本發(fā)明涉及pcr檢測技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種檢測肺炎球菌10a血清型的試劑盒及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

肺炎鏈球菌是一種常見的人類致病菌，是發(fā)展中國家和發(fā)達(dá)國家各個(gè)年齡組人群獲得性肺炎最常見病因，同時(shí)也是引起中耳炎、肺炎、腦膜炎和敗血癥等疾病的主要致病菌。肺炎球菌屬于革蘭氏陽性菌，呈單球或雙球排列，無鞭毛，芽孢，有莢膜，且不同型別的莢膜厚度有所不同。肺炎球菌的莢膜是其毒力的必要條件，并且莢膜多糖有群/型特異性，是肺炎球菌分群/型的基礎(chǔ)。迄今為止肺炎球菌可分為46個(gè)群，90多個(gè)血清型，引起疾病的肺炎球菌型別常因地區(qū)、年代和人群的不同而不同。

針對肺炎球菌中引起疾病的20多個(gè)主要血清型,目前都以提純的莢膜多糖制成疫苗,并根據(jù)who規(guī)程確定疫苗所包含的的血清型,主要為1、2、3、4、5、6b、7f、8、9n、9v、10a、11a、12f、14、15b、17f、18c、19a、19f、20、22f、23f和33f,即23價(jià)肺炎球菌多糖疫苗。這23個(gè)血清型對美國、法國、中國等常見血清型的覆蓋率均在85％以上,可作為全球普遍使用的疫苗。已有實(shí)驗(yàn)證明23價(jià)肺炎球菌多糖疫苗對控制和預(yù)防肺炎球菌感染，特別是老年人肺部感染,兒童中耳炎和腦膜炎有明顯的效果。

23價(jià)肺炎球菌多糖疫苗生產(chǎn)用菌種的檢定主要通過肺炎球菌的培養(yǎng)特性，革蘭氏染色，奧普脫欣，膽汁溶解，生化反應(yīng)等實(shí)驗(yàn)完成。而菌種的分型常用的方法是血清凝集和莢膜腫脹實(shí)驗(yàn)，并且莢膜腫脹實(shí)驗(yàn)也稱為肺炎球菌分型的金標(biāo)準(zhǔn)。但血清凝集和莢膜腫脹實(shí)驗(yàn)所用標(biāo)準(zhǔn)血清費(fèi)用昂貴，并且專業(yè)技術(shù)要求高，對結(jié)果的解釋帶有一定的主觀性，成為制約血清學(xué)分型技術(shù)普及應(yīng)用的巨大障礙。此外，對于多種血清型共同攜帶的現(xiàn)象，莢膜腫脹實(shí)驗(yàn)只能識別其中的優(yōu)勢血清型，而無法同時(shí)識別多種血清型。

隨著肺炎球菌基因序列的不斷完善和豐富以及分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，一些針對肺炎球菌血清型分型的pcr試驗(yàn)方法已經(jīng)建立起來(吳麗娟，鄒建話，劉小月，等.多重pcr檢測肺炎鏈球菌血清型方法及臨床應(yīng)用,微循環(huán)學(xué)雜志,2012,22(4):43-45)。rekhapai等人針對常見的29個(gè)血清型的肺炎球菌建立了多重pcr試驗(yàn)方法，同時(shí)涵蓋了7價(jià)多糖結(jié)合疫苗所包含的血清型(pair,gertzre,beallb.sequential.multiplexpcrapproachfordeterminingcapsularserotypesofstreptococcuspneumoniaeisolates.clinmicrobiol,2006,44(1):124-131.)。fatmafilizcoskun-ari等人建立了針對13價(jià)肺炎球菌多糖結(jié)合疫苗的多重pcr診斷方法(cooskun-arif,guldemird,durmazr.one-stepmultiplexpcrassayfordetectingstreptococcuspneumoniaserogroups/typescoveredby13-valentpneumococcalconjugatevaccine(pcv13).plosone；2012,7(12),e50406.)。國內(nèi)研究者也進(jìn)行了相關(guān)研究，例如李馬超等為了了解成都兒童臨床肺炎患者中分離的肺炎鏈球菌血清型/群的分布狀況，也根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的引物建立了包含12個(gè)血清型的快速檢測的pcr方法，可用于鑒別人群中主要流行的肺炎鏈球菌血清型/群(李馬超，張礪，李倩，等.肺炎鏈球菌pcr分型技術(shù)的建立與應(yīng)用.中華流行病學(xué)雜志,2010,31(3):316-320)，但是只覆蓋了23價(jià)肺炎球菌多糖疫苗全部血清型的52.17％。而鐘天鷹等也根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，對18個(gè)常見血清型的肺炎球菌建立了多重pcr檢測方法(鐘天鷹，徐飛，陳倩,等.與肺炎鏈球菌血清型一致的pcr分型法的初步建立.臨床檢驗(yàn)雜志，2012,30(1):29-30)。但是，其建立的方法中所引用的10a型引物并不能擴(kuò)增出預(yù)期大小的特異性片段，且只覆蓋了23價(jià)肺炎球菌多糖疫苗所包含的23個(gè)血清型的72.26％。

