專利名稱：基因修飾CDR3δ移植型γδT淋巴細(xì)胞及其抑癌用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因修飾細(xì)胞及腫瘤治療領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及對(duì)T淋巴細(xì)胞進(jìn)行基因修飾以及通過(guò)所修飾的δ 2Τ淋巴細(xì)胞治療腫瘤的領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
腫瘤的免疫治療被人們寄予厚望，尤其是腫瘤特異性T淋巴細(xì)胞過(guò)繼性免疫療法被認(rèn)為是有發(fā)展?jié)摿Φ闹委煵呗浴Ｈ欢?，目前?shí)驗(yàn)性或臨床性試驗(yàn)并沒(méi)有出現(xiàn)令人滿意的療效。這可能與大多數(shù)腫瘤抗原性極其微弱甚至缺失、抗原提呈功能缺陷、表面MHC分子或協(xié)同刺激分子表達(dá)水平低下、荷瘤機(jī)體免疫抑制狀態(tài)等因素密切有關(guān)。此外，腫瘤病人體內(nèi)腫瘤特異性的細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTL)數(shù)量少，在體外很難分離和擴(kuò)增；體外長(zhǎng)時(shí)間的培養(yǎng)難以維持其腫瘤識(shí)別的特異性及其抗腫瘤的能力；T細(xì)胞系或者T細(xì)胞克隆的產(chǎn)生費(fèi)時(shí)，費(fèi)力。這些因素都限制了 T淋巴細(xì)胞過(guò)繼性免疫治療的廣泛應(yīng)用。最近，有科學(xué)家應(yīng)用基因工程技術(shù)能夠使α β T淋巴細(xì)胞表達(dá)腫瘤特異性的T細(xì)胞受體，從而提高T淋巴細(xì)胞對(duì)腫瘤抗原的特異識(shí)別能力。眾多實(shí)驗(yàn)室都獲得了病毒特異性或腫瘤特異性的基因工程淋巴細(xì)胞，并且在體外和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中證明了其抗腫瘤的能力。然而，α β T細(xì)胞識(shí)別腫瘤抗原的MHC限制性使得基因修飾的α β T淋巴細(xì)胞的臨床使用受到限制。腫瘤細(xì)胞表面MHC分子表達(dá)低下或者丟失，難以被基因修飾的α βΤ淋巴細(xì)胞識(shí)別，導(dǎo)致腫瘤免疫逃逸。而且，基因修飾的α β T淋巴細(xì)胞既要識(shí)別抗原，又同時(shí)識(shí)別遞呈抗原的MHC分子，因此，臨床應(yīng)用時(shí)需要分離各種各樣的不同MHC限制性抗原特異的T細(xì)胞克隆，并根據(jù)病人遞呈的肽段的MHC分子類型來(lái)確定能夠?qū)δ[瘤反應(yīng)的TCR。目前發(fā)現(xiàn)的腫瘤抗原特異性的TCR數(shù)目很少，而且只是針對(duì)少數(shù)如黑素?cái)?shù)瘤等癌癥的腫瘤相關(guān)性抗原。再者，用于轉(zhuǎn)染的α β T細(xì)胞受體主要識(shí)別蛋白抗原，很少識(shí)別另外兩種類型的腫瘤抗原碳水化合物和糖脂抗原。最后，內(nèi)源性和外源性的α鏈和β鏈可能形成混合TCR， 產(chǎn)生意外的抗原識(shí)別特異性，從而引發(fā)自身免疫性疾病。作為T細(xì)胞群體的另一類，Y δΤ細(xì)胞在抗腫瘤免疫治療中具有獨(dú)特的作用 ①Y S τ細(xì)胞主要以MHC非限制性方式識(shí)別抗原，它克服了 α β T細(xì)胞抗腫瘤免疫的MHC 限制性的局限；②抗原識(shí)別譜廣泛，如肽類、非肽類、醇類等，并且可識(shí)別α β T細(xì)胞不能識(shí)別的抗原，因此，在功能上可作為α β T細(xì)胞免疫監(jiān)視的重要補(bǔ)充；③腫瘤浸潤(rùn)的γ δ T淋巴細(xì)胞表達(dá)Fc受體，在TCR-CD3復(fù)合體的表達(dá)或/和組裝上有缺陷時(shí)，仍可傳遞信號(hào)，這是 α βΤ細(xì)胞所不具備的；④通過(guò)細(xì)胞毒作用和產(chǎn)生細(xì)胞因子來(lái)發(fā)揮效應(yīng)功能；⑤對(duì)血液系統(tǒng)腫瘤和實(shí)體瘤均有殺傷作用。但是，用于治療的Y δ T細(xì)胞制劑制備在方法上仍存在一些問(wèn)題亟待解決。如中晚期腫瘤患者或化療后患者體內(nèi)免疫抑制，導(dǎo)致種子細(xì)胞數(shù)量減少和免疫活性下降，致使體外擴(kuò)增細(xì)胞數(shù)量受限，難以達(dá)到治療所需量的細(xì)胞制劑。因此，利用基因工程技術(shù)，制備足夠數(shù)量的具有細(xì)胞腫瘤反應(yīng)特異性的、無(wú)/低毒性的Y S T免疫效應(yīng)細(xì)胞的研究勢(shì)在必行。
