本發(fā)明涉及一種高通量篩選產胞外多糖的乳酸菌并鑒定其胞外多糖的單糖組成的方法。

背景技術：

1、乳酸菌胞外多糖（exopolysaccharides，epss）是乳酸菌在生長代謝過程中分泌到胞外的大分子糖類聚合物。乳酸菌eps的結構復雜，可根據單糖組成、連接方式以及所攜帶的取代基不同而加以區(qū)分，不同的組成和結構也賦予了其不同的性質。乳酸菌胞外多糖具有安全的使用地位和獨特的物理化學性質。在食品加工工藝方面，乳酸菌eps由于具有乳化劑、穩(wěn)定劑和絮凝劑等性質，可用于改善酸奶、奶酪、冰淇淋等傳統(tǒng)乳制品甚至是面包、發(fā)酵香腸等非乳制品的質構特性和流變學特性，從而達到改善口感和提高消費者接受程度的目的。此外，近年來的研究表明，乳酸菌eps具有多種生物活性，如抗氧化、抗衰老、免疫調節(jié)與抗炎、抗腫瘤、降膽固醇、降血壓、改善腸道菌群結構等作用。因此，對乳酸菌eps的深入研究在生物學、化學以及醫(yī)藥學領域都具有重要意義。

2、人們對乳酸菌eps的關注度越來越高，一方面是因為越來越多源自不同棲息地的菌株被發(fā)現，另一方面是由于eps具備的新的生物活性被不斷挖掘，應用潛力大增，涉及領域更加廣泛。研究eps的工作內容主要聚焦于幾個方面，包括挑選合適的產eps菌株、分析碳水化合物的組成、結構和物理化學性質以及其生物活性和應用研究。關于多糖的生產者篩選和其組成鑒別一直是一個繁冗復雜的過程。更快地了解來自自然界的eps并充分挖掘其應用潛力一直是研究者們不懈努力的方向。

3、至今為止，eps的鑒定和成分分析通常由幾個分離步驟組成，包括分離、純化、干燥、分解和冗長的色譜分析。從菌株的篩選到了解單糖組成，需要幾天甚至幾周的時間，時間周期很長，且無法實現大批量的處理。因此，建立一種高通量的方法用以判斷eps生產者以及鑒別多糖身份是至關重要的。

技術實現思路

1、本發(fā)明的目的是提供一種高通量篩選產胞外多糖的乳酸菌并鑒定其胞外多糖的單糖組成的方法。

2、本發(fā)明提供了一種高通量篩選產胞外多糖的細菌并鑒定其胞外多糖的單糖組成的方法，包括如下步驟：

3、（1）采用多孔深孔板培養(yǎng)供試細菌；

4、（2）完成步驟（1）后，將培養(yǎng)上清采用多孔過濾板過濾并收集濾液至多孔深孔板；

5、（3）從步驟（2）得到的濾液取樣，通過醇沉試驗從供試細菌中篩選產胞外多糖的細菌，產胞外多糖的細菌即為目標細菌；

6、（4）取所述目標細菌進行步驟（2）得到的濾液，采用sephadex?g-25進行過濾，收集濾液；

7、（5）取步驟（4）得到的濾液，進行多糖水解和pmp衍生化，然后通過hplc-esi-ms/ms分析獲得胞外多糖的單糖組成和配比。

8、具體的，所述步驟（1）為：取96孔深孔板（稱為培養(yǎng)板），加入mrs肉湯培養(yǎng)基（1.5ml/孔），然后樣本孔加入供試細菌菌液（30μl/孔）且nc孔加入mrs肉湯培養(yǎng)基（30μl/孔），然后厭氧培養(yǎng)36h。

9、具體的，所述厭氧培養(yǎng)為：置于密封盒中，在密封盒中加入厭氧產氣袋，密封后靜置培養(yǎng)。

10、具體的，所述供試細菌菌液是將供試細菌用mrs肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)得到的。

11、具體的，所述供試細菌菌液中的供試細菌濃度為108cfu/ml-1010cfu/ml。

12、具體的，所述供試細菌菌液中的供試細菌濃度為109cfu/ml。

13、具體的，所述步驟（2）為：在真空抽濾盒內腔中放置96孔深孔板（稱為下層板）和96孔過濾板（稱為上層板），上層板和下層板的96個孔一一對應；然后將完成步驟（1）的培養(yǎng)板離心后的上清液以一一對應的方式加入上層板的各個孔中，抽濾，濾液進入下層板的各個孔中。具體的，所述離心參數為：4℃、4000×g離心30min。

