本發(fā)明涉及體外檢測領域，尤其涉及一種血清透明質(zhì)酸化學發(fā)光免疫檢測試劑盒及其制備方法。

背景技術(shù)：

透明質(zhì)酸(Hyaluronic acid，下文簡寫為HA)是一種大分子氨基多糖，由N-乙酰氨基葡萄糖及D-葡萄糖醛酸的重復結(jié)構(gòu)組成線形多糖結(jié)構(gòu)，由間質(zhì)細胞合成。HA主要在肝臟內(nèi)代謝，當肝硬化肝損害，內(nèi)皮細胞同時受損，攝取與分解HA的能力下降，導致HA增多，因此，HA是肝硬化的一個良好血清學指標。另外，HA還有助于肝病的診斷和鑒別診斷、病情判斷和預后評估，還是抗纖維化藥物治療的一個非常重要的動態(tài)觀察手段。

目前臨床檢測透明質(zhì)酸的常見方法有酶聯(lián)免疫吸附法、放射免疫分析法、酶促化學發(fā)光法，但這些方法都存在著一些不足之處。

一、酶聯(lián)免疫吸附法

酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)被廣泛應用，但該方法也存在著下述的不足之處：

(1)使用12×8型、6×8型、8×12型或整板型96孔專用微孔板作為抗體包被用具和反應容器，在使用時只能分成12批次、6批次、8批次或整板一次使用，無法進行獨立的、單人份的檢測；

(2)定量測定所用的試劑種類較多，每一種檢測試劑都要用試劑瓶來盛裝，并且每使用一種試劑時都需要更換吸液嘴來分別加注到微孔板的微孔中，不但試劑瓶種類多，加注試劑的操作也極為繁瑣；

(3)缺少對檢測信息的相應標注，只能通過查看試劑盒外包裝盒的標識才能了解或知悉檢測試劑的生產(chǎn)批號及有效期信息，而且所知悉的信息在檢測過程中不受控，具有很大的隨意性；

(4)檢測試劑在檢測過程中處于開放的空間，容易引起各種試劑之間的交叉污染而影響檢測結(jié)果的準確性；

(5)檢測過程多采用手工操作，試劑或樣本的加量不很精確，操作過程極為繁瑣和復雜，容易發(fā)生操作差錯，檢測結(jié)果的準確度和精密度較差；

(6)在檢測項目成套試劑的數(shù)量配置及使用上均為項目數(shù)×48/96人份，如果需要檢測10個項目，則試劑的配置及使用數(shù)須為10×48/96人份，如果只有一份樣本需要檢測10個不同的項目，也需要配置10×48/96人份的試劑，存在著不夠經(jīng)濟合理的缺點。

二、放射免疫分析法

放射免疫分析方法放射性污染大、加樣步驟繁瑣、操作復雜、操作時間長、測定結(jié)果不穩(wěn)定、試劑保存時間短、試劑盒操作自動化程度低、配套儀器價格昂貴等不足之處。

二、化學發(fā)光法

化學發(fā)光法按發(fā)光原理可分為直接化學發(fā)光和酶促化學發(fā)光。

酶促化學發(fā)光主要有辣根過氧化物酶(HRP)和堿性磷酸酶兩種，但都有一定的局限性，辣根過氧化物酶主要缺點為：魯米諾在沒有辣根過氧化物酶存在情況下，也會被H2O2氧化自身發(fā)光，本底相對較高，影響信噪比，反應動力學復雜，影響因素多，結(jié)果不夠穩(wěn)定，要得到靈敏度高且平臺期長的底物不容易。堿性磷酸酶主要缺點為：底物達到平臺期的時間長，底物成本高，導致檢測成本高，患者負擔重。

吖啶酯作為標記物的直接化學發(fā)光相比酶促化學發(fā)光具有明顯優(yōu)勢，主要表現(xiàn)在：反應不需要催化劑，只要堿性環(huán)境即可進行，反應迅速，背景發(fā)光低，信噪比高，干擾因素少，試劑穩(wěn)定性好，可以兩點定標，體系簡單，激發(fā)液成本低，吖啶酯易與蛋白質(zhì)聯(lián)結(jié)，且聯(lián)結(jié)后光子產(chǎn)率不減少。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