本實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期從事γ δ T細(xì)胞的研究，對(duì)γ δ TCR識(shí)別抗原的機(jī)制進(jìn)行了深入的探討。Y δ TCR的抗原識(shí)別位點(diǎn)主要存在于V δ鏈的互補(bǔ)決定區(qū)(⑶R)，其中⑶Rl和⑶R2 區(qū)是由胚系基因V編碼，而⑶R3區(qū)則是通過(guò)V(D)和J基因的體細(xì)胞重組形成的。以往的研究結(jié)果表明，Y S TCR與BCR和抗體在結(jié)構(gòu)上高度類似。CDR3長(zhǎng)度分布圖表明，抗體重鏈 (H)和TCR δ鏈⑶R3的長(zhǎng)度變化最大，且較輕鏈(L)和γ鏈者明顯的長(zhǎng)。這些結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)提示與抗體識(shí)別抗原過(guò)程中抗體重鏈⑶R3序列起著關(guān)鍵識(shí)別作用一樣，⑶R3S在Υ δΤ細(xì)胞識(shí)別抗原中也起著關(guān)鍵作用。實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)卵巢癌和正常卵巢組織中的TCR δ 2-⑶R3基因掃描及長(zhǎng)度多態(tài)性分析的結(jié)果顯示，正常卵巢組織中的TCRS 2-⑶R3基因片段呈多克隆表達(dá)；相比之下，卵巢癌組織中的TCR δ 2-⑶R3基因片段則呈寡克隆表達(dá)。二者片段長(zhǎng)度分布不均，后者長(zhǎng)度分布更為廣泛，并且具有更為明顯的優(yōu)勢(shì)片段長(zhǎng)度，這種長(zhǎng)度分布差異顯示Y ST細(xì)胞在卵巢癌的免疫反應(yīng)中有重要作用。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明人根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期從10例卵巢癌的TIL中分析得出的TCR δ 2_⑶R3序列，選取與腫瘤細(xì)胞有結(jié)合的0Τ3序列(FPSHIFHSTVVHT)。分別包裝含有0T3序列的全長(zhǎng)、δ TCR δ 2鏈與γ δ TCR γ 9鏈的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒，獲得的高滴度病毒后，感染經(jīng)抗⑶3抗體刺激的正常人PBMC，使其細(xì)胞膜表面表達(dá)TCR δ 2，命名為γ 9 δ 2 (0Τ3) T細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示γ9δ2(0Τ3)Τ細(xì)胞被多種腫瘤細(xì)胞蛋白刺激后，其TNF-α和IFN-γ分泌增加。同時(shí)，對(duì)多種腫瘤細(xì)胞也具有細(xì)胞毒作用。而且，這種細(xì)胞毒作用能被抗TCRy δ的單克隆抗體所阻斷。這些結(jié)果提示，Υ9 δ 2(0T3)T細(xì)胞能夠被腫瘤抗原活化，且具有抗腫瘤作用。 為了研究轉(zhuǎn)染細(xì)胞細(xì)胞毒的作用機(jī)制，發(fā)明人使用hs/i^sL途徑的抑制劑BFA和穿孔素 /顆粒酶途徑的抑制劑CMA進(jìn)行γ9δ2(0Τ3)Τ細(xì)胞的細(xì)胞毒阻斷實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BFA對(duì) Υ9 δ 2(0Τ3)Τ細(xì)胞腫瘤殺傷作用的最大抑制率僅有20 30% ；CMA對(duì)δ 2(0Τ3)Τ殺傷 Fas低表達(dá)的SK0V3細(xì)胞的殺傷活性抑制率可達(dá)56. 71%，對(duì)Fas高表達(dá)的H08910細(xì)胞的殺傷活性抑制率達(dá)33. 93%。聯(lián)合應(yīng)用CMA和BFA對(duì)γ 9 δ 2 (0Τ3) T細(xì)胞的細(xì)胞毒作用抑制率達(dá)60%以上。以上結(jié)果提示，γ9δ2(0Τ3)Τ細(xì)胞對(duì)腫瘤的細(xì)胞毒作用中，穿孔素/顆粒酶和hs/i^sL途徑都發(fā)揮作用，但穿孔素/顆粒酶途徑起主要作用，尤其在對(duì)Fas低表達(dá)的腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用中更為重要。