本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一種用于檢測新生兒軟骨發(fā)育不全(achondroplasia，ach)與軟骨發(fā)育低下(hypochondroplasia，hch)相關(guān)基因突變的檢測方法和產(chǎn)品。具體而言是利用整合的多重pcr技術(shù)、單堿基延伸技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)，來檢測孕婦外周血漿游離dna中胎兒fgfr3基因的第1108位堿基g>t、第1138位堿基g>a和g>c以及第1620位堿基c>a，共計4種突變類型的方法及相應(yīng)的試劑盒。
背景技術(shù)：
：我國是出生缺陷高發(fā)國家，估計目前我國出生缺陷發(fā)生率在5.6％左右，每年新增出生缺陷數(shù)約90萬例，其中單基因遺傳病是出生缺陷中最主要的一個類型，根據(jù)who統(tǒng)計顯示，全球出生人口單基因病累計發(fā)病率高達(dá)10‰。其中先天性軟骨發(fā)育不全(achondroplasia，ach)為典型的常染色體顯性遺傳的單基因遺傳病,出生發(fā)病率為1/30000，沒有種族傾向，其中80％～90％的患者為散發(fā)型。它是短肢侏儒中最常見的一種疾病，臨床表現(xiàn)為身材矮小，頭大，前額圓凸，鼻梁下陷，手指呈現(xiàn)三叉狀分離等。早期發(fā)現(xiàn)并及時終止妊娠是現(xiàn)在減少該病發(fā)生的主要手段。在不斷的研究過程中，人們對軟骨發(fā)育不全(ach)有了逐步深刻的認(rèn)識。shiang(mutationsinthetransmem‐branedomainoffgfr3causethemostcommongeneticformofdwarfism，achondroplasia.cell，1994，78(2)：335‐342)將ach的致病基因定位于4號染色體短臂t末端，不久rousseau等(mutationsinthegeneencodingfibroblastgrowthfactorreceptor‐3inachondro‐plasia.nature，1994，371(6494)：252‐254)幾乎同時發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞生長因子受體3(fgfr3)跨膜區(qū)基因第1138位核苷酸的突變是ach發(fā)病的原因。fgfr3有19個外顯子和18個內(nèi)含子，其中第10外顯子編碼fgfr3跨膜區(qū)以dna測序發(fā)現(xiàn)，絕大多數(shù)的突變是第1138位核苷酸g>a堿基轉(zhuǎn)換，少數(shù)為g>c轉(zhuǎn)換，這兩種突變都導(dǎo)致了fgfr3跨膜區(qū)第380位密碼子的錯義突變(甘氨酸gly替換為精氨酸arg)(cell，1994，78(2)：335‐342；nature，1994，371(6494)：252‐254)，是骨關(guān)節(jié)先天畸形中發(fā)生基因突變率最高的。1996年dau‐mingniu等研究發(fā)現(xiàn)fgfr31138g>a在中國人群中同樣也是高頻突變，張曄等研究22例ach患者，其中21例存在1138位g>a，fgfr3基因第1138位堿基突變的患者中，95％以上為g>a轉(zhuǎn)換，尚有少數(shù)發(fā)生g>c的顛換，因此檢測該點突變可從分子水平上鑒別ach。尚有學(xué)者發(fā)現(xiàn)ach患者fgfr3基因第10外顯子1180a‐t(p.thr394ser)新的錯義突變，也位于fgfr3基因跨膜區(qū)(zhub,dongqm,huangxh,etal.mutationanalysisoffibroblastgrowthfactorreceptor3geneinanachondroplasiafamily[j].chinesejournalofmedicalgenetics,2003,20(5):373‐375)。此外，近年另有學(xué)者分別在歐洲和日本ach患者中發(fā)現(xiàn)了fgfr3基因1123位g‐t顛換，導(dǎo)致375位密碼子的突變，即由半胱氨酸代替了甘氨酸，表明ach與其他遺傳性疾病一樣存在著等位基因的異質(zhì)性(朱泓，“軟骨發(fā)育不全的產(chǎn)前診斷研究”，《海南醫(yī)學(xué)》，2010年第21卷第9期)。一種核苷酸的點突變和一種疾病存在如此高的對應(yīng)率是及其罕見的，這也保證了軟骨發(fā)育不全基因診斷的準(zhǔn)確性。由于在中國人中，fgfr3基因突變的患者中，95％以上為g1138a轉(zhuǎn)換，尚有少數(shù)發(fā)生g1138c的顛換，基本上包括了中國人的常見fgfr3基因突變頻率(超過99％)，因此以上3種突變類型成為了診斷軟骨發(fā)育不全基因的主要方向(朱泓，《海南醫(yī)學(xué)》，2010年第21卷第9期；themolecularandgeneticbasisoffibroblastgrowthfactorreceptor3disorders.endocrrev，2000，21(1)∶23‐39)。目前臨床主要的檢測方法為超聲檢查(b超下可見胎兒頭大e股骨e脛骨和腓骨均短，三叉形態(tài)和“古鐘”樣胸腔，胎兒腹部膨隆，腹圍增大，胎兒四肢短小，長骨短粗且伴有彎曲，骨端膨大，羊水量增多)，但是由于發(fā)現(xiàn)時間晚(孕晚期，28周后)，并不能實現(xiàn)早期發(fā)現(xiàn)，從而有效地減少該病的發(fā)生。相對于常規(guī)的血清學(xué)篩查方法而言，往往采取絨毛活檢或者羊水穿刺取樣，進(jìn)行胎兒染色體核型分析或基因檢測獲得確切的結(jié)果明確診斷。但侵入性診斷始終存在約0.5％‐1.0％的胎兒丟失率，并且對于產(chǎn)婦和胎兒均造成一定傷害。目前，基因診斷成為檢測軟骨發(fā)育不全基因的主要手段。pcr‐單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(singlestrandconformationpolymorphism，sscp)ach最常見的1138位g>a突變可被限制性內(nèi)切酶sfei檢測出，抽提軟骨發(fā)育不全患者的dna，pcr擴(kuò)增含有fgfr3基因高發(fā)突變位點gly380arg區(qū)域，將pcr產(chǎn)物直接用限制性內(nèi)切酶sfei消化，15％page凝膠電泳。