本發(fā)明涉及釀酒酵母羊毛甾醇14α-去甲基化酶突變體的制備及應(yīng)用，屬于基因工程和酶工程。

背景技術(shù)：

1、麥角甾醇(ergosterol)又被稱為麥角固醇，分子式為c28h44o。由羊毛甾醇(lanosterol)經(jīng)羊毛甾醇14α-去甲基化酶(sterol?14α-demethylase,14dm,cyp51)催化而來(lái)。麥角甾醇作為一種甾醇庫(kù)，可以保證細(xì)菌中甾醇類結(jié)構(gòu)的平衡，在生物體內(nèi)起著至關(guān)重要的作用，例如參與膜的組成從而確保細(xì)胞膜的完整性、促使跨膜蛋白具有酶的活性、使膜具有流動(dòng)性以及細(xì)胞物質(zhì)運(yùn)輸?shù)?。除此之外麥角甾醇還可以通過(guò)調(diào)節(jié)膜結(jié)合atp酶的活性來(lái)影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和利用，通過(guò)影響細(xì)胞膜的遷移來(lái)調(diào)節(jié)磷脂酶的運(yùn)輸效率。麥角甾醇是合成維生素d2的前體物質(zhì),在醫(yī)藥、食品、以及飼料行業(yè)應(yīng)用廣泛。由于我國(guó)研究麥角甾醇時(shí)間較遲，其生產(chǎn)方法相對(duì)復(fù)雜，但需求量較大，往往供不應(yīng)求。因此，提高麥角甾醇的供應(yīng)對(duì)其后續(xù)在食品醫(yī)藥等領(lǐng)域的進(jìn)一步發(fā)展具有重要意義。

2、目前我國(guó)生產(chǎn)麥角甾醇的主要方法是利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)，利用的主要菌種通常是酵母菌、大型真菌以及霉菌等，優(yōu)點(diǎn)是繁殖快，易培養(yǎng)，產(chǎn)量大，安全快捷但菌種間麥角甾醇含量差異較大是普遍存在的問(wèn)題。因此提高微生物源的麥角甾醇含量是亟待解決的問(wèn)題。麥角甾醇合成途徑中羊毛甾醇14α位甲基化為關(guān)鍵步驟，但催化該步的天然羊毛甾醇14α-去甲基化酶的酶活和穩(wěn)定性差，利用酶工程獲得酶活與穩(wěn)定性提高的羊毛甾醇14α-去甲基化酶突變體對(duì)于微生物發(fā)酵生產(chǎn)麥角甾醇具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、基于上述現(xiàn)狀，本發(fā)明利用基因工程和酶工程的手段，提高釀酒酵母羊毛甾醇14α-去甲基化酶的活性，提高麥角甾醇的產(chǎn)量，為擴(kuò)大其工業(yè)化應(yīng)用創(chuàng)造條件。

2、本發(fā)明提供了催化效率提高的羊毛甾醇14α-去甲基化酶突變體，是將釀酒酵母(saccharomyces?cerevisiae)來(lái)源的羊毛甾醇14α-去甲基化酶的第127位、260位、352位、314位或384位一個(gè)或多個(gè)氨基酸進(jìn)行突變后獲得的突變體，這些突變體與其親代的羊毛甾醇14α-去甲基化酶相比，催化效率提高。

