本發(fā)明涉及核酸檢測，尤其涉及一種用于雙鏈dna的核酸檢測方法。

背景技術(shù)：

1、核酸的快速精確檢測在病原感染的臨床診斷中起著至關(guān)重要的作用。

2、現(xiàn)有的核酸檢測技術(shù)，如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)、dna微陣列和基因測序等技術(shù)，雖然能夠精確地檢測病原體dna，但他們存在一些問題，例如存在檢測耗時(shí)長、檢測費(fèi)用高以及需要復(fù)雜的儀器和專業(yè)的技術(shù)操作人員的問題。這些問題導(dǎo)致上述技術(shù)在資源有限的情況下或需要現(xiàn)場診斷的情況下難以實(shí)際應(yīng)用。

3、目前，已經(jīng)建立了一些可適用于現(xiàn)場檢測的核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，包括環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(lamp)、重組酶聚合酶擴(kuò)增(rpa)、指數(shù)擴(kuò)增(expar)和滾環(huán)擴(kuò)增(rca)。這些擴(kuò)增存在一些缺點(diǎn)，例如lamp，rpa擴(kuò)增存在引物二聚體以及氣溶膠污染，rca擴(kuò)增效率不高。其中expar的擴(kuò)增效率更高，擴(kuò)增速度更快，是理想的可應(yīng)用于現(xiàn)場檢測的核酸擴(kuò)增技術(shù)之一。有研究顯示，在單一溫度下，expar可以在幾分鐘內(nèi)產(chǎn)生多達(dá)108個(gè)的單鏈dna產(chǎn)物。然而，傳統(tǒng)的expar擴(kuò)增需要單鏈核酸片段來啟動(dòng)反應(yīng)，無法直接對雙鏈dna（例如基因組dna）進(jìn)行檢測。

4、crispr/cas?系統(tǒng)是目前發(fā)現(xiàn)存在于大多數(shù)細(xì)菌與所有古細(xì)菌中的一種免疫系統(tǒng)，用于抵抗外源物質(zhì)的入侵。crispr/cas系統(tǒng)（例如cas9、cas12）可以識(shí)別并剪切雙鏈dna。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了解決雙鏈dna的核酸檢測問題，特別是針對雙鏈dna的現(xiàn)場檢測問題，本發(fā)明提供了一種用于雙鏈dna的核酸檢測方法，其中，現(xiàn)場檢測對于高效、快速具有較高的要求。本發(fā)明通過pre-primer探針及cas12a/crrna系統(tǒng)的應(yīng)用，將雙鏈dna的擴(kuò)增與檢測，轉(zhuǎn)化為primer探針的指數(shù)擴(kuò)增與檢測，在primer探針的指數(shù)擴(kuò)增中，通過酶切刻、鏈延伸、鏈置換的不斷循環(huán)過程，產(chǎn)生大量的單鏈dna產(chǎn)物，然后該單鏈dna產(chǎn)物繼續(xù)循環(huán)擴(kuò)增，通過primer探針的指數(shù)擴(kuò)增可以更為穩(wěn)定地實(shí)現(xiàn)目標(biāo)檢測雙鏈dna的信號(hào)的指數(shù)放大。

2、本發(fā)明的具體技術(shù)方案為：

3、一方面，本發(fā)明提供了一種用于雙鏈dna的核酸檢測方法，包括以下步驟：

4、步驟s1：將待檢測對象與pre-primer探針、cas12a/crrna復(fù)合體混合均勻，孵育；

5、步驟s2：將孵育后得到的混合物加入expar擴(kuò)增反應(yīng)體系中，進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)；

6、步驟s3：將進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)后的混合物與檢測探針混合，進(jìn)行檢測顯色反應(yīng)；

7、其中：

8、所述pre-primer探針的序列為：5'-第一序列-第二序列-3'；所述第一序列為能抵御cas12/crrna剪切的短鏈rna堿基，所述rna堿基能作為dna聚合酶聚合延伸的引物；所述第二序列為能被激活的cas12/crrna剪切的dna堿基；所述pre-primer探針的3'末端為磷酸化修飾；