基于此，有必要提供一種檢測靈敏度較高的血清透明質(zhì)酸化學發(fā)光免疫檢測試劑盒及其制備方法。

一種血清透明質(zhì)酸化學發(fā)光免疫檢測試劑盒，包括：血清透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白包被的羧基化的磁微粒和透明質(zhì)酸標記的化學發(fā)光標記物。

所述血清透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白包被的羧基化的磁微粒中，所述血清透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白與所述羧基化的磁微粒的比例為1：25～35。

所述透明質(zhì)酸標記的化學發(fā)光標記物中，所述透明質(zhì)酸與所述化學發(fā)光標記物的比例為50：1～10。

所述羧基化的磁微粒的粒徑為0.05μm～1μm。

所述化學發(fā)光標記物為魯米諾、異魯米諾、三聯(lián)吡啶釕或吖啶酯。

所述的血清透明質(zhì)酸化學發(fā)光免疫檢測試劑盒，還包括化學發(fā)光底物液，所述化學發(fā)光底物液包括A液和B液。

所述A液為H₂O₂溶液，所述B液為NaOH溶液。

所述的血清透明質(zhì)酸化學發(fā)光免疫檢測試劑盒，還包括血清透明質(zhì)酸定標品。

在一個實施例中，所述血清透明質(zhì)酸定標品為濃度分別為

0ng/mL,100ng/mL,500ng/mL,1000ng/mL,1500ng/mL,2000ng/mL的血清透明質(zhì)酸的溶液。

一種上述的血清透明質(zhì)酸化學發(fā)光免疫檢測試劑盒的制備方法，包括如下步驟：

取羧基化的磁微粒的懸浮液，磁分離去上清后用MES緩沖液重懸，接著加入EDC水溶液，活化羧基化的磁微粒的表面羧基，接著加入透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白，室溫下混懸2h～10h，磁分離去除上清后用Tris緩沖液重懸，得到透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白包被的羧基化的磁微粒；以及

取透明質(zhì)酸，加入碳酸鹽緩沖液后混勻，然后加入化學發(fā)光標記物后混勻，室溫下避光反應1h～2h后除雜，得到透明質(zhì)酸標記的化學發(fā)光標記物。

這種血清透明質(zhì)酸化學發(fā)光免疫檢測試劑盒能夠以全自動化學發(fā)光免疫分析儀為檢測工具，完成血清透明質(zhì)酸的檢測。這種血清透明質(zhì)酸化學發(fā)光免疫檢測試劑盒，經(jīng)過實驗，其檢測靈敏度達到2.0ng/mL，相對于傳統(tǒng)的血清透明質(zhì)酸的檢測方法靈敏度至少提高了10倍，這種血清透明質(zhì)酸化學發(fā)光免疫檢測試劑盒的檢測精度較高。

附圖說明

圖1為一實施方式的血清透明質(zhì)酸化學發(fā)光免疫檢測試劑盒的制備方法的流程圖；

圖2為實施例3得到的血清透明質(zhì)酸標準曲線圖。

具體實施方式

為使本發(fā)明的上述目的、特征和優(yōu)點能夠更加明顯易懂，下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明的具體實施方式做詳細的說明。在下面的描述中闡述了很多具體細節(jié)以便于充分理解本發(fā)明。但是本發(fā)明能夠以很多不同于在此描述的其它方式來實施，本領域技術(shù)人員可以在不違背本發(fā)明內(nèi)涵的情況下做類似改進，因此本發(fā)明不受下面公開的具體實施的限制。

一實施方式的血清透明質(zhì)酸化學發(fā)光免疫檢測試劑盒，包括：透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白包被的羧基化的磁微粒和透明質(zhì)酸標記的化學發(fā)光標記物。

優(yōu)選的，透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白包被的羧基化的磁微粒中，透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白與羧基化的磁微粒的比例為1：25～35。

