本發(fā)明屬于分子生物學(xué)及細(xì)胞免疫學(xué)的醫(yī)藥，具體涉及一株乙型肝炎病毒核心蛋白的單克隆抗體cabd4及其制備與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、乙型肝炎病毒(hepatitisb?virus，hbv)感染仍然是全球重大的公共衛(wèi)生問(wèn)題。目前，針對(duì)慢性乙肝的抗病毒藥物核苷(酸)類(lèi)似物(nas)和干擾素-α(ifn-α)雖可有效抑制hbvdna的復(fù)制和疾病進(jìn)展，但是功能性治愈率很低。因此，仍然迫切需要開(kāi)發(fā)更有效的策略用于hbv感染的檢測(cè)和治療。

2、hbv是一種嗜肝dna病毒，直徑約42nm，其內(nèi)部衣殼由核心蛋白(hepatitisbcoreprotein，hbc)組裝而成。在大多數(shù)hbv基因型中，核心蛋白由183個(gè)氨基酸(a.a.)組成，包含一個(gè)用于形成衣殼的n端組裝結(jié)構(gòu)域(1-149a.a.)和一個(gè)用于與核酸結(jié)合和核定位的富含精氨酸的c端結(jié)構(gòu)域(150-183a.a.)。hbc首先形成二聚體，通常情況下再由120個(gè)二聚體自組裝成具有t＝4二十面體對(duì)稱(chēng)性的衣殼，衣殼包裹著病毒的rna和聚合酶，不僅為病毒rna的逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程提供了一個(gè)密閉的環(huán)境，而且還可促進(jìn)核衣殼包裝和病毒粒子的形成。另外，hbc可調(diào)節(jié)衣殼轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞核，并與感染期間cccdna的形成相關(guān)。hbc除了作為結(jié)構(gòu)蛋白以及在病毒生命周期的多個(gè)階段發(fā)揮調(diào)節(jié)功能外，還可通過(guò)抑制宿主免疫反應(yīng)或激活mapk通路和wnt/β-catenin通路等多條信號(hào)通路在hbv相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。hbc這些方面的功能提示其可成為hbv檢測(cè)和干預(yù)的重要靶點(diǎn)。

3、hbv相關(guān)的研究主要通過(guò)對(duì)細(xì)胞上清中表面抗原、e抗原和hbvdna的檢測(cè)，間接評(píng)估hbv感染滴度。而目前可用于hbv多種基因型檢測(cè)和多種生化實(shí)驗(yàn)如酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(elisa)、免疫印跡法(westernblot)、免疫熒光法(ifa)、流式細(xì)胞術(shù)、免疫斑點(diǎn)法、免疫組織化學(xué)(ihc)等的抗hbc單克隆抗體甚少，這對(duì)直接檢測(cè)hbv感染的細(xì)胞造成困難。因此，開(kāi)發(fā)靈敏度更高、廣譜性更強(qiáng)的抗hbc單克隆抗體，對(duì)于hbv相關(guān)研究的發(fā)展非常重要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了能夠適用于多種hbv基因型檢測(cè)和多種生化實(shí)驗(yàn)方法的檢測(cè)，本發(fā)明篩選獲得了1株針對(duì)hbv核心蛋白的單克隆抗體，其具有高效、廣譜性、多用途的特點(diǎn)。本發(fā)明進(jìn)一步提供了使用針對(duì)hbc的單克隆抗體用于多種方法檢測(cè)hbv病毒感染，上述單克隆抗體對(duì)hbv核心蛋白具有很強(qiáng)的特異性結(jié)合能力，并可通過(guò)多種生化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)hbv的核心蛋白，上述單克隆抗體有望成為hbv活病毒感染的檢測(cè)抗體，為多種hbv基因型的抗原檢測(cè)提供了強(qiáng)有力的工具。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

3、本發(fā)明的第一個(gè)方面是提供一株乙型肝炎病毒核心蛋白的單克隆抗體cabd4，所述單克隆抗體識(shí)別乙型肝炎病毒hbv的核心蛋白hbc。

4、進(jìn)一步地，所述單克隆抗體為廣譜性人源單克隆抗體，可識(shí)別hbv所有基因型的hbc，hbv基因型包括a、b、c、d、e、f、g、h、i、j。

5、進(jìn)一步地，所述單克隆抗體的重鏈可變區(qū)vh的cdr1-h、cdr2-h和cdr3-h的氨基酸序列分別為seq?id?no.1、seq?id?no.2和seq?id?no.3，所述單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)vl的cdr1-l、cdr2-l和cdr3-l的氨基酸序列分別為seq?id?no.4、“l(fā)gs”和seq?id?no.5。