發(fā)明人進(jìn)一步對(duì)Υ9δ2(0Τ3)Τ細(xì)胞體內(nèi)抑癌作用進(jìn)行了研究。通過(guò)荷人卵巢癌移植瘤裸鼠模型，腫瘤局部注射Υ9δ2(0Τ3)Τ細(xì)胞，觀察其對(duì)腫瘤的治療效果。結(jié)果顯示，Υ9δ2(0Τ3)Τ細(xì)胞配合IL-2治療，相對(duì)于空載體感染的細(xì)胞配合IL-2治療組，腫瘤的生長(zhǎng)明顯受到抑制，裸鼠的生存期也有所延長(zhǎng)。因此本發(fā)明一方面提供一種基因修飾⑶R3 δ移植型Υ9 δ 2Τ淋巴細(xì)胞，所述細(xì)胞的Y δ TCR γ 9鏈與γ δ TCRδ2鏈的CDR3區(qū)被0T3序列所置換，其中0T3序列是SEQ ID No :1。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，本發(fā)明的基因修飾⑶R3 δ移植型γ9δ2Τ淋巴細(xì)胞經(jīng)下述步驟獲得1)分別包裝含有0Τ3序列全長(zhǎng)的γ δ TCR δ 2鏈與γ δ TCR γ 9鏈的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒；幻使用獲得的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒感染經(jīng)抗CD3抗體刺激的正常人PBMC，使其細(xì)胞膜表面表達(dá)TCR γ δ。
實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明提供的基因修飾⑶R3 δ移植型Υ9 δ 2Τ淋巴細(xì)胞經(jīng)腫瘤細(xì)胞蛋白刺激后，TNF-α和IFN-Y分泌增加。這表明本發(fā)明的、δ T淋巴細(xì)胞具有廣泛的抗腫瘤作用。本發(fā)明提供的基因修飾⑶R3 δ移植型Υ 9 δ 2Τ淋巴細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞具有細(xì)胞毒作用。實(shí)驗(yàn)證明，在細(xì)胞毒作用中，穿孔素/顆粒酶和hs/i^sL途徑都發(fā)揮作用，但穿孔素 /顆粒酶途徑起主要作用，尤其在對(duì)Fas低表達(dá)的腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用中更為重要。本發(fā)明還提供本發(fā)明的基因修飾⑶R3 δ移植型γ9δ2Τ淋巴細(xì)胞用于制備抗腫瘤細(xì)胞制劑。本發(fā)明提供的抗腫瘤細(xì)細(xì)胞制劑可用于治療多種腫瘤，可治療的腫瘤包括Fas低表達(dá)的腫瘤?？芍委煹哪[瘤還包括卵巢癌、宮頸癌和B淋巴瘤等。本發(fā)明另一方面還提供將本發(fā)明的抗腫瘤細(xì)胞制劑與IL-2聯(lián)合使用，以獲得更好的治療效果。


圖1 轉(zhuǎn)染的PBLs細(xì)胞表達(dá)Y δ TCR(A)PCR擴(kuò)增移植特異性CDR3序列的全長(zhǎng)δ 2和γ 9鏈。1 γ 9鏈；2 δ 2。(B) 將含有pMSCVhyg- γ 9質(zhì)粒和pMSCVneo- δ (0Τ3)質(zhì)粒的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒感染經(jīng)抗CD3抗體活化的PBMC細(xì)胞，同時(shí)將空載體病毒顆粒感染的PBMC細(xì)胞作為對(duì)照。RT-PCR擴(kuò)增TCR γ 9 和TCR δ 2鏈全長(zhǎng)及各自的⑶R3區(qū)。左面1 提取自空載體病毒顆粒感染的PBMC細(xì)胞的 RNA, 2 含有TCR的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒感染的PBMC細(xì)胞的RNA ；右面使用含有TCR的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒感染的PBMC細(xì)胞的RNA作為模板進(jìn)行RT-PCR(1-5) 1 β -actin ；2 Y 9全長(zhǎng)；3 δ 2全長(zhǎng)；4 γ 9鏈的CDR3序列；5 δ 2鏈移植的來(lái)源于卵巢癌的CDR3序列；M :marker ；提取自空載體病毒顆粒感染的PBMC細(xì)胞的RNA作為模板，進(jìn)行RT-PCR(6-10) 6 β -actin ；7 Y 9全長(zhǎng)；8 δ 2全長(zhǎng)；9 γ 9鏈的⑶R3序列；10 δ 2鏈移植的來(lái)源于卵巢癌的⑶R3序列。