綜上所述，國內(nèi)外報(bào)道的10a型引物并不能特異性的擴(kuò)增出預(yù)期大小的片段。目前，還沒有全部覆蓋23價(jià)肺炎球菌多糖疫苗所包含的23個(gè)血清型的一步法多重pcr分型方法，也沒有針對23價(jià)肺炎球菌多糖疫苗生產(chǎn)用菌種進(jìn)行快速檢測和分子分型的檢定方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種特異性檢測肺炎球菌10a血清型的特異性引物對。

本發(fā)明的另一目的在于提供檢測23價(jià)肺炎球菌多糖疫苗所包含的23個(gè)血清型的多重pcr分型方法。

本發(fā)明首先提供了一種檢測肺炎球菌10a血清型的特異性引物對，其核苷酸序列如seqidno.1-2所示。

本發(fā)明提供了上述特異性引物對在檢測肺炎球菌10a血清型中的應(yīng)用。尤其是在檢測疫苗中肺炎球菌10a血清型中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了上述特異性引物對在肺炎球菌疫苗生產(chǎn)質(zhì)控中的應(yīng)用。

含有seqidno.1-2所示特異性引物對的試劑盒屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

進(jìn)一步第，本發(fā)明試劑盒工作程序包括以下步驟：

(1)提取待測樣品的基因組dna；

(2)用seqidno.1-2所示特異性引物對，對樣品dna進(jìn)行pcr反應(yīng)；pcr產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測，若目的產(chǎn)物的片段大小為607bp，則待測樣品中含有肺炎球菌10a血清型。

所述pcr反應(yīng)，反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃45s，55℃45s，72℃90s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。

本發(fā)明提供了一種檢測疫苗中肺炎球菌10a血清型的方法，包括以下步驟：

(1)提取待測樣品的基因組dna；

(2)用seqidno.1-2所示的特異性引物對，對樣品dna進(jìn)行pcr反應(yīng)；pcr產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測，若目的產(chǎn)物的片段大小為607bp，則待測樣品中含有肺炎球菌10a血清型。

本發(fā)明提供了一種檢測23價(jià)肺炎球菌血清型的試劑盒，含有seqidno.1-2所示的特異性引物對，所述23價(jià)肺炎球菌血清型分別為1、2、3、4、5、6b、7f、8、9n、9v、10a、11a、12f、14、15b、17f、18c、19a、19f、20、22f、23f和33f。

進(jìn)一步地，上述檢測23價(jià)肺炎球菌血清型的試劑盒含有6組特異性引物組合，分別為a、b、c、d、e、f組，

其中a組含有的特異性引物對核苷酸序列分別如seqidno.3-12所示；

其中b組含有的特異性引物對核苷酸序列分別如seqidno.11-20所示；

其中c組含有的特異性引物對核苷酸序列分別如seqidno.11-12和seqidno.21-28所示；

其中d組含有的特異性引物對核苷酸序列分別如seqidno.11-12和seqidno.29-36所示；

其中e組含有的特異性引物對核苷酸序列分別如seqidno.1-2、seqidno.11-12和seqidno.37-42所示；

其中f組含有的特異性引物對核苷酸序列分別如seqidno.11-12和seqidno.43-48所示。

本發(fā)明提供一種用于檢測23價(jià)肺炎球菌血清型的特異性引物組合，含有24對特異性引物對，其核苷酸序列分別如seqidno.1-48所示。

本發(fā)明提供一種針對23價(jià)肺炎球菌多糖疫苗所包含的23個(gè)血清型的多重pcr分型方法，根據(jù)pcr擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小的不同，將23個(gè)血清型的特異性引物，配成6組復(fù)合引物，每組均含有陽性對照引物cpsa。利用6組復(fù)合引物對23價(jià)肺炎球菌多糖疫苗生產(chǎn)用的菌種進(jìn)多重pcr擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增片段大小的不同對23個(gè)血清型進(jìn)行分型，對這23個(gè)血清型肺炎球菌菌種的性質(zhì)和純度進(jìn)行特異性的鑒別。