電泳檢測結(jié)果是軟骨發(fā)育不全患者將出現(xiàn)正常pcr產(chǎn)物條帶及其被內(nèi)切酶消化后的兩條帶(109bp和55bp兩條dna片段)，而患者父母及正常人僅出現(xiàn)pcr產(chǎn)物相同大小單條帶(l64bp的dna片段)。pcr‐限制性酶切法已成為檢測這一已知最常見點突變的有效方法。但是，sscp的檢測條件可因dna片段長度及核苷酸組成有較大差別，電泳條件可因突變類型不同而各異，故較難掌握；另外，可因加量不適當(dāng)導(dǎo)致多態(tài)性條帶，與正常條帶重疊不易判斷；另外還可由于變性不徹底而出現(xiàn)雙鏈，特別是異源雙鏈的干擾而影響實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性(方福德.現(xiàn)代醫(yī)學(xué)實驗技巧全書[m]中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社，1995)。fgfr3是ach的致病基因，鑒于該疾病的發(fā)生99％以上均是由g1138a、g1138c、g1123t所引起的，對于有條件的實驗室，可以直接通過對pcr產(chǎn)物的基因測序來檢測上述突變，將測序結(jié)果和正?；蛐蛄袑φ?，若能發(fā)現(xiàn)第1138位核苷酸發(fā)生g>a或g>c的堿基轉(zhuǎn)換以及g1123t則可確診為軟骨發(fā)育不全，若與正常序列相同則可完全排除。由于基因測序尚不能保證100％的準(zhǔn)確性，故應(yīng)取不同pcr產(chǎn)物從兩端分別進(jìn)行測序才能確診?；蛐酒?genechip，dnachip，dnamicroarray，wuj，smithl，plasstc.chip‐chipcomesofageforgenome‐widefunctionalanalysis.cancerres，2006，66(14)：6899.)將大量的核酸分子同時固定在載體上，一次可檢測分析大量的dna和rna，解決了傳統(tǒng)核酸印跡雜交技術(shù)復(fù)雜、自動化程度低、檢測目標(biāo)分子數(shù)量少、成本高、效率低等的缺點。pinar等(detectionofachondroplasiag380rmutationfrompcrampliconsbyusinginosinemodifiedcarbonelectrodesbasedonelectrochemicaldnachiptechnology.clinicachimicaacta，2003，336(1)：57‐64)研制出診斷軟骨發(fā)育不全的電化學(xué)芯片，并成功地用于軟骨發(fā)育不全的基因診斷?；蛐酒\斷不但可以明確有無突變，而且能明確突變類型，高密度芯片診斷能達(dá)到與基因測序一樣的準(zhǔn)確性，并且能夠明確患者是雜合子還是純合子，產(chǎn)業(yè)化的芯片相對基因測序也更易于普及。目前，該技術(shù)在軟骨發(fā)育不全的基因診斷領(lǐng)域已顯示出重要的理論和應(yīng)用價值。胚胎植入前診斷植入前遺傳學(xué)診斷(preimplantationgeneticdiagnosis，pgd)在胚胎植入子宮前進(jìn)行診斷，經(jīng)檢測胚胎無待測的遺傳缺陷時才被植入子宮。rechitsky等(rechitskys，verlinsky，amett,etal.reliabilityofpreimplantationdiagnosisforsinglegenedisorders.molecularandcellularendocrinology，202，183(9)：65‐68.)已經(jīng)成功地開展了軟骨發(fā)育不全的pgd。但是，因為軟骨發(fā)育不全80％以上無家族史，僅對患者進(jìn)行pgd是不安全的，確保無任何遺傳病變嬰兒的出生，是產(chǎn)前診斷的最終目標(biāo)。對每例移植胚胎均在植入前進(jìn)行軟骨發(fā)育不全的突變篩選才是最安全的?；|(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(maldi‐tof‐ms)是近年來發(fā)展起來的一種新型的軟電離生物質(zhì)譜，其原理是用激光照射樣品與基質(zhì)形成的共結(jié)晶薄膜，基質(zhì)從激光中吸收能量傳遞給生物分子，而電離過程中將質(zhì)子轉(zhuǎn)移到生物分子或從生物分子得到質(zhì)子，而使生物分子電離的過程。tof的原理是離子在電場作用下加速飛過飛行管道，根據(jù)到達(dá)檢測器的飛行時間不同而被檢測即測定離子的質(zhì)荷比(m/z)與離子的飛行時間成正比，檢測離子。盡管maldi‐tof的準(zhǔn)確度高達(dá)0.1％～0.01％，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于目前常規(guī)應(yīng)用的sds電泳與高效凝膠色譜技術(shù)，但該質(zhì)譜技術(shù)主要以針對蛋白或多肽類疾病，目前還沒有任何利用該質(zhì)譜技術(shù)用于診斷fgfr3突變位點的報道。因此，目前需要一種更為準(zhǔn)確、有效且不傷及母體和胎兒的快速檢測方法。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明原理之一在于，針對現(xiàn)有已知的檢測fgfr3基因的常見突變位點，在保留常見的g1138a、g1138c的待測突變的情況下，放棄g1123t的待測snp，同時補充了與軟骨發(fā)育不全(achondroplasia，ach)相關(guān)小的g1108t和c1620a的待測位點，通過優(yōu)化篩選之后，首次摸索提供了利用聯(lián)合多重pcr技術(shù)、單堿基延伸技術(shù)和質(zhì)譜檢測技術(shù)，采用飛行時間質(zhì)譜法對fgfr3基因上述突變位點進(jìn)行檢測。