6、進(jìn)一步地，所述單克隆抗體的重鏈可變區(qū)vh的氨基酸序列如seq?id?no.11所示或與其具有至少80％一致性的氨基酸序列，所述單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)vl的氨基酸序列如seq?id?no.12所示或與其具有至少80％一致性的氨基酸序列。

7、可理解的是，重鏈序列和配對(duì)的輕鏈序列構(gòu)成了上述單克隆抗體，并且它們的可變區(qū)決定了抗體對(duì)抗原的結(jié)合識(shí)別及特異性，抗體特異性取決于抗體結(jié)合位點(diǎn)和抗原決定區(qū)間的相互作用。重鏈和輕鏈的結(jié)合位點(diǎn)都主要由3個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(cdr)的殘基組成，cdr間通過(guò)框架區(qū)(fr)進(jìn)行銜接。由此，本領(lǐng)域的技術(shù)人員在獲知cdr的氨基酸序列后，可輕易確定框架區(qū)。即，在重鏈和輕鏈的cdr序列不變情況下，能夠基本實(shí)現(xiàn)本發(fā)明單克隆抗體cabd4的功能和應(yīng)用。因此，本發(fā)明的單克隆抗體，其具體序列不僅限于以上具體的重鏈序列可變區(qū)和輕鏈序列可變區(qū)，以上具體序列的可變區(qū)只是本發(fā)明的一種實(shí)現(xiàn)方式中具體采用的單克隆抗體序列。

8、由與參照序列“至少80％一致性”的氨基酸序列組成的蛋白，與參照序列相比可包含突變?nèi)缛笔?、插入?或取代。在取代的情況中，與參照序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列組成的蛋白，可對(duì)應(yīng)源自不同于參照序列的物種的同源序列?！鞍被崛〈笨梢允潜Ｊ鼗蚍潜Ｊ氐摹?yōu)選地，取代為保守取代，其中一個(gè)氨基酸由具有相似結(jié)構(gòu)和/或化學(xué)性質(zhì)的另一氨基酸取代。具體地，重鏈或輕鏈可變區(qū)的序列與參照序列區(qū)別僅在于保守氨基酸取代。

9、本發(fā)明的第二個(gè)方面是提供與本發(fā)明第一個(gè)方面所述的單克隆抗體相關(guān)的生物材料，所述生物材料選自下述(a)～(b)中的一種：

10、(a)編碼本發(fā)明第一個(gè)方面所述單克隆抗體cabd4的核酸分子；

11、(b)含有(a)中所述核酸分子的表達(dá)盒、重組載體、重組細(xì)胞系。

12、進(jìn)一步地，所述表達(dá)盒、重組載體、重組細(xì)胞系可用于表達(dá)上述重鏈序列、輕鏈序列或單克隆抗體。

13、進(jìn)一步地，編碼seq?id?no.1所示的cdr1-h的核酸序列如seq?id?no.6所示；

14、編碼seq?id?no.2所示的cdr2-h的核酸序列如seq?id?no.7所示；

15、編碼seq?id?no.3所示的cdr3-h的核酸序列如seq?id?no.8所示；

16、編碼seq?id?no.4所示的cdr1-l的核酸序列如seq?id?no.9所示；

17、編碼cdr2-l的核酸序列為“ttgggttct”；

18、編碼seq?id?no.5所示的cdr3-l的核酸序列如seq?id?no.10所示。

19、進(jìn)一步地，編碼seq?id?no.11所示的vh的核酸序列如seq?id?no.13所示；

20、編碼seq?id?no.12所示的vl的核酸序列如seq?id?no.14所示。

21、可理解的是，以上具體的核酸序列只是本發(fā)明的一種實(shí)現(xiàn)方式中具體采用的核酸序列，根據(jù)密碼子的簡(jiǎn)并性，在保障編碼氨基酸序列不變的情況下，除了以上限定的核酸序列以外，可以編碼出相同重鏈序列或輕鏈序列的若干種核酸序列(例如保守核苷酸序列變體源于遺傳密碼簡(jiǎn)并和沉默的變體，核苷酸的替代、缺失和增加也包含在內(nèi))，都在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。