優(yōu)選的，血清透明質(zhì)酸標記的化學發(fā)光標記物中，透明質(zhì)酸與化學發(fā)光標記物的比例為50：1～10。

優(yōu)選的，羧基化的磁微粒的粒徑為0.05μm～1μm。

化學發(fā)光標記物可以為魯米諾、異魯米諾、三聯(lián)吡啶釕或吖啶酯。其中，化學發(fā)光標記物優(yōu)選為吖啶酯。

在其他的實施例中，上述血清透明質(zhì)酸化學發(fā)光免疫檢測試劑盒還包括化學發(fā)光底物液。

化學發(fā)光底物液包括A液和B液。A液可以為H₂O₂溶液，B液可以為NaOH溶液。

本實施例中，A液為濃度為0.1mol/L的H₂O₂溶液，B液為濃度為0.25mol/L的NaOH溶液。

在其他的實施例中，上述血清透明質(zhì)酸化學發(fā)光免疫檢測試劑盒還包括血清透明質(zhì)酸定標品。

血清透明質(zhì)酸定標品為濃度分別為0ng/mL,100ng/mL,500ng/mL,1000ng/mL,1500ng/mL,2000ng/mL的透明質(zhì)酸的溶液。

具體的，透明質(zhì)酸定標品可以采用標準品緩沖液將透明質(zhì)酸配制成濃度分別為0ng/mL,100ng/mL,500ng/mL,1000ng/mL,1500ng/mL,2000ng/mL的透明質(zhì)酸的溶液。

這種血清透明質(zhì)酸化學發(fā)光免疫檢測試劑盒用于血清透明質(zhì)酸檢測時，利用全自動化學發(fā)光免疫分析儀對透明質(zhì)酸定標品進行檢測，繪制標準曲線，內(nèi)置于電腦軟件；接著測試實際樣本，根據(jù)樣本發(fā)光值計算樣本濃度；最后對血清透明質(zhì)酸全自動化學發(fā)光免疫分析系統(tǒng)進行性能(靈敏度、線性、精密度、干擾性)的評價。

這種血清透明質(zhì)酸化學發(fā)光免疫檢測試劑盒能夠以全自動化學發(fā)光免疫分析儀為檢測工具，完成血清透明質(zhì)酸的檢測這種血清透明質(zhì)酸化學發(fā)光免疫檢測試劑盒，經(jīng)過實驗，其檢測靈敏度達到2.0ng/mL，相對于傳統(tǒng)的血清透明質(zhì)酸的檢測方法靈敏度至少提高了10倍，這種血清透明質(zhì)酸化學發(fā)光免疫檢測試劑盒的檢測精度較高。

此外，這種血清透明質(zhì)酸化學發(fā)光免疫檢測試劑盒還具有以下優(yōu)點：

1、選擇吖啶酯作為標記材料，并應用于化學發(fā)光免疫分析系統(tǒng)，該發(fā)光體系為直接化學發(fā)光，與傳統(tǒng)的酶促化學發(fā)光相比，該反應不需要酶的參與，更加節(jié)約成本；

2、選用吖啶酯的化學發(fā)光免疫分析系統(tǒng)線性范圍寬，能達到

2.0ng/mL-2000ng/mL。，而傳統(tǒng)的血清透明質(zhì)酸的檢測方法的檢線性范圍為20ng/mL～1000ng/mL；

3、吖啶酯化學發(fā)光免疫分析系統(tǒng)重復性高，批內(nèi)及批間差均在5％以內(nèi)，這是其它化學發(fā)光免疫分析系統(tǒng)難以達到的；

4、化學發(fā)光免疫分析系統(tǒng)已實現(xiàn)樣本的定量，通過內(nèi)置標準曲線到測試軟件，只需測試樣本就可直接得到樣本的濃度值；

5、化學發(fā)光免疫分析系統(tǒng)可以實現(xiàn)全自動化，試劑及樣本的添加全有儀器完成，操作更加簡便，減少了人為的誤差。

如圖1所示的上述血清透明質(zhì)酸化學發(fā)光免疫檢測試劑盒的制備方法，包括如下步驟：

取羧基化的磁微粒的懸浮液，磁分離去上清后用MES緩沖液重懸，接著加入EDC水溶液，活化羧基化的磁微粒的表面羧基，接著加入透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白，室溫下混懸2h～10h，磁分離去除上清后用Tris緩沖液重懸，得到透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白包被的羧基化的磁微粒。