14、所述醇沉試驗通過目測或檢測od600nm值判斷供試細菌是否為產胞外多糖的細菌。

15、所述步驟（3）為：從步驟（2）得到的濾液取樣，加入乙醇，通過目測或檢測od600nm值判斷供試細菌是否為產胞外多糖的細菌。

16、具體的，所述步驟（3）為：完成步驟（2）后，取樣下層板中的濾液并以一一對應的方式加入96孔板（稱為檢測板）（100μl/孔），然后加入無水乙醇（200μl/孔），4℃靜置24h；然后通過目測觀察和/或檢測od600nm值判斷供試細菌是否為產胞外多糖的細菌。

17、目測觀察判斷時，如果滿足標準1和/或標準2，供試細菌為產胞外多糖的細菌。

18、標準1：樣本孔內的體系相對于nc孔內的體系更渾濁。

19、標準2：樣本孔中可觀察到沉淀。

20、樣本孔內的體系越渾濁，代表胞外多糖的產量越高。

21、樣本孔內的沉淀越多，代表胞外多糖的產量越高。

22、檢測od600nm值判斷時，如果滿足標準3，供試細菌為產胞外多糖的細菌。

23、標準3：樣本孔內體系的od600nm值大于nc孔內體系的od600nm值。

24、樣本孔內體系的od600nm值越大，代表胞外多糖的產量越高。

25、具體的，所述步驟（4）為：根據步驟（3）的結果，取目標細菌對應的步驟（2）的下層板中的濾液，加入填充介質為sephadex?g-25的96孔凝膠濾板（100μl/孔），4℃、2000×g離心2min，收集濾液。

26、所述多糖水解和pmp衍生化的方法如下：取50μl步驟（4）得到的濾液，加入50μl4mol/l的三氟乙酸水溶液并密封，121℃消化90min，然后冷卻至室溫，加入3.2%氨水調ph至8，即為水解液；取100μl水解液，加入100μl?14%氨水，渦旋混勻，然后13200rpm離心4min，收集上清液；取50μl上清液，加200μl?pmp衍生試劑（2體積份0.1mol/l?pmp溶液和1體積份0.4%氨水混勻，得到pmp衍生試劑；pmp，即1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮；pmp溶液的溶劑為甲醇），渦旋混勻，然后70℃反應60min，然后冷卻至室溫，然后加入750μl蒸餾水，振蕩混勻，然后用氯仿洗滌，然后取水相，即為產物溶液。

27、所述hplc-esi-ms/ms分析的hplc參數如下：

28、色譜柱：mslab50aa-c18（150×4.6mm）；

29、柱溫：50℃；

30、進樣量：5μl；

31、流動相為a相、b相、或a相和b相的混合物；流動相流速：1ml/min；a相：含1‰（體積百分含量）甲酸的水；b相：含1‰（體積百分含量）甲酸的乙腈；

32、洗脫過程：第0-1min，a相占流動相的體積分數為95%，相應的b相占流動相的體積分數為5%；第1-1.1min，a相占流動相的體積分數由95%線性下降至50%，相應的b相占流動相的體積分數由5%線性上升至50%；第1.1-12min，a相占流動相的體積分數由50%線性下降至30%，相應的b相占流動相的體積分數由50%線性上升至70%；第12-12.1min,?a相占流動相的體積分數由30%線性下降至0%，相應的b相占流動相的體積分數由70%線性上升至100%；第12.1-15min，a相占流動相的體積分數為0%，相應的b相占流動相的體積分數為100%；第15-15.1min,?a相占流動相的體積分數由0%線性上升至95%，相應的b相占流動相的體積分數由100%線性下降至5%；第15.1-20min，a相占流動相的體積分數為95%，相應的b相占流動相的體積分數為5%。

