本發(fā)明屬于基因編輯領(lǐng)域，具體涉及一種雙sgrna介導(dǎo)的基因精確修飾方法及應(yīng)用，特別涉及一種雙sgrna介導(dǎo)的構(gòu)建囊腫性纖維化細(xì)胞模型的方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：基因編輯技術(shù)在農(nóng)業(yè)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域均具有廣闊的應(yīng)用前景,技術(shù)方法正在不斷改進(jìn)和創(chuàng)新，主要的改良方向是提高基因編輯的精準(zhǔn)程度。目前基因編輯主要依靠鋅指核酸酶(zfn)，talen與crispr/cas9三大技術(shù)，應(yīng)用最廣泛的是crispr/cas9，它使用1條sgrna，效率和精度仍需提高。囊腫性纖維化(cysticfibrosis，cf)是一種遺傳疾病，其可能會(huì)影響身體多處，其中以肺部和消化系統(tǒng)所受的影響最為嚴(yán)重，白種人最常患上囊腫性纖維化。但是目前針對(duì)該疾病仍未有治療的方法。該疾病的發(fā)生主要是由于cftr基因的突變?cè)斐傻?，其中大約70％的病人是由于cftr基因編碼的第508位氨基酸的核苷酸(ctt)的缺失引起的。隨著基因編輯技術(shù)的發(fā)展，基因編輯技術(shù)為這一疾病的治療提供了新的治療思路，我們可以通過(guò)crispr/cas9等基因編輯技術(shù)對(duì)突變的cftr基因進(jìn)行修復(fù)，從而達(dá)到從根本上治療疾病的目的。目前針對(duì)人cftr突變位點(diǎn)的修復(fù)雖然有一些研究，然而效率卻并不高或者需要使用篩選標(biāo)記基因。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明同時(shí)使用了2條sgrna，以cf細(xì)胞為模型，針對(duì)編碼cftr基因的第508位氨基酸的核苷酸進(jìn)行定向缺失，獲得cftr第508位氨基酸缺失病人一樣的致病基因型，并發(fā)現(xiàn)本發(fā)明雙sgrna較單sgrna進(jìn)行編輯具有更高的效率，本發(fā)明為基因疾病的細(xì)胞模型構(gòu)建和基因編輯提供了更為有效的方法。本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：一種用于構(gòu)建囊腫性纖維化模型的雙sgrna，該雙sgrna的序列為：sg1:ccuaugaugaauauagauacaga(seqidno：1)；sg508-w:ccaaagaugauauuuucuuuaau(seqidno：2)。雙sgrna在制備構(gòu)建囊腫性纖維化模型的試劑中的應(yīng)用，該雙sgrna的序列為：sg1:ccuaugaugaauauagauacaga(seqidno：1)；sg508-w:ccaaagaugauauuuucuuuaau(seqidno：2)。進(jìn)一步的，所述囊腫性纖維化模型為囊腫性纖維化的細(xì)胞模型、囊腫性纖維化的動(dòng)物模型。一種雙sgrna介導(dǎo)的構(gòu)建囊腫性纖維化模型的方法，該方法為：將上述所述的雙sgrna同時(shí)轉(zhuǎn)染目標(biāo)細(xì)胞或動(dòng)物，培養(yǎng)30～60h后，即得囊腫性纖維化細(xì)胞或動(dòng)物模型。進(jìn)一步的，雙sgrna同時(shí)轉(zhuǎn)染目標(biāo)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染體系為：106～107個(gè)細(xì)胞，1～2μgsg1，1～2μgsg508-w，8～12μgcas9蛋白，8～12μgoligo，100～150μl電轉(zhuǎn)液。進(jìn)一步的，雙sgrna同時(shí)轉(zhuǎn)染目標(biāo)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染條件為在620v，30ms的條件下進(jìn)行電轉(zhuǎn)。一種用于構(gòu)建囊腫性纖維化模型的試劑盒，該試劑盒中含有上述所述的雙sgrna或/和該雙sgrna的轉(zhuǎn)錄模板。引物組在制備上述所述雙sgrna中的應(yīng)用，所述引物組的序列為：sg1-f：tgtaatacgactcactataggtctgtatctatattcatcatgttttagagctagaaatagc(seqidno：3)；sg508-w-f：tgtaatacgactcactataggattaaagaaaatatcatcttgttttagagctagaaatagc(seqidno：4)；sg-r：aaaagcaccgactcggtgcc(seqidno：5)。一種用于構(gòu)建囊腫性纖維化模型的試劑盒，該試劑盒中含有用于制備上述所述的雙sgrna的引物組，所述引物組的序列為：sg1-f：tgtaatacgactcactataggtctgtatctatattcatcatgttttagagctagaaatagc(seqidno：3)；sg508-w-f：tgtaatacgactcactataggattaaagaaaatatcatcttgttttagagctagaaatagc(seqidno：4)；sg-r:aaaagcaccgactcggtgcc(seqidno：5)。