其中，c1620a位點是軟骨發(fā)育低下(hypochondroplasia，hch)的突變位點，約有60％的hch患者存在fgfr3基因第13外顯子第1620位核苷酸的突變(包括c‐a和c‐g轉(zhuǎn)換)，其遺傳形式和臨床表現(xiàn)與ach類似，僅癥狀輕微，故臨床上常難以分辨。但患者發(fā)病年齡較晚，多在學(xué)齡期發(fā)病，可通過后天鍛煉和激素治療得以緩解。本發(fā)明原理之二在于，為了避免對母體和胎兒的檢測傷害，本發(fā)明僅僅針對孕婦外周血漿游離dna作為檢測樣本，即可完成對胎兒的fgfr3基因的突變位點的檢測，從而為產(chǎn)前基因檢測提供準(zhǔn)確的診斷結(jié)果。此外，發(fā)明人設(shè)計了通過檢測y染色體的性別決定基因(sry，sex‐determiningregionontheychromosome)(theroleofsryinmammaliansexdetermination.lovell‐badger.cibafoundsymp.1992；165:162‐79；discussion179‐82)和常染色體的25個a/g變異的snp(單核苷酸多態(tài)性)位點，來證實孕婦外周血漿游離dna中確含有胎兒游離dna。其中sry基因僅存在于男胎的y染色體上，在孕婦外周血漿游離dna中檢測到sry基因的片段，即可判定該孕婦血漿中存在男胎兒的游離dna。另外對于25個常染色體上的a/g變異的snp位點，先檢測孕婦基因組dna中這25個位點的基因型，確定哪些位點在孕婦基因組中為純合基因型，再在孕婦外周血漿游離dna中，對這些在孕婦基因組中為純合基因型的位點進(jìn)行檢測，只要檢測到其中含有雜合基因型的位點，即可判定該孕婦血漿中存在胎兒的游離dna。本發(fā)明原理之三在于，在檢測過程中引入了g1108t‐g1138a_c質(zhì)控和c1620a質(zhì)控進(jìn)行檢測。由于本發(fā)明所檢測的目標(biāo)突變，位于占孕婦血漿總游離dna約5％‐15％的胎兒游離dna序列中，比例占少數(shù)的胎兒游離dna的目標(biāo)突變質(zhì)譜峰，相對比例占多數(shù)的母體游離dna的野生質(zhì)譜峰低得多，所以需通過實驗方法不顯示出fgfr3基因的第1108位、第1138位和第1620位堿基的野生基因型質(zhì)譜峰；但又需要引入質(zhì)控把這種人為設(shè)計的野生基因型質(zhì)譜峰不出現(xiàn)和實驗失敗進(jìn)行區(qū)分。g1108t‐g1138a_c質(zhì)控和fgfr3基因的第1108位、第1138位堿基所在的目標(biāo)位點處于同一pcr擴(kuò)增片段，c1620a質(zhì)控和fgfr3基因的第1620位堿基所在的目標(biāo)位點處于同一pcr擴(kuò)增片段。當(dāng)fgfr3基因的第1108位、第1138位和第1620位堿基所在的目標(biāo)位點的pcr反應(yīng)成功時，g1108t‐g1138a_c質(zhì)控和c1620a質(zhì)控也會被成功進(jìn)行pcr擴(kuò)增，從而被質(zhì)譜儀檢測。表1：fgfr3基因型檢測位點信息突變類型密碼子堿基變化氨基酸變化導(dǎo)致疾病種類g1108t370g→tgly→cysachg1138a380g→agly→argachg1138c380g→cgly→argachc1620a540c→aasn→lyshch因此，基于以上發(fā)明原理，本發(fā)明第一個目的是提供一種用于檢測胎兒fgfr3基因的第1108位堿基g>t、第1138位堿基g>a和g>c以及第1620位堿基c>a，共計4種突變類型的引物組合物，其序列如表2所示。其中，所述4種突變類型分別是：fgfr3基因的第1108位堿基g>t、第1138位堿基g>a和g>c以及第1620位堿基c>a，共計4種突變類型。其中，各待檢測位點對應(yīng)的延伸引物及延伸產(chǎn)物分子量如表3所示。表3在一個實施方案中，上述pcr引物序列為核心序列，其在5'端可包括保護(hù)堿基序列，優(yōu)選5‐15個堿基。在一個具體實施方案中，保護(hù)堿基序列選自在5'端加入10bp的tag(acgttggatg)，保護(hù)堿基的序列使得pcr引物(即核心引物)的分子量增大，可以避免反應(yīng)剩余的pcr引物一并進(jìn)入質(zhì)譜檢測過程中，以避免干擾檢測效果。另外，在一個具體實施方案中，延伸引物的5'端也可以適量增加堿基序列(如上述保護(hù)堿基序列)。增加堿基序列的目的是當(dāng)兩個目標(biāo)檢測位點對應(yīng)的延伸引物及產(chǎn)物的分子量接近時，通過給其中一個延伸引物或兩個延伸引物都增加堿基，改變引物及其產(chǎn)物的分子量，與其他延伸引物及產(chǎn)物的分子量之間拉大差距，提高檢測效果。而且，增加后的引物及產(chǎn)物分子量，一定不超出檢測窗口。例如，pcr引物seqidno:1為5'‐acgttggatgccgccaccaccaggatgaa‐3’。在另一個具體實施方案中，延伸引物的5'端也可以增加作為接頭的堿基序列。本發(fā)明第二個目的是提供了由上述引物組合物所制備的檢測產(chǎn)品。其中，該產(chǎn)品選自檢測試劑盒、檢測試劑、檢測芯片等。在一個實施方案中，該產(chǎn)品為檢測試劑盒，包括：(1)用于pcr的反應(yīng)試劑，包括：特異性pcr引物，耐高溫的dna聚合酶，dntps，pcr反應(yīng)緩沖液；(2)用于pcr產(chǎn)物純化的試劑；(3)用于單堿基延伸反應(yīng)的試劑，包括：延伸引物，耐高溫的單堿基延伸酶，ddntps，延伸反應(yīng)緩沖液。在一個具體實施方案中，該試劑盒還可包括：陰性質(zhì)控品，陽性質(zhì)控品，純化用樹脂，點樣及質(zhì)譜檢測用靶片，外切酶，人基因組dna提取試劑等試劑。在另一個具體實施方案中，用于pcr產(chǎn)物純化的試劑：堿性磷酸酶，或堿性磷酸酶和外切酶exoi，或電泳凝膠回收試劑，或pcr產(chǎn)物純化柱。其中當(dāng)包括堿性磷酸酶和外切酶exoi的純化試劑時，所使用的pcr引物無需包括保護(hù)堿基。