本發(fā)明涉及有機(jī)合成與分析檢測，具體涉及一種新型靶向近紅外熒光探針nfa-nir-cys及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、癌癥作為主要的公共衛(wèi)生問題之一，已經(jīng)嚴(yán)重威脅著人類的健康。早期發(fā)現(xiàn)和及時治療癌癥是迫切需要的。腫瘤標(biāo)記物是一種由腫瘤細(xì)胞直接產(chǎn)生或由非腫瘤細(xì)胞通過腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)的一種特征性物質(zhì)。生物硫醇不僅參與生理過程的調(diào)節(jié)，而且被認(rèn)為是腫瘤的標(biāo)志物。將腫瘤標(biāo)記物用于早期癌癥篩查具有實(shí)際意義。

2、半胱氨酸(cysteine，cys)屬于生物系統(tǒng)中的活性硫醇，是生物體生長過程中的一種常見氨基酸，它的分子結(jié)構(gòu)包含一個巰基，能夠參與到許多生理和病理變化中。半胱氨酸既可以維持體內(nèi)的氧化還原的穩(wěn)定，還可以調(diào)節(jié)細(xì)胞活性?；罴?xì)胞中半胱氨酸水平紊亂可導(dǎo)致一系列疾病，如皮膚損傷、肝損傷、水腫、嗜睡、心血管疾病和生長遲緩。與傳統(tǒng)的檢測方法相比，熒光探針具有優(yōu)良的生物相容性和較高的時空分辨率，主要由熒光團(tuán)和識別基團(tuán)組成，已被認(rèn)為是一種用于生物硫醇的新型檢測工具。鑒于cys在生理活動中的重要性，開發(fā)用于cys檢測的熒光探針一直是研究者關(guān)注的重點(diǎn)。

3、環(huán)氧合酶(cyclooxygenase，cox)或前列腺素內(nèi)過氧化物合酶(前列腺素h合酶)是由花生四烯酸合成前列腺素的重要酶。cox見于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的管腔側(cè)和核膜，而且存在于至少2種亞型中，即cox-1和cox-2。正常細(xì)胞中cox-2的表達(dá)水平很低，但cox-2可以被炎癥刺激及細(xì)胞因子和腫瘤生長因子誘導(dǎo)。cox-2在大量的人類腫瘤(原發(fā)和轉(zhuǎn)移)或癌細(xì)胞中表達(dá)，這些細(xì)胞可能在癌癥進(jìn)展中發(fā)揮作用，如增加癌細(xì)胞的增殖、細(xì)胞存活和腫瘤侵襲。cox-2可以作為幾種抗癌和非甾體抗炎藥化合物的靶點(diǎn)，這些化合物被廣泛用于抗炎目的。吲哚美辛(indomethacin，imc)是一種非甾體抗炎藥，被歸類為非選擇性cox-2抑制劑，因?yàn)樗部梢愿蓴_cox-1調(diào)節(jié)的穩(wěn)態(tài)功能，imc在cox-2上的結(jié)合通過可逆的競爭抑制發(fā)生。然而，當(dāng)優(yōu)化分子設(shè)計(jì)將imc與熒光染料進(jìn)行偶聯(lián)時，可以顯著提高它對cox-2的選擇性。最近，一些熒光團(tuán)連接的imc被報道為cox-2靶點(diǎn)。

4、目前已經(jīng)開發(fā)了一些特異性cys或cox-2檢測熒光探針，例如一種基于查爾酮熒光染料，用于檢測溶酶體中cys的熒光探針。該探針將嗎啉與查爾酮熒光團(tuán)結(jié)合，使其能夠靶向溶酶體。該探針在400nm激發(fā)下，加入cys后，在568nm的熒光顯著增強(qiáng)，而且出現(xiàn)較大的斯托克斯位移(168nm)，顏色由淺黃色變?yōu)槿庋劭梢姷牧咙S色。一種基于香豆素靶向cox-2的熒光探針，該探針含有二乙基氨基取代基產(chǎn)生電子效應(yīng)，當(dāng)探針在375nm處被激發(fā)時，發(fā)生分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移(intramolecular?charge?transfer，ict)，引起苯環(huán)的干涉直線，通過對電子電荷的“推拉”效應(yīng)形成共振狀態(tài)。通過采用熒光偏振法測定其解離常數(shù)(kd)的親和度，發(fā)現(xiàn)探針與cox-2有較強(qiáng)的結(jié)合親和力(kd＝0.007nmol/l)。通過研究探針對過表達(dá)cox-2的癌細(xì)胞的特異性，測定時間依賴性的細(xì)胞攝取，隨著時間的增加，藍(lán)色熒光信號增強(qiáng)，癌細(xì)胞的熒光強(qiáng)度比正常細(xì)胞高，可以區(qū)分兩種細(xì)胞。此外，在正常細(xì)胞中通過脂多糖(lipopolysaccharides，lps)誘導(dǎo)提高cox-2表達(dá)后，細(xì)胞內(nèi)熒光更亮，說明該化合物可能是監(jiān)測細(xì)胞炎癥的有用探針，對藥物開發(fā)有用。