3、在一種實(shí)施方式中，所述釀酒酵母來(lái)源的羊毛甾醇14α-去甲基化酶含有如seq?idno.1所示的氨基酸。

4、在一種實(shí)施方式中，所述突變體是在釀酒酵母來(lái)源的羊毛甾醇14α-去甲基化酶的基礎(chǔ)上，具有如下一種或多種突變：

5、(1)將第127位丙氨酸突變?yōu)榻z氨酸；

6、(2)將第260位丙氨酸突變?yōu)橘嚢彼幔?/p>

7、(3)將第352位賴氨酸突變?yōu)榱涟彼幔?/p>

8、(4)將第314位甘氨酸突變?yōu)槔i氨酸；

9、(5)將第314位甘氨酸突變?yōu)樯彼幔?/p>

10、(6)將第384位苯丙氨酸突變?yōu)樘於彼幔?/p>

11、(7)將第384位苯丙氨酸突變?yōu)楣劝彼帷?/p>

12、在一種實(shí)施方式中，所述突變體是第127位丙氨酸(ala)突變?yōu)榻z氨酸(ser)，突變體命名為a127s。

13、在一種實(shí)施方式中，所述突變體是將第260位丙氨酸(ala)突變?yōu)橘嚢彼?lys)，突變體命名為a260k。

14、在一種實(shí)施方式中，所述突變體是將第352位賴氨酸(lys)突變?yōu)榱涟彼?leu)，突變體命名為k352l。

15、在一種實(shí)施方式中，所述突變體是將第314位甘氨酸(gly)突變?yōu)槔i氨酸(val)，突變體命名為g314v。

16、在一種實(shí)施方式中，所述突變體是將第314位甘氨酸(gly)突變?yōu)樯彼?trp)，突變體命名為g314w。

17、在一種實(shí)施方式中，所述突變體是將第384位苯丙氨酸(phe)突變?yōu)樘於彼?asp)，突變體命名為f384d。

18、在一種實(shí)施方式中，所述突變體是將第384位苯丙氨酸(phe)突變?yōu)楣劝彼?glu)，突變體命名為f384e。

19、在一種實(shí)施方式中，所述突變體是第127位丙氨酸(ala)突變?yōu)榻z氨酸(ser)，并將第352位賴氨酸(lys)突變?yōu)榱涟彼?leu)，突變體命名為a127s/k352l。

20、在一種實(shí)施方式中，所述突變體是第260位丙氨酸(ala)突變?yōu)橘嚢彼?lys)，并將第352位賴氨酸(lys)突變?yōu)榱涟彼?leu)，突變體命名為a260k/k352l。

21、在一種實(shí)施方式中，所述突變體是第127位丙氨酸(ala)突變?yōu)榻z氨酸(ser)，并將第260位丙氨酸(ala)突變?yōu)橘嚢彼?lys)，突變體命名為a127s/a260k。

22、在一種實(shí)施方式中，所述突變體是將第384位苯丙氨酸(phe)突變?yōu)樘於彼?asp)，并將第314位甘氨酸(gly)突變?yōu)槔i氨酸(val)，突變體命名為f384d/g314v。

23、在一種實(shí)施方式中，所述突變體是將第384位苯丙氨酸(phe)突變?yōu)樘於彼?asp)，并將第314位甘氨酸(gly)突變?yōu)樯彼?trp)，突變體命名為f384d/g314w。

24、在一種實(shí)施方式中，所述突變體是將第384位苯丙氨酸(phe)突變?yōu)槔i氨酸(val)，并將第314位甘氨酸(gly)突變?yōu)樯彼?trp)，突變體命名為f384e/g314v。

25、在一種實(shí)施方式中，所述突變體是將第384位苯丙氨酸(phe)突變?yōu)楣劝彼?glu)，并將第314位甘氨酸(gly)突變?yōu)樯彼?trp)，突變體命名為f384e/g314w。

26、本發(fā)明還提供編碼所述羊毛甾醇14α-去甲基化酶突變體的基因。

27、在一種實(shí)施方式中，編碼突變體a127s的核苷酸序列如seq?id?no.3所示；編碼突體a260k的核苷酸序列如seq?id?no.4所示；編碼突變體k352l的核苷酸序列如seq?id?no.5所示；編碼突變體g314v的核苷酸序列如seq?id?no.6所示；編碼突變體g314w的核苷酸序列如seq?id?no.7所示；編碼突變體f384d的核苷酸序列如seq?id?no.8所示；編碼突變體f384e的核苷酸序列如seq?id?no.9所示。