本發(fā)明提供了上述特異性引物組合在肺炎球菌疫苗生產(chǎn)質(zhì)控中的應(yīng)用。

本發(fā)明的有益效果在于，本發(fā)明首先彌補(bǔ)了現(xiàn)有技術(shù)中沒有檢測肺炎球菌10a血清型的技術(shù)空白，基于本發(fā)明提供的檢測肺炎球菌10a血清型特異性引物對，本發(fā)明提供了一種針對23價(jià)肺炎球菌多糖疫苗生產(chǎn)用菌種快速檢測和菌株鑒定的多重pcr引物組合及基于一步法多重pcr技術(shù)的分子分型方法，該方法具有經(jīng)濟(jì)、便捷、快速和可靠等優(yōu)點(diǎn)，可用于生產(chǎn)用菌種庫的檢定和生產(chǎn)中污染的監(jiān)測，填補(bǔ)了該領(lǐng)域的空白。本發(fā)明方法操作簡單便捷，只需一次pcr反應(yīng)即可完成一個(gè)血清型的檢測；經(jīng)濟(jì)性好，相對于莢膜腫脹實(shí)驗(yàn)費(fèi)用比較低，較容易實(shí)現(xiàn)；本發(fā)明方法敏感性和特異性好，能排除主觀因素影響，結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠，較生理生化的檢測方法有很大的優(yōu)越性。

附圖說明

圖1為：10a型引物特異性試驗(yàn)電泳圖。

圖2為：參考文獻(xiàn)中現(xiàn)有10a型引物擴(kuò)增電泳圖，m為dnamarker:dl2000；a、b、c、d、e、f代表引物組，“陰”代表陰性對照。

圖3為：針對同樣的靶基因設(shè)計(jì)的10a型引物10a(1)擴(kuò)增電泳圖，m為dnamarker:dl2000；a、b、c、d、e、f代表引物組，“陰”代表陰性對照。

圖4為：針對同樣的靶基因設(shè)計(jì)的10a型引物10a(2)擴(kuò)增電泳圖，m為dnamarker:dl2000；a、b、c、d、e、f代表引物組，“陰”代表陰性對照。

圖5為：a組引物擴(kuò)增電泳圖。

圖6為：b組引物擴(kuò)增電泳圖。

圖7為：c組引物擴(kuò)增電泳圖。

圖8為：d組引物擴(kuò)增電泳圖。

圖9為：e組引物擴(kuò)增電泳圖。

圖10為：f組引物擴(kuò)增電泳圖。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。

若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段；若未特別指明，實(shí)施例中所用試劑均為市售。

實(shí)施例1肺炎球菌10a特異性引物的設(shè)計(jì)

肺炎球菌基因組中dexb與alia基因之間的cps基因?yàn)榉窝浊蚓逍拖嚓P(guān)的基因，不同血清型的cps基因組結(jié)構(gòu)和組成不同，bently等已完成90種血清型肺炎球菌的cps基因組序列的測定，并公開在網(wǎng)站上http://www.sanger.ac.uk(bentlysd,aanensendm,mavroidia,etal.geneticanalysisofthecapsularbiosyntheticlocusfromall90pneumococcalserotypes.plosgenet,2006,2(3):e31)。下載其中23個(gè)血清型的cps基因組序列，通過dnastar軟件將10a型與其他各型基因組的cps基因組序列進(jìn)行比對，針對其基因組中型特異性的區(qū)域設(shè)計(jì)一對特異性的引物，引物序列為：

10a-f:ccagtgcaatacattccaatgtcattctcg(seqidno.1)

10a-r:aaatcatttggggcatctgttatcggtgaa(seqidno.2)