本發(fā)明第三個目的是使用上述引物組合物、產(chǎn)品或試劑盒來檢測新生兒軟骨發(fā)育不全與軟骨發(fā)育低下的相關(guān)突變位點的方法，包括如下步驟：(1)多重pcr：使用特異性的pcr引物，在一個反應(yīng)體系中，對fgfr3基因等目標(biāo)檢測dna區(qū)域同時進(jìn)行擴(kuò)增，得到目標(biāo)檢測dna區(qū)域的pcr產(chǎn)物；(2)pcr產(chǎn)物純化：對步驟(1)得到的pcr產(chǎn)物進(jìn)行純化，以減少對后續(xù)反應(yīng)的干擾；(3)單堿基延伸：使用3條特異性的延伸引物，在一個反應(yīng)體系中，對步驟(2)得到的純化后pcr產(chǎn)物進(jìn)行多重單堿基延伸，延伸引物在對應(yīng)的目標(biāo)位點處延伸一個核苷酸，該核苷酸與目標(biāo)位點處的基因型互補配對；(4)延伸產(chǎn)物純化：對步驟(3)得到的延伸產(chǎn)物進(jìn)行純化，以獲得高純的延伸產(chǎn)物，避免鹽離子等雜質(zhì)對后續(xù)檢測的影響；(5)質(zhì)譜儀檢測：將步驟(4)得到的純化產(chǎn)物點在含有基質(zhì)的靶片上，放入質(zhì)譜儀進(jìn)行進(jìn)行檢測；其中，所述4個與新生兒軟骨發(fā)育不全與軟骨發(fā)育低下相關(guān)基因的突變分別是：胎兒fgfr3基因的第1108位堿基g>t、第1138位堿基g>a和g>c以及第1620位堿基c>a這4種突變類型。在一個實施方案中，步驟2的純化過程可以選自堿性磷酸酶消化、堿性磷酸酶和外切酶exoi消化、切膠純化、pcr純化柱過柱等。在一個具體實施方案中，當(dāng)使用堿性磷酸酶消化、或堿性磷酸酶和外切酶exoi消化進(jìn)行純化后，進(jìn)行高溫酶失活處理。本發(fā)明第四個目的是提供前述試劑盒來檢測孕婦外周血漿游離dna中胎兒fgfr3基因的第1108位堿基g>t、第1138位堿基g>a和g>c以及第1620位堿基c>a，共計4種突變類型。技術(shù)效果本發(fā)明優(yōu)點和效果如下：1、敏感：本發(fā)明綜合了多重pcr、單堿基延伸、質(zhì)譜檢測等技術(shù)為一體，既可通過pcr技術(shù)放大檢測模板，又可通過質(zhì)譜技術(shù)檢測微量樣本，綜合了兩種技術(shù)的優(yōu)點，遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于單獨使用pcr檢測目標(biāo)dna區(qū)域，因此它的檢測靈敏度很高。2、特異：單堿基延伸又稱為“微測序”，使用特異性探針對dna分子進(jìn)行識別，具有測序技術(shù)的高準(zhǔn)確性，特異性好、假陽性低等特點；特別的，不同于測序技術(shù)延伸數(shù)百個堿基，該技術(shù)僅延伸單個堿基，出錯概率更低；3、簡便安全：操作簡單、安全、自動化程度高、防污染；4.快速：速度快、高通量，可在5‐6小時內(nèi)完成數(shù)百個樣本的檢測。5、本發(fā)明可對多個已知患者進(jìn)行檢測，分別得到具有不同突變位點的檢測結(jié)果，其中患者可以是單個突變位點發(fā)生突變，也可以是多個突變位點發(fā)生突變。這表示患者可以攜帶一個或多個突變突變，從而為選擇合適劑量提供參考信息。6、本發(fā)明克服了以往技術(shù)一次檢測突變位點過少的缺陷，成本低廉。7、本發(fā)明克服了采取絨毛活檢或者羊水穿刺取樣的缺陷，采用無創(chuàng)的方式對胎兒進(jìn)行產(chǎn)前檢測，避免對產(chǎn)婦和胎兒造成的傷害。8、本發(fā)明針對fgfr3基因單一突變的第1138堿基位點的檢測效率，聯(lián)合了多個其他與軟骨發(fā)育不全相關(guān)度低的突變位點檢測，檢測結(jié)果證明相比于單一突變的質(zhì)譜檢測效率95％，本發(fā)明的聯(lián)合質(zhì)譜檢測，效率為100％，具有更為準(zhǔn)確的優(yōu)勢。原理和定義本發(fā)明提供了一種聯(lián)合多重pcr、單堿基延伸和質(zhì)譜檢測等技術(shù)，檢測與軟骨發(fā)育相關(guān)基因突變位點的檢測方案。其原理在于：在多重pcr步驟中，通過設(shè)計并使用合適的引物從而能同時擴(kuò)增多達(dá)6個單堿基多態(tài)/突變(snv)位點所在dna片段。在單堿基延伸步驟中，對上一步多重pcr的產(chǎn)物依次進(jìn)行純化和多重單堿基延伸。其中，延伸引物共6條，分別與6個snv位點對應(yīng)，并在對應(yīng)的目標(biāo)位點處延伸一個核苷酸，該核苷酸與snv位點處的基因型互補配對(如某snv位點處是a基因型，將在對應(yīng)的延伸引物上延伸t核苷酸)。在單堿基延伸步驟中，采用ddntp代替dntp，因此，在延伸一個堿基后，延伸引物將終止延伸。在質(zhì)譜檢測過程中，單堿基延伸產(chǎn)物在脫鹽純化后，點至含基質(zhì)的靶片，并在真空環(huán)境中被激光激發(fā)，通過飛行管至檢測器。不同物質(zhì)通過飛行管的時間與它們的分子量呈負(fù)相關(guān)，即分子量越大，飛行速度越慢，到達(dá)檢測器的時間越晚。術(shù)語“檢測產(chǎn)品”，指用于檢測目標(biāo)位點基因型的任何常規(guī)產(chǎn)品，包括：檢測試劑、檢測芯片、檢測載體，以及檢測試劑盒等。術(shù)語“保護(hù)堿基”，指在pcr引物的5'端額外增加的堿基。由于保護(hù)堿基的序列使得pcr引物(即核心引物)的分子量增大，可以避免反應(yīng)剩余的pcr引物進(jìn)入質(zhì)譜檢測窗口，以避免干擾檢測效果。此外，延伸引物的5'端也可以適量增加堿基序列，但其作用并非如同pcr引物的保護(hù)堿基，使其超出檢測窗口，而是適當(dāng)調(diào)整延伸引物的分子量，使延伸引物及其產(chǎn)物在檢測窗口內(nèi)處于一個合理的位置。例如，當(dāng)兩個基因多態(tài)位點對應(yīng)的延伸引物及產(chǎn)物的分子量接近時，通過給其中一個延伸引物增加堿基，改變引物及其產(chǎn)物的分子量，與其他延伸引物及產(chǎn)物的分子量之間拉大差距，以避免局部區(qū)域質(zhì)譜峰過于集中而產(chǎn)生干擾和分辨不清，從而提高檢測效果。因此，增加堿基后的延伸引物及產(chǎn)物的分子量，一定不會超出檢測窗口。上述延伸引物的額外堿基可稱為引物接頭。術(shù)語“堿性磷酸酶消化”，其作用是降解pcr反應(yīng)后體系中殘余dntp，其原理是使dntp的5'‐p末端轉(zhuǎn)換成5'‐oh末端，從而失去與引物結(jié)合使引物延伸的能力，避免了對下一步單堿基延伸的影響。