本發(fā)明屬于微生物及發(fā)酵工程，具體涉及產(chǎn)透明質(zhì)酸的大腸桿菌基因工程菌及其構(gòu)建方法和應用。

背景技術(shù)：

1、本發(fā)明背景技術(shù)中公開的信息僅僅旨在增加對本發(fā)明的總體背景的理解，而不必然被視為承認或以任何形式暗示該信息構(gòu)成已經(jīng)成為本領(lǐng)域一般技術(shù)人員所公知的現(xiàn)有技術(shù)。

2、透明質(zhì)酸(hyaluronic?acid，ha)是一類重要的粘多糖，具有極佳的保濕效果和較高的安全性，因此被廣泛應用于醫(yī)療、化妝品、食品等多個領(lǐng)域，具有廣泛的應用價值。

3、透明質(zhì)酸的生產(chǎn)方法從最初的動物組織提取法發(fā)展到化學合成法和微生物發(fā)酵法。組織提取法是在不同的物種和組織中提取透明質(zhì)酸，如雞冠、人臍帶、眼睛玻璃體和關(guān)節(jié)滑液，但動物組織細胞中成分復雜，透明質(zhì)酸極易與蛋白質(zhì)、dna等大分子物質(zhì)聚集而造成難以分離，導致提取過程繁瑣，工藝復雜，成本高昂，且產(chǎn)物純度和質(zhì)量都受到極大的影響，這些因素限制了此法在透明質(zhì)酸生產(chǎn)中的應用?；瘜W合成法是通過化學反應合成透明質(zhì)酸，以d-葡萄糖醛酸和n-乙酰葡萄糖胺為原料，通過酸水解、縮聚反應和中和純化等步驟制備得到粗品，純化的透明質(zhì)酸通常還需要經(jīng)過進一步的處理步驟，如洗滌、干燥、粉碎等，這種方法通常需要較復雜的合成步驟和條件，且生產(chǎn)出的產(chǎn)物可能含有雜質(zhì)，不適合用于醫(yī)藥和美容領(lǐng)域。近些年合成生物學不斷得到發(fā)展，透明質(zhì)酸的合成機制也不斷得到解析，利用遺傳背景清晰、生物安全性高的微生物合成透明質(zhì)酸，已經(jīng)成為微生物發(fā)酵法合成透明質(zhì)酸的發(fā)展趨勢。透明質(zhì)酸的合成途徑已經(jīng)在大腸桿菌、乳桿菌、枯草芽孢桿菌和谷氨酸棒狀桿菌等較為安全的菌株中成功構(gòu)建和表征。目前常用的菌株是獸疫鏈球菌，至今該菌仍被廣泛的應用于生產(chǎn)透明質(zhì)酸產(chǎn)業(yè)中。然而，在利用獸疫鏈球菌發(fā)酵透明質(zhì)酸過程中存在許多不足，隨著透明質(zhì)酸含量的上升，發(fā)酵液的粘稠度會急劇增大而導致物料攪拌不均勻以及水中溶解氧的能力下降，導致菌體生長使用無氧呼吸。造成大量碳源的浪費，并合成大量的乳酸。乳酸的積累會對菌體生長及透明質(zhì)酸合成造成抑制。其次，在透明質(zhì)酸不斷合成過程中會大量的消耗菌體內(nèi)的udp-n-乙酰葡糖胺(udp-glcnac)以及udp-葡萄糖醛酸(udp-glca)。而這兩個物質(zhì)是微生物生長過程中必須的物質(zhì)。因此大量的合成透明質(zhì)酸會影響菌體的生長。最重要的是，獸疫鏈球菌存在內(nèi)毒素等致病因子能夠引起許多疾病而導致其在醫(yī)藥等領(lǐng)域的發(fā)展受到嚴重制約，嚴重影響多糖產(chǎn)品的安全健康及綠色環(huán)保。盡管近些年已經(jīng)在大腸桿菌、谷氨酸棒狀桿菌等較為安全的菌株中成功構(gòu)建和表征，但是其產(chǎn)量和生產(chǎn)成本仍然具有很大的提升空間。為改善獸疫鏈球菌合成透明質(zhì)酸的缺點，目前亟待尋找更加高產(chǎn)、環(huán)保、經(jīng)濟的生產(chǎn)技術(shù)和方法。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供產(chǎn)透明質(zhì)酸的大腸桿菌基因工程菌及其構(gòu)建方法和應用。具體的，本發(fā)明首次報道采用益生菌大腸桿菌escherichiacoli?nissle1917(ecn)為底盤菌進行ha的生物合成，同時也是首次采用“葡萄糖-木糖”雙碳源進行發(fā)酵，進一步節(jié)約了ha的生產(chǎn)成本，同時關(guān)鍵酶透明質(zhì)酸合酶的定向改造進一步提高了ha的產(chǎn)量?；谏鲜鲅芯砍晒?，從而完成本發(fā)明。