使用10a型特異性引物對已制備的1、2、3、4、5、6b、7f、8、9n、9v、10a、11a、12f、14、15b、17f、18c、19a、19f、20、22f、23f、33f型dna模板進(jìn)行單一pcr擴(kuò)增，反應(yīng)體系為25ul：dna模板3ul，2.5mmdntpmixture2ul，takaralataqdna聚合酶0.5ul，10xpcrbuffer5ul，10a型上下游引物各2ul，滅菌的純水補(bǔ)足25ul。pcr擴(kuò)增程序?yàn)椋?1)預(yù)變性95℃，5min；(2)變性94℃，45s；(3)退火55℃45s；(4)延伸72℃90s；(5)回到(2)共30個(gè)循環(huán)；(6)72℃10min。取擴(kuò)增產(chǎn)物以1.5％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，成像分析結(jié)果。

結(jié)果如圖1所示：m為dnamarker:dl2000，1、2、3、4、5、6b、7f、8、9n、9v、10a、11a、12f、14、15b、17f、18c、19a、19f、20、22f、23f、33f代表23個(gè)肺炎球菌血清型。由圖1可以看出只有作為陽性對照的10a型肺炎球菌擴(kuò)增出大小為607bp的特異性目的條帶，其余22個(gè)血清型均未見任何條帶，表明10a型引物有良好的特異性，對23個(gè)血清型的肺炎球菌均無任何非特異性擴(kuò)增。

現(xiàn)有技術(shù)中所提供的針對10a型特異性引物序列為：

10a-f:ggtgtagatttaccattagtgtcggcagac(seqidno.49)

10a-r:gaatttcttctttaagattcggatatttctc(seqidno.50)

除了seqidno.1-2，發(fā)明人針對相同的靶基因還設(shè)計(jì)了另外兩對引物：

10a(1)-f:cacggctgagatgttggataatatggaaac(seqidno.51)

10a(1)-r:tgccctgattgtggaagtctaatgaagaaa(seqidno.52)

10a(2)-f:aaaggcgaaagaacacttggaacaaacagg(seqidno.53)

10a(2)-r:cctcactcctaccagaaacttgccacatcc(seqidno.54)

但經(jīng)過試驗(yàn)后，發(fā)現(xiàn)這3對引物放入擴(kuò)增效果均不理想，均未能擴(kuò)增出預(yù)期的目的片段；如圖2所示結(jié)果表明現(xiàn)有技術(shù)所提供的10a型特異性引物(seqidno.49-50)未能擴(kuò)增出預(yù)期的目的片段；如圖3所示結(jié)果表明針對同樣的靶基因設(shè)計(jì)的特異性引物(seqidno.51-52)未能擴(kuò)增出預(yù)期的目的片段；如圖4所示結(jié)果表明針對同樣的靶基因設(shè)計(jì)的特異性引物(seqidno.53-54)未能擴(kuò)增出預(yù)期的目的片段。

實(shí)施例2檢測肺炎球菌23價(jià)血清型的多重pcr檢測體系的建立

1、多重pcr復(fù)合引物組合設(shè)計(jì)和配制

根據(jù)23對引物擴(kuò)增目的片段大小的不同，將其進(jìn)行優(yōu)化組合，使各組內(nèi)引物的擴(kuò)增片段大小均相差100bp左右，電泳結(jié)果更加直觀，能夠直接根據(jù)擴(kuò)增片段大小的不同區(qū)分出不同的血清型。然后，分別取相應(yīng)的引物配制成6組復(fù)合引物a、b、c、d、e、f，同時(shí)每組復(fù)合引物中含有陽性對照引物cpsa，其引物序列為:

seqidno11：gcagtacagcagtttgttggactgacc

seqidno12：gaatattttcattatcagtcccagtc

各組引物所包含的血清型、擴(kuò)增長度、各型引物終濃度等詳細(xì)參數(shù)見表1：

表1

2、用復(fù)合引物組對制備好的dna模板進(jìn)行多重pcr擴(kuò)增

以制備好的23個(gè)血清型的肺炎球菌基因組dna為模板，用6組復(fù)合引物配制成6組pcr反應(yīng)體系a、b、c、d、e、f，各組內(nèi)的cpsa引物作為陽性對照，針對所有血清型均能擴(kuò)增出160bp的片段；n組為陰性對照組，使用純水作為模板，其余組分同其他各組。配制好7組pcr體系后，在同一擴(kuò)增條件下進(jìn)行多重pcr擴(kuò)增。pcr反應(yīng)體系為25ul：dna模板3ul，dntpmixture(2.5mm)2ul，takaralataqdna聚合酶0.5ul，10xpcrbuffer5ul，復(fù)合引物各2ul，滅菌的純水補(bǔ)足25ul。pcr擴(kuò)增程序?yàn)椋?1)預(yù)變性95℃，5min；(2)變性94℃，45s；(3)退火55℃45s；(4)延伸72℃90s；(5)回到(2)共30個(gè)循環(huán)；(6)72℃10min。取pcr產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳，成像分析結(jié)果。

