本發(fā)明屬于分子和細胞生物學、生物技術(shù)和醫(yī)學，尤其涉及一種基于慣性微流控技術(shù)的循環(huán)腫瘤細胞分選與富集芯片。

背景技術(shù)：

1、癌癥早期診斷和精準醫(yī)療的關(guān)鍵在于提高治療效果與改善患者預后。然而，早期診斷難度大，原因是早期腫瘤體積小、無明顯癥狀，且早篩可能需侵入性檢查，存在過度醫(yī)療風險。液體活檢技術(shù)，是通過檢測腫瘤標志物，為早期診斷和精準醫(yī)療提供新思路。該技術(shù)依賴循環(huán)腫瘤細胞(ctcs)和細胞游離核酸等指標。特別是ctcs，由于其細胞膜完整性和增殖能力，能提供豐富的腫瘤遺傳、轉(zhuǎn)錄和蛋白信息，是腫瘤診斷和治療評估的有效生物標志物。盡管ctcs液體活檢在臨床研究中具有價值，但其存在技術(shù)難題。ctcs在活檢樣本中稀缺，且可能在循環(huán)中經(jīng)歷上皮到間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，導致標志物(epcam)減少和間充質(zhì)表型出現(xiàn)，帶來表型異質(zhì)性。此外，雖然ctcs在細胞形態(tài)上存在變異，但與wbcs的大小差異小于5μm，降低了基于大小的分選和檢測效率。

2、在新的細胞分選理論和芯片制造工藝的推動下，近年來基于微流控技術(shù)的ctcs分選與富集儀器原型已成功研發(fā)并初步在生物科學研究和臨床診斷中得到應(yīng)用，其主要包括ce?l?l?search系統(tǒng)、parsort?ix細胞分選系統(tǒng)、c?l?earce?l?l?fx1系統(tǒng)以及vtx-1液體活檢系統(tǒng)。

3、ce?l?l?search系統(tǒng)，是一款基于免疫磁珠分選技術(shù)的循環(huán)腫瘤細胞(ctcs)檢測平臺。其工作機制是通過特異性抗體來識別并捕獲表達上皮細胞粘附分子(epcam)的ctcs。然而，ce?l?l?search系統(tǒng)也存在一些明顯的局限性。例如，其捕獲細胞的能力受限于epcam的表達，這將導致對非上皮型或經(jīng)歷表皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(emt)的ctcs捕獲不足，從而可能產(chǎn)生假陰性結(jié)果。此外，該系統(tǒng)的高昂成本以及對專業(yè)設(shè)備的依賴性，均限制了其在醫(yī)療機構(gòu)中的普及程度。ce?l?l?search系統(tǒng)基于抗體的捕獲方法也可能影響后續(xù)的生物特征分析，如基因表達。

4、parsort?i?x細胞分選系統(tǒng)是一款基于微流控芯片技術(shù)開發(fā)的液體活檢平臺，其通過細胞尺寸和可變形性將ctcs捕獲在parsort?i?x芯片內(nèi)。parsort?i?x系統(tǒng)的操作流程涵蓋了血液樣本的采集、樣本的無需預處理直接與設(shè)備連接以及系統(tǒng)的自動血液過濾過程。在此過程中，由于ctcs相對較大的尺寸和較低的可變形性，它們被有效地捕獲在parsort?i?x芯片中。然而，parsort?i?x系統(tǒng)的局限性在于濾選捕獲的ctcs需反向沖洗進行二次收集，該過程可能導致ctcs的數(shù)量損失和收集液的體積膨脹而不利于后續(xù)分析。此外，parsort?i?x系統(tǒng)目前僅供研究使用，不可用于診斷程序。

5、另一個成功商業(yè)化的微流控分選技術(shù)是vtx-1液體活檢系統(tǒng)，其核心原理是利用收縮-突擴結(jié)構(gòu)中產(chǎn)生的渦旋來分選和捕獲大尺寸細胞。該系統(tǒng)包含雙向收縮-突擴陣列結(jié)構(gòu)的微流體通道，設(shè)計用于從液體活檢樣本中高效分選并捕獲ctcs，并能夠以500μl/min的通量進行樣本處理，顯著提升了細胞的純度。盡管vtx-1系統(tǒng)在捕獲技術(shù)上具有一定優(yōu)勢，但在ctcs分選的靈敏度和特異性上仍面臨一些挑戰(zhàn)，尤其是在區(qū)分尺寸相近的腫瘤細胞與血細胞方面。

6、綜合現(xiàn)狀來看，目前市場上的商業(yè)化循環(huán)腫瘤細胞(ctcs)分選儀器存在顯著缺陷。一方面，如ce?l?l?search和l?i?qu?i?dbi?opsy等儀器在分選過程中的細胞損耗過大，導致細胞活性受損，難以用于后續(xù)的研究分析。另一方面，如parsort?i?x、vtx-1等，其芯片結(jié)構(gòu)設(shè)計復雜，操作難度大，且成本高昂，穩(wěn)定性欠佳。鑒于此，迫切需要一種新型芯片，能夠?qū)崿F(xiàn)循環(huán)腫瘤細胞的快速、便捷、精確分選與富集，同時具備低成本、高通量、高濃度等優(yōu)點。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、為解決上述問題，本發(fā)明公開了一種基于慣性微流控技術(shù)的循環(huán)腫瘤細胞分選與富集芯片，結(jié)構(gòu)簡單可靠且成本低廉，具有高通量、高精度特性的循環(huán)腫瘤細胞(ctcs)分選與富集芯片及其制備方法。