(C)Westernblotting檢測(cè)、δ TCR的表達(dá)。1 為轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞蛋白提取物(陰性對(duì)照)；2為TCR病毒感染的細(xì)胞蛋白提取物；3正常人、δ T細(xì)胞蛋白提取物(陽(yáng)性對(duì)照)。
(D)收集整合Y9和δ 2鏈的細(xì)胞(Y 9 δ 2 (0Τ3) T細(xì)胞)，空載體對(duì)照細(xì)胞，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞TCR γ δ的表達(dá)情況。左邊是空載體對(duì)照細(xì)胞；右邊是γ9δ2(0Τ3)Τ細(xì)胞。圖2 γ9δ2(0Τ3)Τ細(xì)胞的生物學(xué)功能(A) γ 9 δ 2 (0Τ3) T細(xì)胞以及空載體轉(zhuǎn)染的對(duì)照細(xì)胞與Daudi，Hela，SK0V3, H08910 以及Raji細(xì)胞蛋白提取物共同孵育72小時(shí)后，收集上清ELISA雙抗體夾心法檢測(cè)各組細(xì)胞IFN-γ分泌。(B) δ 2(0T3)T細(xì)胞以及空載體轉(zhuǎn)染的對(duì)照細(xì)胞與Daudi，Hela，SK0V3， H08910以及Raji細(xì)胞蛋白提取物共同孵育M小時(shí)后，收集上清ELISA雙抗體夾心法檢測(cè)各組細(xì)胞 TNF- α 分泌。*Ρ < 0. 05 ；< 0. 01。(C)MTT法檢測(cè)γ 9 δ 2 (0Τ3) T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性。Y 9 δ 2 (0Τ3) T細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，與腫瘤細(xì)胞(Hela，SK0V3, H08910)在不同的效靶比37°C孵育8小時(shí)，然后每孔加入10 μ L濃度為5mg/mL的MTT，繼續(xù)孵育4小時(shí)。加入DMSO終止反應(yīng)。圖3 γ 9 δ 2 (0Τ3) T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用被抗Y δ TCR抗體阻斷。(A) Υ9 δ 2(0Τ3)Τ細(xì)胞預(yù)先用抗、δ TCR抗體或同種型無(wú)關(guān)抗體(鼠IgGl對(duì)照抗體)封閉處理2小時(shí)，然后與不同腫瘤細(xì)胞蛋白提取物孵育72小時(shí)，收集上清ELISA雙抗體夾心法檢測(cè)各組IFN- γ的分泌。(B，C，D)作為效應(yīng)細(xì)胞的Y 9 δ 2 (0Τ3) T細(xì)胞預(yù)先用抗、S TCR抗體或同種型無(wú)關(guān)抗體(鼠IgGl對(duì)照抗體)處理2小時(shí)，然后與不同的腫瘤細(xì)胞在不同的效靶比下混合培養(yǎng)8小時(shí)，用MTT法檢測(cè)γ 9 δ 2 (0Τ3) T細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷活性。*Ρ < 0. 05 ；**Ρ < 0. 01圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞表面!^s的表達(dá)。圖5 γ 9 δ 2 (0Τ3) T細(xì)胞的殺傷機(jī)制。(A)BFA對(duì)γ9δ2(0Τ3)Τ細(xì)胞的細(xì)胞毒作用的影響。分別以不同濃度的BFA處理Υ9 δ 2(0T3)T細(xì)胞池后，再與靶細(xì)胞混合做殺傷試驗(yàn)，同時(shí)設(shè)溶劑對(duì)照。(B)CMA對(duì) γ9δ2(0Τ3)Τ細(xì)胞的細(xì)胞毒作用的影響。分別以不同濃度的CMA處理γ9δ2(0Τ3)Τ細(xì)胞