33、所述hplc-esi-ms/ms分析的質譜參數如下：

34、離子源:?+esi電噴霧離子源；

35、掃描方式：mrm?多反應監(jiān)測；

36、氣簾氣：20?psi；

37、噴霧電壓：+5500v；

38、霧化氣：55psi；

39、碰撞氣：medium；

40、碰撞室射出電壓：2.0；

41、輔助氣：60?psi；

42、霧化溫度：500℃。

43、所述hplc-esi-ms/ms分析還包括如下步驟：

44、將單糖標準品溶于蒸餾水，然后采用相同參數進行hplc-esi-ms/ms；

45、基于產物溶液的出峰位置和標準品溶液的出峰位置，確定供試細菌的胞外多糖的單糖組成，將產物溶液的目標峰峰面積代入標準曲線方程，獲得產物溶液中的單糖含量，計算得到單糖配比。

46、標準曲線方程為以單糖標準品含量和目標峰峰面積為變量的函數式。

47、具體的，單糖標準品為d-葡萄糖、d-半乳糖、l-鼠李糖、l-巖藻糖、l-阿拉伯糖、d-甘露糖或d-木糖。

48、具體的，所述多孔深孔板為具有n1個孔的深孔板。

49、具體的，n1為12以上的自然數。

50、具體的，n1為24以上的自然數。

51、具體的，n1為36以上的自然數。

52、具體的，n1為48以上的自然數。

53、具體的，n1為96以上的自然數。

54、具體的，n1為384以下的自然數。

55、具體的，n1為256以下的自然數。

56、具體的，n1為128以下的自然數。

57、具體的，n1為48或96或128。

58、具體的，所述多孔深孔板的規(guī)格為1.5-2.1ml/孔。

59、具體的，所述多孔深孔板為96孔深孔板(規(guī)格：u形底，1.8ml/孔)。

60、具體的，所述多孔深孔板為碧云天生物技術有限公司產品，產品目錄號為fpt026。

61、具體的，所述多孔深孔板的規(guī)格為1.8ml/孔。

62、具體的，所述多孔過濾板為具有n2個孔的過濾板。

63、具體的，n2為12以上的自然數。

64、具體的，n2為24以上的自然數。

65、具體的，n2為36以上的自然數。

66、具體的，n2為48以上的自然數。

67、具體的，n2為96以上的自然數。

68、具體的，n2為384以下的自然數。

69、具體的，n2為256以下的自然數。

70、具體的，n2為128以下的自然數。

71、具體的，n2為48或96或128。

72、具體的，所述多孔過濾板中具有孔徑為1.0μm的濾膜。

73、具體的，所述多孔過濾板中具有孔徑為1.0μm的雙層pall濾膜。

74、具體的，所述多孔過濾板為96孔過濾板（每個孔中均具有孔徑為1.0μm的雙層pall濾膜）。所述多孔過濾板為海門市優(yōu)耐特實驗器材發(fā)展有限公司產品，產品目錄號為aa0900196002。

75、具體的，所述采用sephadex?g-25進行過濾為采用填充介質為sephadex?g-25的多孔凝膠濾板進行過濾。

76、所述多孔凝膠濾板為具有n3個孔的凝膠濾板。

77、具體的，n3為12以上的自然數。

78、具體的，n3為24以上的自然數。

79、具體的，n3為36以上的自然數。

80、具體的，n3為48以上的自然數。

81、具體的，n3為96以上的自然數。

82、具體的，n3為384以下的自然數。

83、具體的，n3為256以下的自然數。

84、具體的，n3為128以下的自然數。

85、具體的，n3為48或96或128。

86、具體的，所述多孔凝膠濾板為96孔凝膠濾板（96-well?macro?spincolumns，填充物為sephadex?g-25）。

87、具體的，所述多孔凝膠濾板為美國harvard?bioscience公司產品，產品目錄號為74-5652。

88、具體的，所述供試細菌為供試乳酸菌。

89、具體的，所述細菌為乳酸菌。

90、具體的，所述供試細菌為乳桿菌和或雙歧桿菌。

91、具體的，所述供試細菌為副干酪乳桿菌、乳雙歧桿菌或長雙歧桿菌。

92、本發(fā)明提供的方法的操作簡單，適用性強，可以實現幾十株菌甚至將近百株菌同時操作，達到快速高效篩選的目的，并且可以在不需要取得固體胞外多糖樣品的條件下，直接通過液體得到胞外多糖的單糖組成信息，大大縮短了時間周期，降低人工成本。本發(fā)明可用于篩選產胞外多糖的細菌（特別是乳酸菌）并鑒定其胞外多糖的單糖組成，具有高通量、操作簡便和耗時短的優(yōu)點，具有市場前景和推廣價值。