9、所述crrna的序列為：

10、uaauuucuacuaaguguagaunnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn，其中劃線部分為目標(biāo)檢測雙鏈dna的識(shí)別區(qū)域，根據(jù)目標(biāo)檢測雙鏈dna進(jìn)行設(shè)計(jì)，其長度根據(jù)目標(biāo)檢測雙鏈dna確定；

11、所述expar擴(kuò)增反應(yīng)體系中包括擴(kuò)增模板鏈、nt.bstnbi切刻內(nèi)切酶、bst?2.0?dna聚合酶，所述擴(kuò)增模板鏈的序列為：5'-?第三序列-gtgagactc-第三序列-3'，所述第三序列與第一序列能互補(bǔ)配對；

12、所述檢測探針的序列包括能與第一序列的expar擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物互補(bǔ)配對的序列段。

13、本發(fā)明通過pre-primer探針及cas12a/crrna系統(tǒng)的應(yīng)用，將雙鏈dna的擴(kuò)增與檢測，轉(zhuǎn)化為primer探針的指數(shù)擴(kuò)增與檢測，在primer探針的指數(shù)擴(kuò)增中，通過酶切刻、鏈延伸、鏈置換的不斷循環(huán)過程，產(chǎn)生大量的單鏈dna產(chǎn)物，然后該單鏈dna產(chǎn)物繼續(xù)循環(huán)擴(kuò)增，通過primer探針的指數(shù)擴(kuò)增可以更為穩(wěn)定地實(shí)現(xiàn)目標(biāo)檢測雙鏈dna的信號(hào)的指數(shù)放大。

14、具體而言，本發(fā)明通過上述步驟s1~s2，實(shí)現(xiàn)快速、靈敏地從待檢測對象中確定是否存在目標(biāo)檢測雙鏈dna。在靶標(biāo)dna存在的情況下，步驟s1中，cas12/crrna識(shí)別靶標(biāo)dna，并激活其trans切割能力，剪切pre-primer探針中脫氧核糖核酸的磷酸二酯鍵，產(chǎn)生成熟的primer探針。步驟s2中，這些成熟的primer探針可以與擴(kuò)增模板鏈雜交，在bst?dna聚合酶的作用下進(jìn)行鏈延伸形成新的雙鏈dna，nt.bstnbi切刻內(nèi)切酶可以識(shí)別該雙鏈dna上的酶切位點(diǎn)，產(chǎn)生切口，dna聚合酶又可以從切口處進(jìn)行鏈延伸與鏈置換，產(chǎn)生單鏈dna產(chǎn)物，單鏈dna產(chǎn)物又可以與另一個(gè)擴(kuò)增模板鏈雜交，啟動(dòng)新的擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)primer探針的指數(shù)擴(kuò)增，此為快速方法目標(biāo)檢測雙鏈dna存在信號(hào)的步驟。利用短小的primer探針的指數(shù)擴(kuò)增來放大目標(biāo)檢測雙鏈dna存在信號(hào)，相比于直接擴(kuò)增目標(biāo)檢測雙鏈dna，更為穩(wěn)定、快速。

15、經(jīng)典的rpa+cas12檢測技術(shù)，在設(shè)計(jì)expar擴(kuò)增模板序列時(shí)，要同時(shí)考慮3個(gè)問題：rpa引物的高效擴(kuò)增問題、rpa引物擴(kuò)增出的產(chǎn)物中是否包含crispr/cas12的pam識(shí)別位點(diǎn)的問題、識(shí)別位點(diǎn)的剪切效率問題。因此，rpa+cas12檢測技術(shù)經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)設(shè)計(jì)了高效的rpa引物，但高效的rpa引物擴(kuò)增出的產(chǎn)物不包含crispr/cas12的pam識(shí)別位點(diǎn)或者包含了crispr/cas12的pam識(shí)別位點(diǎn)但剪切活性低的問題。上述crrna的序列包含目標(biāo)檢測雙鏈dna的識(shí)別區(qū)域，該區(qū)域根據(jù)目標(biāo)檢測雙鏈dna進(jìn)行設(shè)計(jì)，該設(shè)計(jì)不需要考慮引物二聚體的問題，只需找到高效的crispr/cas12的pam識(shí)別位點(diǎn)即可。因此，相比于經(jīng)典的rpa+cas12檢測技術(shù)，本發(fā)明在更換不同的目標(biāo)檢測雙鏈dna時(shí)，更為簡單高效，可行性高。

