物和方法。豬偽狂犬病毒的檢測引物組包括271對擴增引物，具體序列如SEQ?ID?NO.1～542所示。本發(fā)明提供的檢測引物組可以實現(xiàn)對豬偽狂犬病毒的較均勻覆蓋，在納米孔測序中，實現(xiàn)了基因組100％區(qū)域覆蓋。本發(fā)明提供的豬偽狂犬病毒全基因組的測序片段制備方法簡便易操作，擴增效果好，且納米孔測序具有邊測序邊實時分析的優(yōu)勢，可以大大縮短檢測時間，最快15h能鑒別診斷豬偽狂犬病毒的感染，同時得到其全基因組序列，獲得的基因組序列能為病毒溯源、病原變異追蹤、新型毒株識別和預警等提供科學依據(jù)。

技術(shù)研發(fā)人員：李群輝,林麗苗,麥凱杰,趙海參,盧立康,羅洋洋,任柏樺,王連想
受保護的技術(shù)使用者：溫氏食品集團股份有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/23