結(jié)果見圖5-圖10：m為dnamarker:dl2000；n為陰性對照；a、b、c、d、e、f為各復(fù)合引物組；1、2、3、4、5、6b、7f、8、9n、9v、10a、11a、12f、14、15b、17f、18c、19a、19f、20、22f、23f、33f代表23個(gè)血清型肺炎球菌。

如圖5所示：a組所包含的4個(gè)血清型19f、23f、20、7f分別擴(kuò)增出清晰的大小不同的目的條帶，19f、23f、20、7f擴(kuò)增片段依次增大。

如圖6所示：b組所包含的4個(gè)血清型8、2、9n、9v分別擴(kuò)增出清晰的大小不同的目的條帶，8、2、9n、9v擴(kuò)增片段依次增大。

如圖7所示：c組所包含的4個(gè)血清型1、3、15b、17f分別擴(kuò)增出清晰的大小不同的目的條帶，1、3、15b、17f擴(kuò)增片段依次增大。

如圖8所示：d組所包含的4個(gè)血清型6b、12f、19a、22f分別擴(kuò)增出清晰的大小不同的目的條帶，6b、12f、19a、22f擴(kuò)增片段依次增大。

如圖9所示：e組所包含的4個(gè)血清型14、5、11a、10a分別擴(kuò)增出清晰的大小不同的目的條帶，14、5、11a、10a擴(kuò)增片段依次增大。

如圖10所示：f組所包含的3個(gè)血清型33f、4、18c分別擴(kuò)增出清晰的大小不同的目的條帶，33f、4、18c擴(kuò)增片段依次增大。

每個(gè)血清型的肺炎球菌均在自己相應(yīng)的引物組內(nèi)擴(kuò)增出大小不同的目的條帶，同時(shí)各組均擴(kuò)增出大小為160bp的陽性對照條帶，陰性對照組無條帶擴(kuò)增。表明該方法可以對23個(gè)血清型的肺炎球菌進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的鑒定分型，并且能夠?qū)@23個(gè)血清型肺炎球菌菌種的性質(zhì)和純度進(jìn)行檢定，為肺炎球菌菌種的檢定提供分子生物學(xué)依據(jù)。

實(shí)施例3對發(fā)酵罐上取樣的發(fā)酵液進(jìn)行多重pcr擴(kuò)增

采用實(shí)施例2建立的方法對發(fā)酵罐上的發(fā)酵的23個(gè)血清型的肺炎球菌發(fā)酵液進(jìn)行pcr擴(kuò)增，檢測在發(fā)酵過程中各型之間有沒交叉污染，由于在發(fā)酵過程中，產(chǎn)生的一些多糖和蛋白會對pcr擴(kuò)增產(chǎn)生一些干擾，所以在進(jìn)行pcr之前，采用康維試劑公司的細(xì)菌基因組提取試劑盒對各型發(fā)酵液按照說明書進(jìn)行基因組的提取，制備成純度較高的模板后再進(jìn)行pcr擴(kuò)增。

以提取的各型發(fā)酵液的基因組dna為模板，用a、b、c、d、e、f組6組復(fù)合引物對每個(gè)型進(jìn)行pcr擴(kuò)增，n組為陰性對照。pcr反應(yīng)體系為25ul：dna模板3ul，dntpmixture(2.5mm)2ul，takaralataqdna聚合酶0.5ul，10xpcrbuffer5ul，復(fù)合引物各2ul，滅菌的純水補(bǔ)足25ul。pcr擴(kuò)增程序?yàn)椋?1)預(yù)變性95℃，5min；(2)變性94℃，45s；(3)退火55℃45s；(4)延伸72℃90s；(5)回到(2)共30個(gè)循環(huán)；(6)72℃10min。取pcr產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳，成像分析結(jié)果。

發(fā)酵罐上的發(fā)酵的23個(gè)血清型的發(fā)酵液在經(jīng)過基因組dna提取后，均在自己相應(yīng)的引物組內(nèi)擴(kuò)增出與目的片段大小相同的條帶，而其他引物組內(nèi)未見非特異性的目的條帶擴(kuò)增。該實(shí)施例表明此發(fā)明可以對發(fā)酵罐上的肺炎球菌發(fā)酵液進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的pcr檢測，能夠檢測出不同血清型的肺炎球菌在發(fā)酵過程中相互之間有無交叉污染，為肺炎球菌的發(fā)酵過程提供一個(gè)分子生物學(xué)的監(jiān)測手段。.