28、本發(fā)明還提供了提供攜帶所述基因的質(zhì)粒。

29、在一種實(shí)施方式中，所述重組質(zhì)粒以py26為出發(fā)質(zhì)粒。

30、本發(fā)明還提供了表達(dá)所述釀酒酵母羊毛甾醇14α-去甲基化酶突變體的重組微生物細(xì)胞。

31、在一種實(shí)施方式中，所述微生物為釀酒酵母。

32、在一種實(shí)施方式中，所述釀酒酵母以釀酒酵母cenpk2-1d為出發(fā)菌株。

33、在一種實(shí)施方式中，所述釀酒酵母是具有麥角甾醇合成能力的釀酒酵母。

34、在一種實(shí)施方式中，所述釀酒酵母為釀酒酵母wq6；所述釀酒酵母wq6及其構(gòu)建方法已公開(kāi)于公開(kāi)號(hào)為cn114606149a的專利申請(qǐng)文件中。

35、在一種實(shí)施方式中，所述釀酒酵母wq6是在釀酒酵母cenpk2-1d的基礎(chǔ)上，具有如下改進(jìn)：在基因組上gal2位點(diǎn)整合nadh-hmg1，在ty2位點(diǎn)多拷貝整合thmgr、idi1-leu2-degradation?tag，敲除ypl062w、rox1和nem1，在yjl064w位點(diǎn)整合erg4、erg11、erg1，在dos2位點(diǎn)整合erg2、erg3、ctt1、erg4在ty12位點(diǎn)多拷貝整合thmg1、idi1-sphis5deg；在ty3位點(diǎn)多拷貝整合pos5、erg4、erg2、erg3。

36、在一種實(shí)施方式中，所述重組微生物細(xì)胞是以釀酒酵母wq6為宿主，表達(dá)所述羊毛甾醇14α-去甲基化酶突變體，構(gòu)建獲得的釀酒酵母工程菌。

37、本發(fā)明還提供了提高釀酒酵母麥角甾醇產(chǎn)量的方法，所述方法是對(duì)釀酒酵母的羊毛甾醇14α-去甲基化酶氨基酸序列第127位、260位、352位、314位或384位的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)突變。

38、在一種實(shí)施方式中，所述方法是對(duì)羊毛甾醇14α-去甲基化酶進(jìn)行如下，提高釀酒酵母對(duì)羊毛甾醇14α-去甲基化酶的催化能力：