進(jìn)一步的，該試劑盒中還含有質(zhì)粒px330。本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明在針對(duì)cftr508位點(diǎn)的定點(diǎn)修飾中使用了雙sgrna，相比于單個(gè)sgrna，其基因編輯效率得到了提高。附圖說(shuō)明圖1為各組細(xì)胞突變的精確修飾效率比較。具體實(shí)施方式一種用于構(gòu)建囊腫性纖維化模型的雙sgrna，該雙sgrna的序列為：sg1:ccuaugaugaauauagauacaga(seqidno：1)；sg508-w:ccaaagaugauauuuucuuuaau(seqidno：2)。雙sgrna在制備構(gòu)建囊腫性纖維化模型的試劑中的應(yīng)用，該雙sgrna的序列為：sg1:ccuaugaugaauauagauacaga(seqidno：1)；sg508-w:ccaaagaugauauuuucuuuaau(seqidno：2)。優(yōu)選的，所述囊腫性纖維化模型為囊腫性纖維化的細(xì)胞模型、囊腫性纖維化的動(dòng)物模型。一種雙sgrna介導(dǎo)的構(gòu)建囊腫性纖維化模型的方法，該方法為：將上述所述的雙sgrna同時(shí)轉(zhuǎn)染目標(biāo)細(xì)胞或動(dòng)物，培養(yǎng)30～60h后，即得囊腫性纖維化細(xì)胞或動(dòng)物模型。優(yōu)選的，雙sgrna同時(shí)轉(zhuǎn)染目標(biāo)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染體系為：106～107個(gè)細(xì)胞，1～2μgsg1，1～2μgsg508-w，8～12μgcas9蛋白，8～12μgoligo，100～150μl電轉(zhuǎn)液。優(yōu)選的，雙sgrna同時(shí)轉(zhuǎn)染目標(biāo)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染條件為在620v，30ms的條件下進(jìn)行電轉(zhuǎn)。一種用于構(gòu)建囊腫性纖維化模型的試劑盒，該試劑盒中含有上述所述的雙sgrna或/和該雙sgrna的轉(zhuǎn)錄模板。引物組在制備上述所述雙sgrna中的應(yīng)用，所述引物組的序列為：sg1-f：tgtaatacgactcactataggtctgtatctatattcatcatgttttagagctagaaatagc(seqidno：3)；sg508-w-f：tgtaatacgactcactataggattaaagaaaatatcatcttgttttagagctagaaatagc(seqidno：4)；sg-r：aaaagcaccgactcggtgcc(seqidno：5)。一種用于構(gòu)建囊腫性纖維化模型的試劑盒，該試劑盒中含有用于制備上述所述的雙sgrna的引物組，所述引物組的序列為：sg1-f：tgtaatacgactcactataggtctgtatctatattcatcatgttttagagctagaaatagc(seqidno：3)；sg508-w-f：tgtaatacgactcactataggattaaagaaaatatcatcttgttttagagctagaaatagc(seqidno：4)；sg-r:aaaagcaccgactcggtgcc(seqidno：5)。優(yōu)選的，上述試劑盒中還含有質(zhì)粒px330。下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。實(shí)施例1用于構(gòu)建囊腫性纖維化模型的雙sgrnahek293細(xì)胞系購(gòu)自atcc公司(crl-1573tm)，培養(yǎng)液成分：10％胎牛血清(10438026，gibco)+89％dmem(11965，gibco)+1％雙抗(15140122，gibco)，培養(yǎng)條件為5％co2，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱。囊腫性纖維化(cysticfibrosis，cf)是一種遺傳疾病，70％的病人是由于cftr基因編碼的第508位氨基酸的核苷酸(ctt)的缺失引起的。為了有效構(gòu)建囊腫性纖維化模型，本發(fā)明通過(guò)大量的研究實(shí)驗(yàn)，最終發(fā)現(xiàn)以下2條sgrna能夠顯著提高囊腫性纖維化模型建立的準(zhǔn)確率。所述2條sgrna序列其分別為：sg1:ccuaugaugaauauagauacaga(seqidno：1)；sg508-w:ccaaagaugauauuuucuuuaau(seqidno：2)。實(shí)施例2雙sgrna介導(dǎo)的構(gòu)建囊腫性纖維化細(xì)胞模型的方法(1)雙sgrna的制備1.1合成引物sg1-f，sg508-w-f與sg-r：sg1-f：tgtaatacgactcactataggtctgtatctatattcatcatgttttagagctagaaatagc(seqidno：3)；sg508-w-f：tgtaatacgactcactataggattaaagaaaatatcatcttgttttagagctagaaatagc(seqidno：4)sg-r:aaaagcaccgactcggtgcc(seqidno：5)。