2、具體的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

3、本發(fā)明的第一個方面，提供一株產(chǎn)透明質(zhì)酸的大腸桿菌基因工程菌，所述大腸桿菌基因工程菌敲除底盤菌中的編碼磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的基因pck、編碼磷酸烯醇丙酮酸合成酶的基因ppsa、編碼丙酮酸激酶兩種同工酶的基因pyka和pykf、編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的基因ppc和編碼pts系統(tǒng)中關(guān)鍵組分eⅱcbglc的基因ptsg；編碼磷酸組氨酸搬運蛋白hpr的基因ptsi中的任意一種或多種，同時過表達透明質(zhì)酸合成途徑的關(guān)鍵基因；

4、其中，所述透明質(zhì)酸合成途徑的關(guān)鍵基因包括編碼udp-葡萄糖6-脫氫酶的基因ugda、編碼葡萄糖磷酸變位酶基因pgm、編碼乙酰葡萄糖胺焦磷酸化酶/葡萄糖-1-磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶雙功能酶的基因glmu、編碼葡萄糖-6-磷酸尿酰胺轉(zhuǎn)移酶的基因galu、編碼谷氨酰胺-果糖-6-磷酸氨基轉(zhuǎn)移酶的基因glms和編碼透明質(zhì)酸合酶的基因hasa中的任意一種或多種。

5、本發(fā)明的又一具體實施方式中，所述產(chǎn)透明質(zhì)酸的大腸桿菌基因工程菌為了規(guī)避細菌碳阻遏效應，進一步提高木糖利用率，過表達木糖的weimberg途徑中的d-木糖脫氫酶基因xylb和木糖內(nèi)酯酸酶基因xylc將木糖轉(zhuǎn)化為木酮糖；同時過表達木酮糖脫水酶編碼基因yjhg和醛縮酶編碼基因yjhh。

6、本發(fā)明的又一具體實施方式中，所述底盤菌為大腸桿菌，進一步為大腸桿菌escherichia?coli?nissle1917(ecn)。

7、本發(fā)明的又一具體實施方式中，所述透明質(zhì)酸合成途徑的關(guān)鍵基因中，編碼udp-葡萄糖6-脫氫酶的基因ugda、編碼葡萄糖磷酸變位酶基因pgm、編碼乙酰葡萄糖胺焦磷酸化酶/葡萄糖-1-磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶雙功能酶的基因glmu、編碼葡萄糖-6-磷酸尿酰胺轉(zhuǎn)移酶的基因galu和編碼谷氨酰胺-果糖-6-磷酸氨基轉(zhuǎn)移酶的基因glms來源于大腸桿菌escherichia?coli?mg1655；

8、編碼透明質(zhì)酸合酶的基因hasa來源于馬鏈球菌；進一步的，由于透明質(zhì)酸合成的關(guān)鍵酶是透明質(zhì)酸合酶，本發(fā)明進一步對其進行分子改造，篩選獲得能夠提高透明質(zhì)酸合酶穩(wěn)定的優(yōu)勢雙突變體sehasa(g38a&f304e)，從而進一步提高最終的透明質(zhì)酸產(chǎn)量。

9、本發(fā)明的第二個方面，提供上述大腸桿菌基因工程菌在發(fā)酵生產(chǎn)透明質(zhì)酸中的應用。

10、本發(fā)明的第三個方面，提供一種發(fā)酵生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法，所述方法包括：將上述大腸桿菌基因工程菌進行發(fā)酵培養(yǎng)，從而表達出透明質(zhì)酸；以及分離純化所述透明質(zhì)酸。