后，再與靶細(xì)胞混合作殺傷試驗(yàn)，同時(shí)設(shè)溶劑對(duì)照。(C) CMA (IOOnM)，BFA (25 μ Μ)以及聯(lián)合處理效應(yīng)細(xì)胞后，檢測(cè)Y 9 δ 2 (0Τ3) T對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。圖6 γ9δ2(0Τ3)Τ細(xì)胞體內(nèi)抗腫瘤作用。腫瘤細(xì)胞接種后，待皮下腫瘤結(jié)節(jié)長(zhǎng)到IOOmm3左右(約為10天)，將裸鼠隨機(jī)分成三個(gè)實(shí)驗(yàn)組，治療組瘤內(nèi)注射Y 9 δ 2 (0Τ3) T細(xì)胞(1 X IO6細(xì)胞/50 μ L/只，共8只)，空載體組瘤內(nèi)注射空載體感染的細(xì)胞(1 X IO6細(xì)胞/50 μ L/只，共8只)，PBS對(duì)照組瘤內(nèi)注射PBS (50 μ L/只，共8只)。除了 PBS組，其他兩組的動(dòng)物給予腹腔注射IL-25000U/只， 每隔三天治療一次，共進(jìn)行四次。每天觀察并記錄裸鼠的一般情況及生存情況；每隔2天測(cè)量腫瘤生長(zhǎng)情況和裸鼠體重。(A)治療M天后，荷人卵巢癌裸鼠外形以及其移植瘤的大小的照片。A, B :γ9δ2 (0Τ3)Τ ；C, D 空載體對(duì)照組；Ε, F =PBS對(duì)照組。(B)荷人卵巢癌裸鼠的腫瘤生長(zhǎng)。(C)荷人卵巢癌裸鼠的生長(zhǎng)曲線。(D)荷人卵巢癌裸鼠的體重變化。
具體實(shí)施例方式一、材料和方法1、細(xì)胞培養(yǎng)PBMC,為新鮮分離的正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞；Retrol^ack PT67是NIH3T3來(lái)源的包裝復(fù)制逆轉(zhuǎn)錄病毒細(xì)胞系，購(gòu)自Clontech Laboratories，hc。NIH3T3為小鼠成纖維細(xì)胞系。SKOV3，人類卵巢漿液性乳頭狀囊腺癌細(xì)胞系；H08910，人卵巢漿液性囊腺癌細(xì)胞系； Hela，人宮頸癌腫瘤細(xì)胞系；Daudi，人B淋巴瘤細(xì)胞系；Raji，人Burkitt淋巴瘤細(xì)胞系，均可從中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院細(xì)胞中心購(gòu)得。SK0V3細(xì)胞，以含10% FCS的McCoy 5A培養(yǎng)基進(jìn)行貼壁培養(yǎng)。Hela，NIH3T3和RetroPack PT67細(xì)胞，以含10% FCS的DMEM高糖培養(yǎng)基進(jìn)行貼壁培養(yǎng)。H08910，RajiJP Daudi，以含10% FCS的RPMI-1640培養(yǎng)基進(jìn)行貼壁或懸浮培養(yǎng)。2、動(dòng)物BALB/c裸小鼠，鼠齡4 6周，體重15 20g，雌性，購(gòu)于生物制品檢定所動(dòng)物中心，于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心無(wú)特定病原體(specific pathogen free, SPF)條件下的層流架中飼養(yǎng)。3、菌株和質(zhì)粒載體大腸桿菌DH5a，購(gòu)自寶生物工程有限公司?；蛐蜑閟upE44 Δ lacU169 ( Cp801acZAM15)hsdR17 recAl endl gyr96 thi-1 relAl，用于質(zhì)粒的擴(kuò)增與轉(zhuǎn)化。pGEM-T或pGEM-T Easy Vector System用于Taq酶擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物的克隆，購(gòu)自 Promega 公司。表達(dá) γ δ TCR用 pMSCVhyg 和 pMSCVneo 質(zhì)粒，購(gòu)自 Clontech Laboratories, Inc0 pcDNA3. 1- γ 9禾口 pcDNA3. 1- δ (0Τ3)分別為Y 9全長(zhǎng)基因的重組質(zhì)粒和CDR3區(qū)為0Τ3 序列替代的δ，由郗雪燕博士構(gòu)建，引自文獻(xiàn)X. Xi, Y. Guo, H. Chen, C. Xu, H. Zhang, H. Hu, L. Cui,D. Ba,and W. He,Antigen specificity of gammadelta T cells depends primarily on the flanking sequences of CDR3delta，J. Biol. Chem. 284(2009)27449-27455.4、引物(見(jiàn)表1)表1.用于擴(kuò)增Y δ TCR的Y和δ基因全長(zhǎng)的引物
權(quán)利要求