1.2雙sgrna的轉(zhuǎn)錄模板的制備以px330質(zhì)粒為模板(購(gòu)自addgene，貨號(hào)：plasmid#42230)，進(jìn)行pcr擴(kuò)增，分別獲得雙sgrna(sg1和sg508-w)的轉(zhuǎn)錄模板，各反應(yīng)體系如表1和表2所示。表1sg1的轉(zhuǎn)錄模板的pcr擴(kuò)增體系試劑體積taq酶0.4μl10×buffer5μldntp8μl10nmsg1-f5μl10nmsg-r5μlpx330反應(yīng)終濃度至4ng/μl水加至50μl總體系50μl表2sg508-w的轉(zhuǎn)錄模板的pcr擴(kuò)增體系試劑體積taq酶0.4μl10×buffer5μldntp8μl10nmsg508-w-f5μl10nmsg-r5μlpx330反應(yīng)終濃度至4ng/μl水加至50μl總體系50μlpcr擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃5min；95℃30s、52℃30s、72℃30s，38個(gè)循環(huán)；72℃5min；16℃2min。pcr結(jié)束后利用pcr產(chǎn)物純化試劑盒(a9281，promega)分別對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行純化，分別獲得大小約為100bp的dna片段dna-sg1和dna-sg508-w，即為雙sgrna的轉(zhuǎn)錄模板。1.3雙sgrna的體外轉(zhuǎn)錄分別以上述所得的dna片段dna-sg1、dna-sg508-w為模板，利用cellscript公司的t7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒(cas3107,cellscript)獲得兩種sgrna，即sg1與sg508-w，具體步驟參見試劑盒說(shuō)明書。(2)轉(zhuǎn)染細(xì)胞2.1在金唯智公司合成寡聚核苷酸(oligo)序列：tgttctcagttttcctggattatgcctggcaccattaaagaaaatatcattggtgttttctatgatgaatatagatacagaagcgtcatcaaagcatgccaactagaagag(seqidno：6)。2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染：1)細(xì)胞準(zhǔn)備，準(zhǔn)備hek293細(xì)胞用于轉(zhuǎn)染；2)cas9核蛋白(ribonucleoproteins，rnp)準(zhǔn)備，cas9蛋白購(gòu)自唯尚立德公司(e025s)，將雙sgrna(sg1和sg508-w)與cas9蛋白于室溫中孵育10分鐘；3)按照表3中配方，配制各組電轉(zhuǎn)液體系，電轉(zhuǎn)液、電轉(zhuǎn)杯與電轉(zhuǎn)儀(ctx-1500a)及相關(guān)電轉(zhuǎn)耗材均購(gòu)自celetrix公司。表3各組電轉(zhuǎn)液體系組別sgrnacas9蛋白o(hù)ligo電轉(zhuǎn)液第一組1.6μgsg1+1.6μgsg508-w10μg10μg120μl第二組3.3μgsg110μg10μg120μl第三組3.3μgsg508-w10μg10μg120μl4)將各組電轉(zhuǎn)液體系分別對(duì)3×106個(gè)細(xì)胞hek293進(jìn)行重懸，混合均勻后轉(zhuǎn)入電轉(zhuǎn)杯中，用電轉(zhuǎn)儀在620v，30ms的條件下，進(jìn)行電轉(zhuǎn)，其后將電轉(zhuǎn)細(xì)胞取出分別培養(yǎng)于60cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中。5)48小時(shí)后收集細(xì)胞，通過(guò)挑克隆篩選出囊腫性纖維化細(xì)胞模型。下面對(duì)實(shí)施例2中轉(zhuǎn)染后所得的細(xì)胞作一步的效果檢測(cè)。一、細(xì)胞基因組dna基因突變情況檢測(cè)方法：1)利用酚氯仿法分別提取實(shí)施例2中三組實(shí)驗(yàn)所得細(xì)胞的基因組dna。2)pcr擴(kuò)增在天一輝遠(yuǎn)公司合成上游擴(kuò)增引物(cf-test-f)與下游擴(kuò)增引物(cf-test-r)，其序列為：cf-test-f：5’attaagcacagtggaagaa3’(seqidno：7)；cf-test-r：5’taaccgattgaatatggag3’(seqidno：8)。利用此對(duì)引物分別以上述提取的三組基因組dna為模板，對(duì)其cftr基因突變位點(diǎn)進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增體系與條件如表4所示。