39、(1)將第127位丙氨酸突變?yōu)榻z氨酸；或

40、(2)將第260位丙氨酸突變?yōu)橘嚢彼幔换?/p>

41、(3)將第352位賴氨酸突變?yōu)榱涟彼?；?/p>

42、(4)將第314位甘氨酸突變?yōu)槔i氨酸；或

43、(5)將第314位甘氨酸突變?yōu)樯彼?；?/p>

44、(6)將第384位苯丙氨酸突變?yōu)樘於彼?；?/p>

45、(7)將第384位苯丙氨酸突變?yōu)楣劝彼幔换?/p>

46、(8)將第127位丙氨酸突變?yōu)榻z氨酸，并將第352位賴氨酸突變?yōu)榱涟彼幔换?/p>

47、(9)將第260位丙氨酸突變?yōu)橘嚢彼?，并將?52位賴氨酸突變?yōu)榱涟彼?；?/p>

48、(10)將第127位丙氨酸突變?yōu)榻z氨酸，并將第260位丙氨酸突變?yōu)橘嚢彼?；?/p>

49、(11)將第384位苯丙氨酸突變?yōu)樘於彼幔⒌?14位甘氨酸突變?yōu)槔i氨酸；或

50、(12)將第384位苯丙氨酸突變?yōu)樘於彼幔⒌?14位甘氨酸突變?yōu)樯彼?；?/p>

51、(13)將第384位苯丙氨酸突變?yōu)楣劝彼?，將?14位甘氨酸突變?yōu)槔i氨酸；或

52、(14)將第384位苯丙氨酸突變?yōu)楣劝彼?，將?14位甘氨酸突變?yōu)樯彼帷?/p>

53、在一種實(shí)施方式中，所述羊毛甾醇14α-去甲基化酶具有如seq?id?no.1所示的氨基酸序列。

54、本發(fā)明還提供了所述釀酒酵母工程菌在生產(chǎn)麥角甾醇中的應(yīng)用。

55、在一種實(shí)施方式中，所述應(yīng)用是將所述釀酒酵母工程菌株在培養(yǎng)基中發(fā)酵一段時(shí)間，收集麥角甾醇。

56、在一種實(shí)施方式中，所述培養(yǎng)基含有釀酒酵母生長(zhǎng)所需的碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽。

57、在一種實(shí)施方式中，所述培養(yǎng)基為ypd培養(yǎng)基。

58、在一種實(shí)施方式中，所述培養(yǎng)基含有葡萄糖、胰蛋白胨、酵母提取物、無(wú)機(jī)鹽；所述無(wú)機(jī)鹽包括鎂鹽和鐵鹽；可選地，鎂鹽為硫酸鎂，鐵鹽為硫酸鐵。

59、在一種實(shí)施方式中，發(fā)酵過(guò)程中控制ph為5.5±0.1。

60、在一種實(shí)施方式中，發(fā)酵過(guò)程中還進(jìn)行補(bǔ)料。

61、在一種實(shí)施方式中，發(fā)酵過(guò)程還補(bǔ)料葡萄糖和微量元素，以控制發(fā)酵體系中的殘?zhí)菫?.5g/l～1.5g/l，乙醇含量為5g/l～10g/l；所述微量元素包括但不限于金屬離子和/或維生素。

62、在一種實(shí)施方式中，發(fā)酵過(guò)程中還補(bǔ)料含無(wú)機(jī)氮源的補(bǔ)料培養(yǎng)基；所述無(wú)機(jī)氮源包括但不限于硫酸銨。

63、本發(fā)明還要求保護(hù)所述釀酒酵母羊毛甾醇14α-去甲基化酶突變體在食品、生物醫(yī)藥、化工、化妝品、飼料等行業(yè)中的應(yīng)用。

64、在一種實(shí)施方式中，所述應(yīng)用包括但不限于制備麥角甾醇或含麥角甾醇的產(chǎn)品。

65、有益效果：

66、(1)本發(fā)明以釀酒酵母(saccharomyces?cerevisiae?cenpk2-1d)中羊毛甾醇14α-去甲基化酶(erg11)為目標(biāo)，通過(guò)定點(diǎn)突變技術(shù)改造erg11氨基酸序列，獲得了催化能力提升的羊毛甾醇14α-去甲基化酶突變體a127s、a260k、k352l、g314v、g314w、f384d、f384e、f384d/g314w、f384e/g314v；

67、(2)本發(fā)明在釀酒酵母wq6中表達(dá)前述構(gòu)建的erg11突變體，并將構(gòu)建的菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，可使表達(dá)突變體a127s、a260k、k352l、g314v、g314w、f384d、f384e、f384d/g314w、f384e/g314v的重組菌株麥角甾醇產(chǎn)量達(dá)到645.0mg/l、625.8mg/l、677.9mg/l、622.7mg/l、620.1mg/l、682.8mg/l、733.8mg/l、623.9mg/l、536.1mg/l，分別較表達(dá)野生型羊毛甾醇14α-去甲基化酶菌株所產(chǎn)490.0mg/l提高了31.6％、27.7％、38.3％、27.1％、26.6％、39.3％、49.8％、27.3％、9.4％。

68、本發(fā)明利用酶工程技術(shù)改造釀酒酵母，使通過(guò)代謝工程手段改造的麥角甾醇產(chǎn)量得到進(jìn)一步提高。