5、但這些探針大多數(shù)的發(fā)射波長較短(<550nm)，不利于生命系統(tǒng)的熒光成像，而且靶向性不好。近紅外熒光探針，與傳統(tǒng)的熒光探針相比，它具有更高的信噪比、更深的組織穿透力、更高的空間分辨率和實(shí)時可視性等優(yōu)點(diǎn)。半菁染料作為花菁染料的不對稱類似物，具有長波長和優(yōu)異的成像能力，已成為一種潛在的熒光團(tuán)。此外，用于特異性識別和檢測細(xì)胞器的靶向探針仍是研究熱點(diǎn)。因此，開發(fā)能夠區(qū)分cys，同型半胱氨酸(homocysteine，hcy)和谷胱甘肽(glutathione，gsh)并特異性檢測它們的靶向探針的需求很高，具有實(shí)際應(yīng)用前景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了解決現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，本發(fā)明的目的是提供一種新型靶向近紅外熒光探針nfa-nir-cys及其制備方法與應(yīng)用，以解決現(xiàn)有探針發(fā)射波長較短，靈敏性不足，靶向性差的問題。

2、本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下：

3、提供一種紅外熒光探針，結(jié)構(gòu)式如下：

4、

5、上述熒光探針的制備方法，包括以下步驟：

6、(1)化合物2的合成：將氟尼酸(niflumic?acid，nfa)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(1-ethyl-(3-dimethylaminopropyl)carbonyldiimide，edci)，4-二甲氨基吡啶(4-dimethylaminopyridine，dmap)和化合物1溶解于溶劑中，攪拌，制得化合物2；

7、(2)化合物4的合成：在稀有氣體的保護(hù)下，將化合物3和n,n-二異丙基乙胺(n,n-diisopropylethylamine，dipea)溶解于溶劑中，攪拌，加入丙烯酰氯，再攪拌，制得化合物4；

8、(3)化合物5的合成：將1,1,2-三甲基-1h-苯并[e]吲哚和對甲苯磺酸丙炔酯混合反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后加入乙酸酐和化合物4，滴加哌啶，繼續(xù)反應(yīng)，制得化合物5；

9、(4)近紅外熒光分子探針nfa-nir-cys的合成：將化合物5，化合物2和碘化亞銅溶解于溶劑中，進(jìn)行反應(yīng)，制得；

10、上述制備方法的化學(xué)反應(yīng)式如下：

11、

12、進(jìn)一步地，上述溶劑包括：n,n-二甲基甲酰胺(n,n-dimethylformamide，dmf)。

13、進(jìn)一步地，步驟(1)中nfa，edci，dmap和化合物1的摩爾質(zhì)量比為1：2～4：0.5～1.5：0.5～1.5。

14、進(jìn)一步地，步驟(2)中化合物3，dipea和丙烯酰氯的摩爾質(zhì)量比為1：0.5～1.5：1.5～2.5。

15、進(jìn)一步地，步驟(3)中1,1,2-三甲基-1h-苯并[e]吲哚，對甲苯磺酸丙炔酯和化合物4的摩爾質(zhì)量比為1：2～3：0.5～1.5。

16、進(jìn)一步地，步驟(4)化合物5，化合物2和碘化亞銅的摩爾質(zhì)量比為1：2～4：1～3。

17、進(jìn)一步地，步驟(1)攪拌溫度為20～25℃，時間為10～15h。

18、進(jìn)一步地，步驟(2)中攪拌溫度為-2～4℃，時間為20～40min。

19、進(jìn)一步地，步驟(2)中再攪拌溫度為20～25℃，時間為8～12h。

20、進(jìn)一步地，步驟(3)中混合反應(yīng)溫度為40～60℃，時間為10～15h。

21、進(jìn)一步地，步驟(3)中繼續(xù)反應(yīng)溫度為50～70℃，時間為1～3h。

22、進(jìn)一步地，步驟(4)中反應(yīng)溫度為20～25℃，時間為8～12h。

23、上述近紅外熒光探針在靶向癌細(xì)胞成像試劑中的應(yīng)用。

24、一種靶向癌細(xì)胞熒光探針試劑盒，包括權(quán)利要求1所述近紅外熒光探針。

25、本發(fā)明具有以下有益效果：

26、(1)本發(fā)明制得的近紅外熒光探針響應(yīng)快速，檢測范圍寬，靈敏度高，可應(yīng)用于檢測細(xì)胞內(nèi)內(nèi)源性和外源性的cys變化，可以有效地將過表達(dá)cox-2的癌細(xì)胞與正常細(xì)胞區(qū)分開來。

27、(2)本發(fā)明具有近紅外熒光發(fā)射，可有效避免自吸收與生物背景熒光的干擾，可避免由于探針使用濃度、探針分布不均等導(dǎo)致的誤差。

28、(3)本發(fā)明的制備方法簡單，原料便宜易得，合成工藝簡單，產(chǎn)率高，適合規(guī)模化生產(chǎn)以及推廣運(yùn)用。