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。

序列表

<110>北京華安科創(chuàng)生物技術(shù)有限公司

<120>一種檢測肺炎球菌10a血清型的試劑盒

<130>khp171113852.9

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<210>5

<211>31

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

gagcaagagtttttcacctgacagcgagaag31

<210>6

<211>33

<212>dna

<213>人工序列

<400>6

ctaaattcctgtaatttagctaaaactcttatc33

<210>7

<211>32

<212>dna

<213>人工序列

<400>7

gtaacagttgctgtagagggaattggcttttc32

<210>8

<211>33

<212>dna

<213>人工序列

<400>8

cacaacacctaacacacgatggctatatgattc33

<210>9

<211>31

<212>dna

<213>人工序列

<400>9

gttaagattgctgatcgattaattgatatcc31

<210>10

<211>30

<212>dna

<213>人工序列

<400>10

gagcagtcaataagatgagacgatagttag30

<210>11

<211>27

<212>dna

<213>人工序列

<400>11

gcagtacagcagtttgttggactgacc27

<210>12

<211>26

<212>dna

<213>人工序列

<400>12

gaatattttcattatcagtcccagtc26

<210>13

<211>32

<212>dna

<213>人工序列

<400>13

cttcgttagttaaaattctaaatttttctaag32

<210>14

<211>28

<212>dna

<213>人工序列

<400>14

gtcccaataccagtccttgcaacacaag28

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<211>27

<212>dna

<213>人工序列

<400>15

gaactgaataagtcagatttaatcagc27

<210>16

<211>26

<212>dna

<213>人工序列

<400>16

accaagatcctgacgggctaatcaat26

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<211>32

<212>dna

<213>人工序列

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gtcattgttacgattagtttcgatagttgagg32

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<211>32

<212>dna

<213>人工序列

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aattcaattcctaagtcctcttccataaactc32

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<211>31

<212>dna

<213>人工序列

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gatgccatgaatcaagcagtggctataaatc31

<210>20

<211>30

<212>dna

<213>人工序列

<400>20

atcctcgtgtataatttcaggtatgccacc30

<210>21

<211>33

<212>dna

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ttcgtgatgataattccaatgatcaaacaagag33

<210>22

<211>32

<212>dna

<213>人工序列

<400>22

gatgtaacaaatttgtagcgactaaggtctgc32

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<212>dna

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ttggaattttttaattagtggcttaccta29

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<211>31

<212>dna

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catccgcttattaattgaagtaatctgaacc31

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<211>31

<212>dna

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atggtgtgatttctcctagattggaaagtag31

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<211>31

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cttctccaattgcttaccaagtgcaataacg31

<210>27

<211>32

<212>dna

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ctctatagaatggagtatataaactatggtta32

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<211>34

<212>dna

<213>人工序列

<400>28

ccaaagaaaatactaacattatcacaatattggc34

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<211>32

<212>dna

<213>人工序列

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gagtatagccagattatggcagttttattgtc32

<210>30

<211>32

<212>dna

<213>人工序列

<400>30

ctccagcacttgcgctggaaacaacagacaac32

<210>31

<211>32

<212>dna

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gttagtcctgttttagatttatttggtgatgt32

<210>32

<211>30

<212>dna

<213>人工序列

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gagcagtcaataagatgagacgatagttag30

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<212>dna

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<212>dna

<213>人工序列

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ggacatgttcaggtgatttcccaatatagtg31

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<212>dna

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<212>dna

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<212>dna

<213>人工序列

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gctcgataaacataatcaatatttgaaaaagtatg35

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cttggcgcaggtgtcagaattccctctac29

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<211>31

<212>dna

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cttaatagctctcattattctttttttaagcc32

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ttatctgtaaaccatatcagcatctgaaac30

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