1.一種基因修飾⑶R3 δ移植型γ δ T淋巴細(xì)胞，其特征在于所述細(xì)胞的γ δ TCR是由Y 9鏈及⑶R3區(qū)被0Τ3序列置換的δ 2鏈組成，其中0Τ3序列是SEQ ID No :1。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因修飾⑶R3δ移植型δ 2Τ淋巴細(xì)胞，其特征在于所述細(xì)胞經(jīng)下述步驟獲得1)分別包裝含有0Τ3序列全長(zhǎng)的γ δ TCR δ 2鏈與γ δ TCR 鏈的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒；幻使用獲得的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒感染經(jīng)抗CD3抗體刺激的正常人PBMC， 使其細(xì)胞膜表面表達(dá)TCR γ 9 δ 2。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因修飾⑶R3δ移植型δ 2Τ淋巴細(xì)胞，其特征在于所述細(xì)胞經(jīng)腫瘤細(xì)胞蛋白刺激后，TNF-α和IFN-Y分泌增加。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因修飾⑶R3δ移植型δ 2Τ淋巴細(xì)胞，其特征在于所述細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞具有細(xì)胞毒作用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基因修飾⑶R3δ移植型δ 2Τ淋巴細(xì)胞，其特征在于所述細(xì)胞主要通過(guò)穿孔素/顆粒酶途徑發(fā)揮其對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的基因修飾CDR3δ移植型γ9δ2Τ淋巴細(xì)胞，其特征在于所述腫瘤細(xì)胞也可以是Fas低表達(dá)的腫瘤細(xì)胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基因修飾⑶R3δ移植型δ 2Τ淋巴細(xì)胞，其特征在于所述細(xì)胞通過(guò)i^s/i^sL途徑發(fā)揮其對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的基因修飾CDR3δ移植型γ 9 δ 2Τ淋巴細(xì)胞在制備抗腫瘤細(xì)胞制劑中的用途。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的基因修飾CDR3δ移植型δ 2Τ淋巴細(xì)胞在制備抗腫瘤細(xì)胞制劑中的用途，其中所述的腫瘤選自卵巢癌、宮頸癌、B淋巴瘤。
10.根據(jù)權(quán)利要求8-9任一項(xiàng)所述的基因修飾⑶R3δ移植型γ9δ2Τ淋巴細(xì)胞在制備抗腫瘤細(xì)胞制劑中的用途，其中所述的細(xì)胞制劑與IL-2聯(lián)合使用。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因修飾CDR3δ移植型γδT淋巴細(xì)胞及其抑癌用途。發(fā)明人通過(guò)分別包裝含有OT3序列(FPSHTFHSTVVHT)全長(zhǎng)的γδ TCRδ2鏈與γδ TCRγ9鏈的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒感染經(jīng)抗CD3抗體刺激的正常人PBMC，使其細(xì)胞膜表面表達(dá)TCRγδ，獲得基因修飾CDR3δ移植型γ9δ2T淋巴細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)證明該細(xì)胞對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有細(xì)胞毒作用。本發(fā)明因此為腫瘤的過(guò)繼性免疫治療提供了新的方法和策略。
文檔編號(hào)A61P15/00GK102453701SQ201010518490
公開(kāi)日2012年5月16日 申請(qǐng)日期2010年10月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月26日
發(fā)明者何維, 崔蓮仙, 趙慧, 郗雪艷 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所