術(shù)語“外切酶exoi消化”，其作用是從單鏈dna的一端開始按序催化水解組成dna的dntp之間3,5‐磷酸二酯鍵，使單鏈dna最終水解為dntp。在本技術(shù)方案中用于降解pcr反應(yīng)后殘余的pcr引物。由于外切酶可以將單鏈的pcr引物切除，并不會在檢測窗口中出現(xiàn)，因此使用該外切酶時，所使用的pcr引物無需包括保護(hù)堿基。術(shù)語“單堿基延伸”，又被稱之為微測序(minisequence)，指在體系中加入延伸引物和ddntp，ddntp與延伸引物的3'端連接形成延伸產(chǎn)物(即引物延伸了一個堿基)，根據(jù)堿基互補配對原則，由snv位點處基因型決定具體連接何種ddntp，這個過程類似于pcr過程中dntp根據(jù)互補鏈的堿基組成，逐個添加到pcr引物上。由于“ddntp”與普通dntp不同的是，在脫氧核糖的3'位置缺少一個羥基，不能同后續(xù)的ddntp形成磷酸二酯鍵，因而，延伸引物僅在目標(biāo)位點處連接一個ddntp，而不能像pcr那樣，不斷的往下延伸，因此稱之為單堿基延伸。單堿基延伸與測序過程非常相似，測序體系中加入的是dntp和ddntp的混合物，測序引物連接dntp后將繼續(xù)延伸，只有連接ddntp后，方終止延伸，因此測序產(chǎn)生的是長短不一的核苷酸片段的混合物；單堿基延伸體系中加入只有ddntp，延伸引物只能連接一個ddntp，并終止延伸，因此單堿基延伸產(chǎn)生的是延伸引物僅延伸一個堿基的核苷酸片段。術(shù)語“ddntp”是一種特殊的核苷酸，本技術(shù)方案共采用四種，它們之間存在分子量差異，如ddatp、ddctp、ddgtp、ddttp的分子量分別是271.2da、247.2da、287.2da、327.1da(其中ddttp是修飾后的分子量)。當(dāng)延伸引物根據(jù)目標(biāo)單堿基突變/多態(tài)位點的基因型而延伸不同的核苷酸，將形成分子量差異。通過質(zhì)譜檢測，可分辨出這種差異。例如，某snp位點若是c/t多態(tài)，對應(yīng)的延伸引物長度為17個堿基(分子量5019.3da)，當(dāng)該snp位點處是c基因型，延伸引物將延伸一個g核苷酸并終止延伸，形成18個堿基長、分子量5306.5da的延伸產(chǎn)物，當(dāng)該目標(biāo)單堿基突變/多態(tài)位點處是t基因型，延伸引物將延伸一個a核苷酸并終止延伸，形成18個堿基長、分子量5290.5da的延伸產(chǎn)物，兩種產(chǎn)物之間存在16da的分子量差異。即對該突變/多態(tài)位點的該實驗方案，c基因型對應(yīng)5306.5da的質(zhì)譜峰，t基因型對應(yīng)5290.5da的質(zhì)譜峰。在實際檢測過程中，使用者可通過軟件對5019.3da、5306.5da、5290.5da三處進(jìn)行觀察：若5019.3da處出現(xiàn)質(zhì)譜峰，則是有部分或全部延伸引物沒有與ddntp結(jié)合；不論5019.3da處是否出現(xiàn)質(zhì)譜峰，若5306.5da與5290.5da處出現(xiàn)一處質(zhì)譜峰，則該突變/多態(tài)位點的基因型為純合型，并與質(zhì)譜峰的位置對應(yīng)，如前所述，5306.5da的質(zhì)譜峰對應(yīng)c基因型，5290.5da的質(zhì)譜峰對應(yīng)t基因型；若5306.5da與5290.5da兩處質(zhì)譜峰均出現(xiàn)，則該突變/多態(tài)位點的基因型為雜合型；若5306.5da與5290.5da兩處質(zhì)譜峰均未出現(xiàn)，則實驗失敗。術(shù)語“純化”，指用于減少待檢體系內(nèi)其他物質(zhì)對后續(xù)反應(yīng)的影響的處理步驟。本發(fā)明的pcr產(chǎn)物純化有兩種方式：一是分離雜質(zhì)并丟棄，二是使雜質(zhì)失去活性。其中，切膠純化、過純化柱等都是通過電泳、純化柱等分離雜質(zhì)，并回收相對較純的pcr產(chǎn)物，可以認(rèn)為是第一種純化方式，該方式一般耗時，操作復(fù)雜，特別是樣本量大時；堿性磷酸酶的作用是降解(亦稱“消化”)dntp，使之不能繼續(xù)作為dna聚合酶或單堿基延伸酶的底物參與pcr或單堿基延伸反應(yīng)，從而不干擾后續(xù)反應(yīng)，可以認(rèn)為是第二種純化方式。應(yīng)當(dāng)指出的是，單獨的外切酶exoi不起純化作用，當(dāng)它與堿性磷酸酶混合使用時，其作用是預(yù)先將單鏈dna(在反應(yīng)完成后的pcr產(chǎn)物體系中，主要是剩余的pcr引物)降解成dntp，再由堿性磷酸酶使dntp繼續(xù)降解。由于pcr引物被降解，不會進(jìn)入最后的質(zhì)譜檢測步驟，因此，如果計劃純化步驟中增加exoi外切酶處理，那么無需使用具有保護(hù)堿基的pcr引物。此外，在單堿基延伸步驟之前，由于外切酶和堿性磷酸酶都通過高溫失活，其不會降解在單堿基延伸步驟中加入的單鏈的延伸引物、ddntp等，因此避免對后續(xù)實驗產(chǎn)生影響。術(shù)語“檢測窗口”，指可用于質(zhì)譜檢測核苷酸分子量的范圍，通常涉及引物的設(shè)計參考范圍。其中，在設(shè)計延伸引物時，對于不同的snv位點，根據(jù)這些位點所在dna區(qū)域的序列特點，以及突變/多態(tài)位點的基因型，可以設(shè)計出分子量不同的延伸引物和延伸產(chǎn)物，避免不同延伸引物及產(chǎn)物之間由于分子量接近而存在干擾，從而可在一個相對寬闊的檢測窗口，如4000‐9000da，實現(xiàn)對多個突變/多態(tài)位點的檢測。術(shù)語“snp”基因型，指表示人基因組中單核苷酸多態(tài)性的類型。其中，在實際檢查中，作為對照的用于檢測的基因型既可來自于對照人基因組中，也可來自已克隆入質(zhì)粒的載體工具，而后者具有可復(fù)制和保存便捷、來源穩(wěn)定而受到實際使用者的歡迎。術(shù)語“snv”，指基因人基因組中單核苷酸變異的類型，包括單核苷酸多態(tài)性和單核苷酸突變兩種。