22、上述生物材料中，含有編碼抗體的核酸分子的表達(dá)盒，是指能夠在宿主細(xì)胞中表達(dá)所述抗體的dna，該dna不但可包括啟動(dòng)所述抗體基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，還可包括終止所述抗體基因轉(zhuǎn)錄的終止子。

23、上述生物材料中，載體是可將編碼某蛋白的多聚核苷酸插入其中并使蛋白獲得表達(dá)的一種核酸運(yùn)載工具。載體可通過(guò)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，使其攜帶的遺傳物質(zhì)元件在宿主細(xì)胞內(nèi)得以表達(dá)，載體可為質(zhì)粒、黏粒、噬菌體或病毒載體。

24、上述生物材料中，宿主細(xì)胞指的是導(dǎo)入載體的細(xì)胞，包括原核細(xì)胞、真菌細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞等，例如大腸桿菌、酵母細(xì)胞、s2果蠅細(xì)胞、bhk細(xì)胞、cho細(xì)胞、hek293細(xì)胞。上述表達(dá)盒、重組載體、重組細(xì)胞系均可采用本領(lǐng)域常規(guī)方法制備。

25、本發(fā)明的第三個(gè)方面是提供本發(fā)明第一個(gè)方面所述的單克隆抗體cabd4的制備方法，所述方法包括：將含有編碼所述單克隆抗體cabd4的核酸分子的重組載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞；培養(yǎng)轉(zhuǎn)染后的宿主細(xì)胞并收集上清液，純化獲得所述單克隆抗體cabd4。

26、進(jìn)一步地，所述重組載體為pcdna3.4質(zhì)粒，所述宿主細(xì)胞為293f細(xì)胞。

27、本發(fā)明的第四個(gè)方面是提供本發(fā)明第一個(gè)方面所述的單克隆抗體cabd4、本發(fā)明第二個(gè)方面所述的生物材料或采用本發(fā)明第三個(gè)方面所述的制備方法制得的單克隆抗體cabd4在制備檢測(cè)或診斷hbv的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

28、本發(fā)明的第五個(gè)方面是提供一種用于檢測(cè)或診斷hbv的產(chǎn)品，所述產(chǎn)品包含本發(fā)明第一個(gè)方面所述的單克隆抗體cabd4、本發(fā)明第二個(gè)方面所述的生物材料或采用本發(fā)明第三個(gè)方面所述的制備方法制得的單克隆抗體cabd4。

29、進(jìn)一步地，上述產(chǎn)品可為診斷試劑(診斷試劑盒)、檢測(cè)試劑(檢測(cè)試劑盒)等，其還可包括其他反應(yīng)試劑。上述產(chǎn)品可應(yīng)用于elisa、westernblot、流式細(xì)胞術(shù)、ifa、免疫斑點(diǎn)和免疫組化方法來(lái)檢測(cè)hbv的核心蛋白hbc。

30、本發(fā)明的第六個(gè)方面是提供一種非診斷目的的檢測(cè)hbv或其hbc的方法，所述方法包括：采用本發(fā)明第五個(gè)方面所述的產(chǎn)品與待檢樣品混合以檢測(cè)hbv的核心蛋白hbc。

31、上述待檢樣品涵蓋從受試者獲得的多種樣品類(lèi)型且可在診斷或檢測(cè)中使用，包括但不限于血液和其他生物來(lái)源的液體樣品、固體組織樣品，涵蓋臨床樣品、培養(yǎng)基中的細(xì)胞、細(xì)胞上清、細(xì)胞裂解物、血清、血漿、生物液體和組織樣品等。

32、進(jìn)一步地，檢測(cè)的方法包括：elisa、westernblot、流式細(xì)胞術(shù)、ifa、免疫斑點(diǎn)和免疫組化方法。

33、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明采用上述技術(shù)方案具有以下有益效果：

34、本發(fā)明篩選獲得的針對(duì)乙型肝炎病毒核心蛋白的單克隆抗體cabd4，其與hbc結(jié)合能力強(qiáng)。本發(fā)明通過(guò)實(shí)施例驗(yàn)證了單克隆抗體cabd4在多種生物化學(xué)方法中的應(yīng)用，并且驗(yàn)證了其檢測(cè)不同hbv基因型的能力。單克隆抗體cabd4具有高效、廣譜性、多用途的特點(diǎn)，在hbv感染的診斷領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。