16、作為優(yōu)選，步驟s1中，所述rna堿基為10~25bp。

17、進(jìn)一步優(yōu)選，所述rna堿基為：aggguaaaccaaaua。

18、作為優(yōu)選，步驟s1中，所述dna堿基為5~10?bp。

19、進(jìn)一步優(yōu)選，所述dna堿基為：ccccct。

20、作為優(yōu)選，步驟s1中，所述cas12a/crrna復(fù)合體為由cas12a蛋白和crrna按1:1摩爾比組合得到的復(fù)合體。

21、作為優(yōu)選，步驟s1中，所述孵育的條件為：30~40℃下，孵育10~120?min。

22、作為優(yōu)選，步驟s2中，所述expar擴(kuò)增反應(yīng)體系包括45~60nm的擴(kuò)增模板鏈、200~300?μm的dntp?mix?、0.5~1.0?u/μl的nt.bstnbi切刻內(nèi)切酶、0.2~1.0?u/μl的?bst?2.0dna?聚合酶、1~2μm?單鏈結(jié)合蛋白、1×isothermal?amplification?buffer?、0.25×nebuffer3.1?buffer。

23、作為優(yōu)選，步驟s2中，按照18%~24%（v/v）將孵育后得到的混合物加入expar擴(kuò)增反應(yīng)體系中。

24、作為優(yōu)選，步驟s2中，所述擴(kuò)增反應(yīng)的條件為：50~60℃下，反應(yīng)5~40?min。

25、作為優(yōu)選，步驟s3中，所述檢測探針的序列為：5'-?gtttaccctttttt-3'。

26、作為優(yōu)選，所述檢測顯色反應(yīng)為：

27、若待檢測對象中存在目標(biāo)檢測雙鏈dna，則混合后，第一序列的expar擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物與檢測探針互補(bǔ)配對，使發(fā)生顯色；

28、若待檢測對象中不存在目標(biāo)檢測雙鏈dna，則混合后，無法顯色。

29、顯色，可以通過一般現(xiàn)有技術(shù)實(shí)現(xiàn)。

30、步驟s3為：將進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)后的混合物滴加在檢測試紙條上，進(jìn)行試紙條檢測顯色反應(yīng)；

31、所述檢測試紙條的金標(biāo)墊上包埋納米金探針，所述納米金探針的探針序列為：5'-aaaaatggtatttgttttt-3'；所述檢測試紙條的金標(biāo)墊上設(shè)有檢測線，所述檢測線上固定有檢測線探針，檢測線探針序列為：5'-?gtttaccctttttt-3'；

32、若待檢測對象中存在目標(biāo)檢測雙鏈dna，則混合后，檢測線發(fā)生顯色；若待檢測對象中不存在目標(biāo)檢測雙鏈dna，則混合后，檢測線無法顯色。