術(shù)語“胎兒游離dna”主要指為胎兒提高造血細(xì)胞的胎盤滋養(yǎng)層，將部分胎兒dna通過胎盤進(jìn)入母體，少部分是胎兒造血細(xì)胞發(fā)生凋亡后進(jìn)入母體循環(huán)，極少部分是胎兒dna穿越胎盤屏障直接計入母體血漿。應(yīng)當(dāng)指出的是，鑒于以上核酸質(zhì)譜的特殊性，例如，其需先通過pcr反應(yīng)擴(kuò)增出含snv位點的片段，然后通過延伸引物延伸出突變/多態(tài)位點的堿基；各snv的pcr反應(yīng)、延伸反應(yīng)間無明顯干擾；各snv的延伸引物、產(chǎn)物間分子量要有足夠大的差異以便實現(xiàn)區(qū)分等，因此，并非所有的已知snv均可以用來進(jìn)行核酸質(zhì)譜的檢測，也并不是所有針對snv位點設(shè)計的引物均可用以進(jìn)行多重pcr反應(yīng)和多重單堿基延伸反應(yīng)。例如，cláudiam.b等人(optimizationofamultiplexminisequencingprotocolforpopulationstudiesandmedicalgenetics,genet.mol.res4(2005)115‐125)指出，在進(jìn)行多重pcr反應(yīng)前需首先對單重pcr的反應(yīng)效果進(jìn)行驗證，如果單重pcr擴(kuò)增效率低則需要放棄，另外，若pcr產(chǎn)物長度偏長，多重pcr效果會比較差，也需要放棄。nissumm等人(high‐throughputgeneticscreeningusingmatrix‐assistedlaserdesorption/ionizationmassspectrometry,psychiatrgenets12(2002)109‐117)也報道了通過maldi‐tofms高通量檢測snp的過程中，發(fā)現(xiàn)只能獲得90％的準(zhǔn)確率，其中在標(biāo)準(zhǔn)實驗條件下，竟然有5％的情況不能實施pcr擴(kuò)增過程，而在單堿基延伸過程中，由于自身引物自身配對、引物二聚體的形成以及擴(kuò)增產(chǎn)物過低等因素，也導(dǎo)致有5％的情況難以實現(xiàn)單堿基延伸過程，因此必須進(jìn)一步優(yōu)化核酸質(zhì)譜實驗條件(如擴(kuò)增引物、實驗參數(shù)等)，否則將影響maldi‐tofms在核酸質(zhì)譜檢測snv的應(yīng)用。此外，在核酸質(zhì)譜檢測過程中，多重擴(kuò)增過程的干擾作用，對于最終獲得的延伸產(chǎn)物也存在影響。saschasauer等人(typingofsinglenucleotidepolymorphismsbymaldimassspectrometry:principlesanddiagnosticapplications，clinicachimicaacta363(2006)95–105)和heyiyang等人(multiplexsingle‐nucleotidepolymorphismgenotypingbymatrix‐assistedlaserdesorption/ionizationtime‐of‐flightmassspectrometry，analyticalbiochemistry314(2003)54–62)在利用maldi質(zhì)譜技術(shù)研究核酸質(zhì)譜檢測過程中提出，所設(shè)計的多重引物應(yīng)具有相近的熔解溫度(tm值)并彼此間的相互作用力較弱。如果引物之間的相互作用力過于強烈(δg的最小值為‐10kcal/mol)，那么必須放棄該理論設(shè)計的引物而重新進(jìn)行設(shè)計；當(dāng)同一反應(yīng)體系中存在多重反應(yīng)引物，那么多重擴(kuò)增的規(guī)模主要受限于引物之間的相互作用程度，從而影響核酸質(zhì)譜檢測過程；此外，為了準(zhǔn)確區(qū)分不同堿基之間的差異，特別是腺嘌呤(a)和胸腺嘧啶(t)(4種堿基中這二者分子量之間差值最小，為9da)，要求的寡核苷酸長度一般不超過40個堿基，實際應(yīng)用中，質(zhì)譜檢測窗口的分子量范圍一般為4000～9000da，即要求所涉及的延伸引物和產(chǎn)物的分子量盡量分布在4000～9000范圍之內(nèi)。同時，要避免各延伸引物及其延伸產(chǎn)物之間的疊合。由此可見，并非所有已知的snv均可應(yīng)用于核酸質(zhì)譜尤其是多重核酸質(zhì)譜的檢測，其實際效果會受到多種實驗因素的影響，因此需要通過實驗來驗證snv的可行性以及篩選不同引物的組合。附圖說明圖1為實施例四中，對c1樣本fgfr3基因的1108位點的檢測結(jié)果；圖2為實施例四中，對c1樣本fgfr3基因的1138位點的檢測結(jié)果；圖3為實施例四中，對c1樣本fgfr3基因的1138位點的檢測結(jié)果；圖4為實施例四中，對c1樣本fgfr3基因的1620位點的檢測結(jié)果；圖5為實施例四中，對c1樣本fgfr3基因的sry的檢測結(jié)果。圖6為實施例四中，對c1樣本fgfr3基因的1620位點的測序結(jié)果。具體實施方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。實施例一：引物設(shè)計及合成。針對fgfr3基因的第1108、1138和1620位堿基上4種突變類型，設(shè)計對應(yīng)特異性pcr引物核心序列(seqidno：1至seqidno：6)和特異性延伸引物核心序列(seqidno：7至seqidno：9)。其中，為了避免pcr引物進(jìn)入質(zhì)譜儀檢測窗口而干擾檢測效果，每條pcr引物的5'端可以在核心序列(seqidno：1至seqidno：6)的基礎(chǔ)上增加一定數(shù)目的堿基，常見如10bp的tag(acgttggatg)，以使pcr引物的分子量增大，從而超出質(zhì)譜儀檢測窗口。相關(guān)引物在生工生物工程(上海)有限公司進(jìn)行合成。以下檢測過程參照毅新興業(yè)(北京)科技有限公司的《葉酸遺傳代謝基因突變檢測試劑盒(飛行時間質(zhì)譜法)說明書》(以下簡稱“說明書”)進(jìn)行操作。實施例二：孕婦外周血漿游離dna提取所用血片是直徑2cm的圓形濾紙，取50ul全血，滴在圓形濾紙的正中央，然后晾干備用。血片dna提取具體具體步驟如下：(1)準(zhǔn)備剪刀，預(yù)先用75％酒精處理。