11、其中，發(fā)酵培養(yǎng)基中至少包含葡萄糖和木糖。

12、本發(fā)明的第四個方面，提供產(chǎn)透明質(zhì)酸的大腸桿菌基因工程菌的構(gòu)建方法，所述構(gòu)建方法包括：以大腸桿菌作為底盤菌，對所述底盤菌進行如下改造：

13、a)敲除底盤菌中的編碼磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的基因pck、編碼磷酸烯醇丙酮酸合成酶的基因ppsa、編碼丙酮酸激酶兩種同工酶的基因pyka和pykf、編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的基因ppc和編碼pts系統(tǒng)中關(guān)鍵組分eⅱcbglc的基因ptsg；編碼磷酸組氨酸搬運蛋白hpr的基因ptsi中的任意一種或多種；

14、b)過表達外源編碼udp-葡萄糖6-脫氫酶的基因ugda、編碼葡萄糖磷酸變位酶基因pgm、編碼乙酰葡萄糖胺焦磷酸化酶/葡萄糖-1-磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶雙功能酶的基因glmu、編碼葡萄糖-6-磷酸尿酰胺轉(zhuǎn)移酶的基因galu、編碼谷氨酰胺-果糖-6-磷酸氨基轉(zhuǎn)移酶的基因glms和編碼透明質(zhì)酸合酶的基因hasa中的任意一種或多種。

15、進一步的，所述構(gòu)建方法還包括過表達外源木糖的dahms途徑中的d-木糖脫氫酶基因xylb和木糖內(nèi)酯酸酶基因xylc；同時過表達底盤菌中木酮糖脫水酶編碼基因yjhg和醛縮酶編碼基因yjhh。

16、其中，所述d-木糖脫氫酶基因xylb和木糖內(nèi)酯酸酶基因xylc

17、編碼udp-葡萄糖6-脫氫酶的基因ugda、編碼葡萄糖磷酸變位酶基因pgm、編碼乙酰葡萄糖胺焦磷酸化酶/葡萄糖-1-磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶雙功能酶的基因glmu、編碼葡萄糖-6-磷酸尿酰胺轉(zhuǎn)移酶的基因galu和編碼谷氨酰胺-果糖-6-磷酸氨基轉(zhuǎn)移酶的基因glms來源于大腸桿菌escherichia?coli?mg1655；

18、編碼透明質(zhì)酸合酶的基因hasa來源于馬鏈球菌；進一步的，由于透明質(zhì)酸合成的關(guān)鍵酶是透明質(zhì)酸合酶，本發(fā)明進一步對其進行分子改造，篩選獲得能夠提高透明質(zhì)酸合酶穩(wěn)定的優(yōu)勢雙突變體sehasa(g38a&f304e)，從而進一步提高最終的透明質(zhì)酸產(chǎn)量。

19、本發(fā)明的第五個方面，提供上述大腸桿菌基因工程菌或發(fā)酵生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法在醫(yī)藥、化妝品以及食品等諸多領(lǐng)域中的應用。

20、上述一個或多個技術(shù)方案的有益技術(shù)效果：

21、上述技術(shù)方案首次采用益生菌為底盤進行ha的生物合成，同時也是首次采用“葡萄糖-木糖”雙碳源進行發(fā)酵，進一步節(jié)約了ha的生產(chǎn)成本，同時關(guān)鍵酶透明質(zhì)酸合酶的定向改造進一步提高了ha的產(chǎn)量。

22、上述技術(shù)方案將ha的合成方式轉(zhuǎn)變?yōu)榫G色、可持續(xù)的生產(chǎn)方式，具備環(huán)保、可持續(xù)、高效和清潔等特點，有望改變現(xiàn)有化學合成法高度依賴化石原料和“高污染、高排放”不可持續(xù)的工業(yè)制造格局，具有廣闊的市場前景。同時一系列富集碳代謝流的技術(shù)手段能夠帶來ha的產(chǎn)量提升、質(zhì)量改善、成本降低、產(chǎn)業(yè)發(fā)展和創(chuàng)新驅(qū)動等多方面的經(jīng)濟效益，促進ha生物合成產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展。