表4pcr擴(kuò)增體系試劑體積taq酶0.4μl10×buffer5μldntp8μlcf-test-f(10nm)5μlcf-test-r(10nm)5μl細(xì)胞基因組dna反應(yīng)終濃度至50ng/μl水加至50μl總體系50μlpcr擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃5min；95℃30s、50℃30s、72℃30s，38個(gè)循環(huán)；72℃5min；16℃2min。pcr結(jié)束后利用pcr產(chǎn)物純化試劑盒(a9281，promega)分別對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行純化，獲得230bp大小的片段。3)高通量測(cè)序檢測(cè)將純化的pcr產(chǎn)物送往麻省綜合醫(yī)院(mgh)(https://dnacore.mgh.harvard.edu/new-cgi-bin/site/pages/admin_pages/login.jsp)進(jìn)行高通量檢測(cè)與分析，得到發(fā)生精確修飾的dna比例。結(jié)果：高通量測(cè)序結(jié)果如表5和圖1所示，從中可以看出，分別單獨(dú)使用sg1、sg508-w進(jìn)行細(xì)胞的基因突變，細(xì)胞基因組中發(fā)生堿基敲除的細(xì)胞數(shù)分別為24.71％、2.1％，但其中發(fā)生靶點(diǎn)敲除的細(xì)胞數(shù)分別為2.86％、0％，故這兩組的突變準(zhǔn)確率分別為11.57％、0％。而當(dāng)同時(shí)使用sg1與sg508-w這兩條sgrna進(jìn)行細(xì)胞的基因突變時(shí)，雖然細(xì)胞基因組中發(fā)生堿基敲除的細(xì)胞數(shù)為17.21％，比sg1單獨(dú)使用時(shí)的數(shù)量要少，但其中發(fā)生靶點(diǎn)敲除的細(xì)胞數(shù)并沒(méi)降低(2.8％)，細(xì)胞的突變準(zhǔn)確率達(dá)16.26％，顯著高于sg1、sg508-w單獨(dú)使用時(shí)的突變準(zhǔn)確率。這說(shuō)明本發(fā)明sg1與sg508-w這兩條sgrna同時(shí)使用時(shí)，更有利于細(xì)胞發(fā)生靶點(diǎn)堿基敲除，有效降低非靶點(diǎn)的堿基敲除，從而有效提高了細(xì)胞基因突變的精確修飾效率,可以提高基因編輯(基因敲入)效率，更有利于囊腫性纖維化細(xì)胞模型的成功構(gòu)建。其中的原理可能是：一條有效的sgrna(sg1)可能會(huì)讓另外一條低效的sgrna(sg508-w)具有較高的切割功能，其他研究發(fā)現(xiàn)，突變位點(diǎn)距離切割位點(diǎn)越近，其精確突變效率則越高，然而往往突變位點(diǎn)附近的sgrna效率可能并不高，本發(fā)明中的切割位點(diǎn)正好位于突變位點(diǎn)上，距離為0，在其遠(yuǎn)端再尋找一條高效的sgrna，該sgrna可提高突變位點(diǎn)附近的sgrna的效率，從而提高定點(diǎn)敲入的效率。本發(fā)明中當(dāng)sg508-w被sg1激活活，會(huì)帶來(lái)更高的精確突變效率。我們?cè)谄渌稽c(diǎn)上檢測(cè)的數(shù)據(jù)比表5中的會(huì)更好，但是不方便在本專利文件中公開。表5高通量測(cè)序結(jié)果上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。sequencelisting<110>佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院<120>雙sgrna介導(dǎo)的基因精確修飾方法及應(yīng)用<130><160>8<170>patentinversion3.5<210>1<211>23<212>rna<213>人工序列<400>1ccuaugaugaauauagauacaga23<210>2<211>23<212>rna<213>人工序列<400>2ccaaagaugauauuuucuuuaau23<210>3<211>61<212>dna<213>人工序列<400>3tgtaatacgactcactataggtctgtatctatattcatcatgttttagagctagaaatag60c61<210>4<211>61<212>dna<213>人工序列<400>4tgtaatacgactcactataggattaaagaaaatatcatcttgttttagagctagaaatag60c61<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列<400>5aaaagcaccgactcggtgcc20<210>6<211>111<212>dna<213>人工序列<400>6tgttctcagttttcctggattatgcctggcaccattaaagaaaatatcattggtgttttc60tatgatgaatatagatacagaagcgtcatcaaagcatgccaactagaagag111<210>7<211>19<212>dna<213>人工序列<400>7attaagcacagtggaagaa19<210>8<211>19<212>dna<213>人工序列<400>8taaccgattgaatatggag19當(dāng)前第1頁(yè)12