然后將有血斑的圓形紙片剪下，并剪成很小的碎片，放入1.5ml離心管中，加+入20ul蛋白酶k，20uldtt和500ullysisbuffer1，充分混勻(渦旋)，于56℃放置2h(期間顛倒混勻3‐4次)。(2)取出離心管，短暫離心，用移液器盡量完全的將上清移到新的1.5ml離心管中，以去除濾紙對下步實驗的干擾。(3)于上清中加入850ulbindingbuffer2和150ul磁珠(磁珠使用前要充分懸浮)，充分混勻(輕微渦旋)，室溫放置5min。(4)將離心管置于磁力架上1min，使管內(nèi)磁珠被吸附，用移液器移走管內(nèi)液體。(5)在離心管中加入200ulwashbuffer3，顛倒混勻數(shù)次(也可輕微渦旋)，將磁珠團(tuán)打散即可，置于磁力架吸附磁珠1min，然后移走管內(nèi)液體。(6)在離心管中加入200ulwashbuffer4，顛倒混勻數(shù)次(也可輕微渦旋)，將磁珠團(tuán)打散即可，置于磁力架吸附磁珠1min，然后移走管內(nèi)液體。(7)在離心管中加入200ulwashbuffer5，顛倒混勻數(shù)次(也可輕微渦旋)，將磁珠團(tuán)打散即可，置于磁力架吸附磁珠1min，然后移走管內(nèi)液體。(8)在離心管中加入200ulwashbuffer6，顛倒混勻數(shù)次(也可輕微渦旋)，將磁珠團(tuán)打散即可，置于磁力架吸附磁珠1min，然后移走管內(nèi)液體。(9)將留有磁珠的離心管開蓋、于56度放置10min，充分干燥。(注：在加入洗脫液之前，磁珠必須充分干燥)(10)加入50ulelutionbuffer7(可根據(jù)實驗要求決定洗脫體積)，使用移液器吹打，使磁珠重新懸浮，室溫放置5min。(11)將離心管置于磁力架上1min，使磁珠吸附，將dna轉(zhuǎn)移至新的1.5ml離心管中，‐20℃保存?zhèn)溆?。實施例三：生物實驗。使用abi9700型pcr儀，按說明書對fgfr3基因的3個目標(biāo)檢測位點進(jìn)行檢驗。試劑盒中用于pcr、pcr產(chǎn)物純化和單堿基延伸的組分如表5：表5按說明書，具體操作方法如下：1.pcr擴(kuò)增1.1在pcr配液區(qū)，按照待檢樣品數(shù)(含陽性質(zhì)控品、陰性對照、空白對照)準(zhǔn)備200ulpcr反應(yīng)管，并在管上標(biāo)記樣本編號；1.2從試劑盒中取出pcr混合物、pcr酶，使其自然解凍，渦旋振蕩使其充分混勻，瞬時離心至管底；1.3根據(jù)樣本數(shù)目，按下表的比例取出pcr引物混合液和pcr反應(yīng)液，置于一個離心管中混勻，按每pcr反應(yīng)管加入16ul混合物進(jìn)行分裝。由于分裝過程中，移液器吸頭殘留等因素可能造成不足以分裝出所需的份數(shù)，建議適當(dāng)放大混合物的配制體積。例如有10份待測樣品時，可按10.5‐11份樣品配制混合物。組分名稱單反應(yīng)體積pcr混合物15ulpcr酶1ul合計16ul1.4在pcr擴(kuò)增區(qū)內(nèi)向每管混合物中加入4ul待測樣品，使每份pcr反應(yīng)體系總體積為20ul。其中，陰性對照為純化水，空白對照為不加模板。1.5將pcr反應(yīng)管置于pcr擴(kuò)增儀中，按下表的程序進(jìn)行pcr擴(kuò)增反應(yīng)。2.sap酶消化pcr后，依次取5ulpcr產(chǎn)物至新管，每管加入sap酶混合物1ul，然后將pcr反應(yīng)管置于pcr擴(kuò)增儀中，執(zhí)行下表程序。溫度時間(分)循環(huán)數(shù)37451851513.延伸3.1在pcr配液區(qū)，根據(jù)樣本數(shù)目，按下表的比例取出延伸引物混合液和延伸酶混合物，置于一個離心管中混勻。由于分裝過程中，移液器吸頭殘留等因素可能造成不足以分裝出所需的份數(shù)，建議適當(dāng)放大混合物的配制體積。例如有10份酶切產(chǎn)物時，可按10.5‐11份樣品配制混合物。組分名稱單反應(yīng)體積延伸引物混合液1ul延伸酶混合物1ul合計2ul3.2在pcr擴(kuò)增區(qū)，按每管酶切產(chǎn)物加入2ul混合物進(jìn)行分裝。3.3將pcr反應(yīng)管置于pcr擴(kuò)增儀中，按下表的程序進(jìn)行延伸反應(yīng)。4.純化在pcr擴(kuò)增區(qū)向每管延伸產(chǎn)物中加入16ul純化水，6mg樹脂，顛倒混勻30分鐘。5.點樣使用微量移液器，吸取1ul純化產(chǎn)物，點樣至靶片。實施例四：上機(jī)檢測及結(jié)果判讀。使用北京毅新博創(chuàng)生物科技有限公司生產(chǎn)的clin‐tof型飛行時間質(zhì)譜儀對點樣后的靶片進(jìn)行檢測和結(jié)果判斷。另外，分別設(shè)置以上位點的野生型對照a1‐a4、突變型對照b1‐b4。其中，野生型對照a1‐a4、突變型對照b1‐b4分別來自市售或?qū)嶒炇冶２氐娜斯べ|(zhì)粒。本發(fā)明中所用的野生型對照質(zhì)粒a1‐a4和突變型對照質(zhì)粒b1‐b4，為在商品化質(zhì)粒pmd18‐tvector(takara公司)的基礎(chǔ)上，根據(jù)《分子克隆》記載的常規(guī)方法，用引物和正常人dna進(jìn)行pcr后，將pcr產(chǎn)物插入pmd18‐tvector，即構(gòu)建野生型質(zhì)粒a1‐a4，再分別定點突變，即構(gòu)建3個突變型質(zhì)粒b1‐b4。所述質(zhì)粒a1‐a4和b1‐b4可長期保存于‐20℃甘油中，用時活化并提取質(zhì)粒dna。如前述表2所示，6條延伸引物及它們在1個基因上4個突變位點的檢測，根據(jù)各自基因型產(chǎn)生的延伸產(chǎn)物具有不同的分子量，這些分子量對應(yīng)各自的質(zhì)譜峰，若在某分子量處出現(xiàn)質(zhì)譜峰，則判斷為存在與該分子量對應(yīng)的物質(zhì)(延伸引物或產(chǎn)物)：判斷標(biāo)準(zhǔn)：(1)若野生型和突變型對應(yīng)的質(zhì)譜峰均未出現(xiàn)，無論延伸引物對應(yīng)的質(zhì)譜峰是否存在，均判斷為實驗失??