2、一種基于慣性微流控技術(shù)的循環(huán)腫瘤細胞分選與富集芯片，包括分選芯片，所述分選芯片由螺旋流道構(gòu)成；還包括富集所用濃縮芯片；其中分選芯片外出口處設(shè)有“y形”流道；濃縮芯片的一側(cè)通過粘接分選芯片的內(nèi)出口用于實現(xiàn)二者的垂直堆疊和連通；其富集所用濃縮芯片由三級寬度不同、高度相同的波浪形濃縮流道構(gòu)成，分別為一、二、三級濃縮流道。

3、進一步的，所述y形”流道包括外側(cè)出口和內(nèi)側(cè)出口；其中所述濃縮芯片與所述內(nèi)側(cè)出口連通，為了接收濃度還較低的循環(huán)腫瘤細胞液體進一步濃縮以達到要求。

4、進一步的，其中所述分選芯片的截面呈直角梯形。

5、由于ctcs與正常血細胞的物理量數(shù)值相當接近，造成兩者的聚焦平衡位置非常接近或部分重合，從而導致ctcs在現(xiàn)有的矩形螺旋流道中分選精度低下。

6、本芯片通過直角梯形截面誘導dean流不對稱分布，利用細胞慣性聚焦和dean渦流聚焦兩種模式間的位置邊界，從而實現(xiàn)ctcs與血細胞在流道截面上聚焦位置的分離。

7、進一步的，所述螺旋流道為六圈螺旋流道；所述螺旋流道的初始的螺旋內(nèi)徑設(shè)定為12mm，螺旋的間距為4mm，而六圈的最終的螺旋外徑為60mm；采用長邊為165μm，短邊為65μm的直角梯形的截面設(shè)計，流道的寬度統(tǒng)一設(shè)定為500μm。

8、進一步的，其中一、二、三級濃縮流道由三個非對稱正弦單元組成，流道高度均為100μm；一級濃縮流道的寬度為270μm，二級濃縮流道的寬度為150μm，三級濃縮流道的寬度為60μm；其中每個所述非對稱正弦單元每3個一組平行排列的濃縮流道構(gòu)成，其中一級濃縮流道、二級濃縮流道和三級濃縮流道的出料端均與短直流道連接。

9、進一步的，其中每個所述短直流道上均設(shè)有分級排出管道，每個所述分級排出管道均設(shè)有對稱的排出口，當含有循環(huán)腫瘤細胞的樣本溶液經(jīng)過螺旋分選芯片進入富集芯片后，隨著組織液不斷從分級排出管道流出，在三級濃縮流道的三級濃縮流道出口可以接收到預期濃度的循環(huán)腫瘤細胞。

10、進一步的，一種基于慣性微流控技術(shù)的循環(huán)腫瘤細胞分選與富集芯片的操作方法，包括以下步驟：

11、s21.將血液樣本通過化學裂解等方式去除大背景血細胞；

12、s22.為保證芯片效果，將樣本稀釋為總細胞濃度<7.5×105ce?l?l?s/ml的溶液；

13、s23.通過鈣黃綠素染色劑進行預染色，從而更方便區(qū)分循環(huán)腫瘤細胞和白細胞；

14、s24.使用注射泵以3000μl/min的流速將樣本送入芯片，等待適當時間后，從三級濃縮流道的三級濃縮流道出口接受樣本溶液，在顯微觀測中，腫瘤細胞在螢光激發(fā)下呈現(xiàn)紅色。

15、通過本發(fā)明的操作方法在顯微觀測中，腫瘤細胞在螢光激發(fā)下呈現(xiàn)紅色，進行預染色后再進行循環(huán)腫瘤細胞的分選與富集可以便于后續(xù)循環(huán)腫瘤細胞的單獨培養(yǎng)與特異性電阻抗檢測。

16、本發(fā)明的有益效果：

17、1.在完成細胞分選的過程中，本發(fā)明由于設(shè)計了六圈螺旋流道，其通過流體慣性升力與迪恩拽力之間的復合作用機理完成目標細胞與其他細胞的分離和富集，從而最大限度地發(fā)揮了微流控技術(shù)高通量、非標記的優(yōu)勢，并實現(xiàn)了對目標細胞高通量且高精度的分選以及富集。此外，由于設(shè)計了密封性很好的富集芯片，本發(fā)明能夠較好保持ctcs的活性以滿足后續(xù)的研究需求。

18、2.本發(fā)明通過細胞本身特性在流體中的不同表現(xiàn)實現(xiàn)細胞分離以及通過粒子聚焦等物理現(xiàn)象實現(xiàn)細胞富集的功能，展現(xiàn)了顯著的自動性和穩(wěn)定性，從而降低了芯片在實際應(yīng)用時對專業(yè)知識和操作技術(shù)的使用門檻。同時，高度密閉集成化的設(shè)備提高了該發(fā)明對外界環(huán)境干擾因素的抗性，也更方便進一步開發(fā)，與其他設(shè)備集成以開發(fā)更多樣化的功能。