MES(2-(N-嗎啡啉)乙磺酸)緩沖液的濃度為0.02M，pH為5.5。

Tris緩沖液的濃度為0.1M并且含有2％BSA，pH為8.0。

EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺)水溶液的濃度為10mg/mL～20mg/mL，EDC與羧基化的磁微粒的比例為0.05：0.1～1。

優(yōu)選的，透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白包被的羧基化的磁微粒中，透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白與羧基化的磁微粒的比例為1：25～35。

優(yōu)選的，羧基化的磁微粒的粒徑為0.05μm～1μm。

取透明質(zhì)酸，加入碳酸鹽緩沖液后混勻，然后加入化學發(fā)光標記物后混勻，室溫下避光反應1h～2h后除雜，得到血清透明質(zhì)酸標記的化學發(fā)光標記物。

碳酸鹽緩沖液濃度為0.1M，pH為9.0～9.5，

除雜的操作為離心脫鹽柱脫鹽，具體操作為：先分別用純凈水及TBS緩沖液(40mM Tris-HCl，0.5％BSA，1％NaCl，pH 8.0)處理離心脫鹽柱，最后加入得到的透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白包被的羧基化的磁微粒的溶液，最后收集離心管中的液體。

優(yōu)選的，透明質(zhì)酸標記的化學發(fā)光標記物中，透明質(zhì)酸與化學發(fā)光標記物的比例為50：1～10。

化學發(fā)光標記物可以為魯米諾、異魯米諾、三聯(lián)吡啶釕或吖啶酯。其中，化學發(fā)光標記物優(yōu)選為吖啶酯。

得到的透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白包被的羧基化的磁微粒和透明質(zhì)酸標記的化學發(fā)光標記物組合即可得到上述血清透明質(zhì)酸化學發(fā)光免疫檢測試劑盒。

這種血清透明質(zhì)酸化學發(fā)光免疫檢測試劑盒在使用時，還需要化學發(fā)光底物液和血清透明質(zhì)酸定標品。

化學發(fā)光底物液和血清透明質(zhì)酸定標品可以自行配制得到。

化學發(fā)光底物液包括A液和B液。A液可以為H₂O₂溶液，B液可以為NaOH溶液。

本實施例中，A液為濃度為0.1mol/L的H₂O₂溶液，B液為濃度為0.25mol/L的NaOH溶液。

具體的，血清透明質(zhì)酸定標品可以采用標準品緩沖液將透明質(zhì)酸配制成濃度分別為0ng/mL,100ng/mL,500ng/mL,1000ng/mL,1500ng/mL,2000ng/mL的透明質(zhì)酸的溶液。

這種血清透明質(zhì)酸化學發(fā)光免疫檢測試劑盒的制備方法簡單方便，制得的血清透明質(zhì)酸化學發(fā)光免疫檢測試劑盒的檢測靈敏度較高，具有良好的應用前景。

以下為具體實施例。

實施例1：血清透明質(zhì)酸化學發(fā)光免疫檢測試劑盒的制備

(1)血清透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白包被的羧基化的磁微粒的制備：

取含有50mg粒徑為0.05μm～1μm的羧基化的磁微粒(MagnaBindTM，貨號21353)懸浮液，磁分離去上清，用0.02M，pH為5.5MES緩沖液重懸，加入1mL新配置的10mg/mL的EDC水溶液，活化磁珠表面羧基，加入4mg透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白(biorbyt，貨號orb48780)，室溫下混懸6h，磁分離，去除上清，用含2％BSA的0.1M，pH為8.0的Tris緩沖液重懸到1mg/mL，得到透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白包被的羧基化的磁微粒，每瓶5mL分裝保存于4℃?zhèn)溆谩?/p>