；(2)若野生型或突變型對應(yīng)的質(zhì)譜峰僅出現(xiàn)一個，則判斷為所出現(xiàn)質(zhì)譜峰對應(yīng)的基因型的純合型；(3)若野生型或突變型對應(yīng)的質(zhì)譜峰均出現(xiàn)，則判斷為雜合型。以前述表2所示各位點延伸引物及延伸產(chǎn)物的分子量檢查樣本c1‐c3的質(zhì)譜結(jié)果(圖1‐6)，確定各snv位點的基因型，結(jié)果如表3所示：c1c2c3g1108tggtgttg1138a/cgggagcc1620acccaaa所有樣本的質(zhì)譜結(jié)果如下表4所示：對照實施例一：pcr測序檢測一.根據(jù)實施例一，另行設(shè)計并使用如下引物，對fgfr3基因的1138位點進(jìn)行擴(kuò)增和測序：編號引物序列(5’→3’)正向擴(kuò)增引物caggatgaacaggatgaag反向擴(kuò)增引物atgtctttgcagccgaggag二.樣本來源為使不同實驗之間產(chǎn)生的數(shù)據(jù)具有可比性，測序驗證采用與實施例二中用于質(zhì)譜檢測一致的樣本，即編號n1至n13的樣本。三.測序鑒定1.pcr反應(yīng)體系為25l，具體配方如下所示：2.反應(yīng)條件使用abi公司9700pcr熱循環(huán)儀進(jìn)行pcr反應(yīng)。反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸40s，共35個循環(huán)，最后72℃延伸10min，15℃保存。3.pcr產(chǎn)物純化和測序用試劑盒(omegad2500‐01)回收pcr擴(kuò)增目的條帶，定量后進(jìn)行測序。測序反應(yīng)體系為：2μlmix(bigdye3.1、5xsequencingbuffer、h2o)，2μl純化后的pcr產(chǎn)物，1μl引物(5μmol/l)；使用abi9700pcr擴(kuò)增儀進(jìn)行測序反應(yīng)。循環(huán)條件為：96℃2min→(95℃10s→50℃5s→60℃4min)×30cycles→終止反應(yīng)。測序反應(yīng)產(chǎn)物用試劑盒(omega1320‐01)進(jìn)行純化，然后上abi3730遺傳分析儀進(jìn)行序列測定。4.結(jié)果分析將測序得到的序列，在ncbi上進(jìn)行blast，確定所擴(kuò)增序列確實為目的序列后，用teqman進(jìn)行比對，確定所測樣本fgfr3基因的1138位點的基因型，測序峰圖見圖6(樣本n3)，結(jié)果匯總?cè)绫?所示。經(jīng)過比較，表5與實施例四中的質(zhì)譜檢驗結(jié)果表4完全一致，說明本發(fā)明方法的準(zhǔn)確性。對照實施例二：樣本盲檢根據(jù)本發(fā)明的方法，依照實施例1‐4中所描述的操作步驟，對7例未知基因型的樣本進(jìn)行盲檢。根據(jù)實施例四中描述的判定標(biāo)準(zhǔn)對該7例樣本進(jìn)行結(jié)果分析，得到表6。由下表6可以看出，本發(fā)明所提供的方法可以有效的實現(xiàn)待檢樣本的軟骨發(fā)育不全，檢出率為100％。樣本編號g1138a/c基因型m1(n1)ggm2(n3)gam3(n4)ggm4(n7)ggm5(n9)gam6(n11)ggm7(n13)ggsequencelisting<110>北京毅新博創(chuàng)生物科技有限公司<120>新生兒軟骨發(fā)育不全與軟骨發(fā)育低下檢測試劑盒<130>2016<160>18<170>patentinversion3.5<210>1<211>29<212>dna<213>人工合成序列<400>1acgttggatgccgccaccaccaggatgaa29<210>2<211>30<212>dna<213>人工合成序列<400>2acgttggatgatgtctttgcagccgaggag30<210>3<211>29<212>dna<213>人工合成序列<400>3acgttggatgccgccaccaccaggatgaa29<210>4<211>30<212>dna<213>人工合成序列<400>4acgttggatgatgtctttgcagccgaggag30<210>5<211>29<212>dna<213>人工合成序列<400>5acgttggatgccgccaccaccaggatgaa29<210>6<211>30<212>dna<213>人工合成序列<400>6acgttggatgatgtctttgcagccgaggag30<210>7<211>30<212>dna<213>人工合成序列<400>7acgttggatgtggtgtctgagatggagatg30<210>8<211>28<212>dna<213>人工合成序列<400>8acgttggatgtaccgcacctaccgccct28<210>9<211>30<212>dna<213>人工合成序列<400>9acgttggatgtggtgtctgagatggagatg30<210>10<211>29<212>dna<213>人工合成序列<400>10acgttggatgtaccgcacctaccgccctg29<210>11<211>30<212>dna<213>人工合成序列<400>11acgttggatggattgtcctaccgctttgtc30<210>12<211>30<212>dna<213>人工合成序列<400>12acgttggatgcacacactcaagaatggagc30<210>13<211>14<212>dna<213>人工合成序列<400>13gatgaagcccaccc14<210>14<211>14<212>dna<213>人工合成序列<400>14tggaggctgacgag14<210>15<211>16<212>dna<213>人工合成序列<400>15cctgcatacacactgc16<210>16<211>18<212>dna<213>人工合成序列<400>16cctgcgtgcaggctccca18<210>17<211>21<212>dna<213>人工合成序列<400>17gaaacacaaaaacatcatcaa21<210>18<211>20<212>dna<213>人工合成序列<400>18agtggctgtagcggtcccg20當(dāng)前第1頁12