33、具體地，本發(fā)明給出了一種更為準(zhǔn)確的顯色方法，具體為：將進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)后的混合物滴加到側(cè)向流層析試紙，通過顯色反應(yīng)來確定待檢測對象中是否含有目標(biāo)檢測雙鏈dna。在側(cè)向流層析試紙中，包括樣品墊、金標(biāo)墊、硝酸纖維素膜以及吸水墊。金標(biāo)墊包埋有納米金-標(biāo)記探針，納米金探針的探針序列為：5'-aaaaatggtatttgttttt-3'，硝酸纖維素膜上分別劃有檢測線和控制線，檢測線上含有生物素化修飾的檢測線捕獲探針，檢測線捕獲探針序列為5'-?gtttaccctttttt-3'，控制線上含有生物素化修飾的控制線捕獲探針，控制線捕獲探針的序列為5'-?tttttcaaatacca-3'。若待檢測對象中含有目標(biāo)檢測雙鏈dna，經(jīng)步驟s2，會(huì)產(chǎn)生大量的單鏈dna產(chǎn)物（primer探針擴(kuò)增產(chǎn)生），當(dāng)單鏈dna產(chǎn)物流經(jīng)金標(biāo)墊和硝酸纖維素膜時(shí)，將通過堿基互補(bǔ)配對同時(shí)與納米金-標(biāo)記探針、檢測線捕獲探針雜交，從而在檢測線上產(chǎn)生紅色條帶，游離的納米金-標(biāo)記探針可以與控制線捕獲探針雜交，在控制線上呈現(xiàn)紅色，從而出現(xiàn)2條紅色條帶。若待檢測對象中不含有目標(biāo)檢測雙鏈dna，cas12a/crrna的反式切割活性將被沉默，pre-primer探針不能被切割，無法產(chǎn)生成熟的primer探針，因此步驟s2無法啟動(dòng)指數(shù)信號(hào)擴(kuò)增，不產(chǎn)生上述單鏈dna產(chǎn)物，從而只出現(xiàn)游離的納米金-標(biāo)記探針與控制線捕獲探針雜交產(chǎn)生的紅色條帶。本發(fā)明提供的顯色方法利用堿基互補(bǔ)配對的原理，特異性高，且由于控制線的存在，準(zhǔn)確度高，并具有價(jià)格便宜、更易保存的優(yōu)勢。

34、另一方面，本發(fā)明提供了上述核酸檢測方法在雙鏈dna的檢測中的應(yīng)用。

35、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下技術(shù)效果：

36、（1）本發(fā)明通過pre-primer探針及cas12a/crrna系統(tǒng)的應(yīng)用，將雙鏈dna的擴(kuò)增與檢測，轉(zhuǎn)化為primer探針的指數(shù)擴(kuò)增與檢測，通過短小序列primer探針的指數(shù)擴(kuò)增可以更為穩(wěn)定、快速地實(shí)現(xiàn)目標(biāo)檢測雙鏈dna的信號(hào)的指數(shù)放大，從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)檢測雙鏈dna的快速、靈敏、準(zhǔn)確地檢測。現(xiàn)有技術(shù)多利用crispr/cas9剪切雙鏈dna產(chǎn)生dna片段，來激活expar擴(kuò)增放大檢測信號(hào)，從而達(dá)到檢測現(xiàn)場檢測雙鏈dna的目的，但該雙鏈dna的expar擴(kuò)增，在針對不同靶標(biāo)進(jìn)行檢測時(shí)，需要重新設(shè)計(jì)expar擴(kuò)增模板序列，這大大增加了設(shè)計(jì)的復(fù)雜程度。本發(fā)明在檢測不同的目標(biāo)檢測雙鏈dna時(shí)，不同的目標(biāo)檢測雙鏈dna的存在信號(hào)，均可以轉(zhuǎn)化為上述pre-primer探針的剪切產(chǎn)物——primer探針的存在信號(hào)，避免了expar擴(kuò)增模板序列的重新設(shè)計(jì)。

37、（2）本發(fā)明中涉及設(shè)計(jì)序列的操作，僅僅為crrna的序列中目標(biāo)檢測雙鏈dna的識(shí)別區(qū)域的設(shè)計(jì)，且該設(shè)計(jì)不需要考慮引物二聚體的問題，在更換不同的目標(biāo)檢測雙鏈dna時(shí)，只需找到對應(yīng)的高效的crispr/cas12的pam識(shí)別位點(diǎn)即可實(shí)現(xiàn)目標(biāo)檢測雙鏈dna信號(hào)的指數(shù)擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)信號(hào)的準(zhǔn)確、高效放大。而經(jīng)典的rpa+cas12檢測技術(shù)，在設(shè)計(jì)expar擴(kuò)增模板序列時(shí)，要同時(shí)考慮3個(gè)問題：rpa引物的高效擴(kuò)增問題、rpa引物擴(kuò)增出的產(chǎn)物中是否包含crispr/cas12的pam識(shí)別位點(diǎn)的問題、識(shí)別位點(diǎn)的剪切效率問題。因此，相比于經(jīng)典的rpa+cas12檢測技術(shù)，本發(fā)明在更換不同的目標(biāo)檢測雙鏈dna時(shí)，更為簡單高效，可行性高。