(2)血清透明質(zhì)酸標記的吖啶酯的制備：

取50μL濃度為25mg/mL的透明質(zhì)酸，加入150μL濃度為0.1M、pH為9.0～9.5的碳酸鹽緩沖液，混勻，然后加入1.5μL濃度為5mg/mL的吖啶酯溶液混勻，室溫下避光反應，1.5h后取出，用2mL的zeba離心脫鹽柱脫鹽處理，脫鹽過程中首先分別用純凈水及TBS緩沖液進行處理，最后加入得到的透明質(zhì)酸標記的吖啶酯溶液，收集離心管中的液體至保存管得到血清透明質(zhì)酸標記的吖啶酯，每瓶5mL分裝保存于4℃?zhèn)溆谩?/p>

(3)血清透明質(zhì)酸定標品的制備：

用標準品緩沖液(40mM Tris-HCl，0.5％BSA，1％NaCl，pH 8.0)將透明質(zhì)酸配置成濃度為0ng/mL,100ng/mL,500ng/mL,1000ng/mL,1500ng/mL,2000ng/mL，每瓶0.5mL分裝凍干，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

實施例2：血清透明質(zhì)酸化學發(fā)光免疫檢測方法

以全自動化學發(fā)光免疫分析儀(YHLO，貨號iFlash3000)為檢測工具，方法學模式為競爭法，即儀器依次加入50μL的樣品、50μL的血清透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白包被的羧基化的磁微粒及50μL的透明質(zhì)酸包被的吖啶酯，反應20min后，進行磁分離，儀器將反應混合物送入暗室，依次加入發(fā)光底物A液(H₂O₂)及B液(NaOH)進行發(fā)光反應，最后記錄發(fā)光值。

實施例3：血清透明質(zhì)酸化學發(fā)光免疫檢測試劑盒性能評價

采用實施例2中的方法對血清透明質(zhì)酸定標品進行檢測，得到繪制標準曲線如圖2所示。

接著對接著測試實際樣本，根據(jù)樣本發(fā)光值計算樣本濃度。

靈敏度的檢測：

參照CLSI EP17-A文件推薦實驗方案，計算血清透明質(zhì)酸化學發(fā)光免疫檢測試劑盒的靈敏度，求得的靈敏度為0.68ng/mL。

線性的檢測：

對濃度為0ng/mL,100ng/mL,500ng/mL,1000ng/mL,1500ng/mL,2000ng/mL標準品做線性分析，計算線性相關系數(shù)，r＝0.9996，另外，該試劑盒對血清透明質(zhì)酸樣品檢測的線性范圍為20ng/mL～1000ng/mL。

精密度測定：

取濃度為500ng/mL及1000ng/mL兩個血清透明質(zhì)酸樣品，每個樣本每個濃度各做3個平行，用三批試劑盒進行檢測，計算試劑盒批內(nèi)及批間差，結(jié)果表明該試劑盒批內(nèi)及批間差均小于5％。

干擾性實驗：

取混合血清分別添加干擾物包括：結(jié)合膽紅素、游離膽紅素、血紅蛋白、抗壞血酸、甘油酯，添加比例按照1：20進行，分別測定混合血清及添加了各種干擾物后混合血清的測值，計算二者之間的偏差，以±10％為可接受范圍。結(jié)果表明，干擾性均達到NCCLS的文件標準，可用于臨床實驗室血清透明質(zhì)酸狀況的準確評估。

實施例4、血清透明質(zhì)酸化學發(fā)光免疫檢測試劑盒的對比實驗

分別用化學發(fā)光檢測方法和傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附法對濃度約為0ng/mL的血清透明質(zhì)酸樣品做檢測，兩種方法檢測靈敏度相比，數(shù)據(jù)如下表所示：

由上表可以看出，化學發(fā)光檢測方法的靈敏度較酶聯(lián)免疫吸附法提高了約20倍。

以上所述實施例僅表達了本發(fā)明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并不能因此而理解為對本發(fā)明專利范圍的限制。應當指出的是，對于本領域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。因此，本發(fā)明專利的保護范圍應以所附權(quán)利要求為準。