專利名稱：基因轉(zhuǎn)移的修飾蛋白及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及綴合物I)可與人體細(xì)胞的特異性受體結(jié)合的生物活性肽或蛋白質(zhì)，和II)對(duì)核酸、尤其是DNA具有親和力，并且有包含核酸能力的高分子物質(zhì)，以及制備所說綴合物的方法。
此綴合物可與具有特異性受體的細(xì)胞結(jié)合，并可將綴合物中包含的核酸轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中。另外，本發(fā)明涉及用于基因治療的綴合物，其中基因可被轉(zhuǎn)移至人體的特異型細(xì)胞，特異性器官或腫瘤細(xì)胞。
已知大量具有生物活性的肽或蛋白質(zhì)，它們?cè)谙挛闹幸脖环Q作“生物活性肽”。
它們的例子是從自然界中得到的生物活性肽，例如在人體中顯示出生理作用的肽，如白細(xì)胞介素(IL))—1，—2，—3，—4，—5，—6，—7，—8，—9，—10，—11和—12，G—CSF，GM CSF，M—CSF，促紅細(xì)胞生成素，干細(xì)胞生長(zhǎng)因子(SCF)，mp1—配體，α—，β—和γ—干擾素，促生長(zhǎng)素抑制素、加壓素、胰島素、生長(zhǎng)激素和P物質(zhì)；通過修飾上述肽而得到的肽；從動(dòng)物中衍生的物質(zhì)，如鈴蟾肽；從微生物中衍生的物質(zhì)，如白喉毒素；從植物中衍生的物質(zhì)，如凝集素?？贵w也是生物活性肽，抗體不僅包括人的單克隆抗體也包括動(dòng)物的單克隆抗體。大多數(shù)生物活性肽可與相應(yīng)受體特異性地結(jié)合以激活它們的生理功能，抗體可與相應(yīng)抗原特異性地結(jié)合。
可溶的受體包括人體中存在的受體以及通過基因重組方法人工制備的受體。這些可溶受體象人體膜受體一樣可與配體特異性地結(jié)合。
據(jù)認(rèn)為通過使用上述特異性的結(jié)合可將特異的生物活性肽用作靶分子。例如，已嘗試用以下方法，其中白喉毒素與IL—6分子結(jié)合，并特異性地運(yùn)送至具有IL—6受體的腫瘤細(xì)胞，因而可殺死腫瘤細(xì)胞。另外，將抗腫瘤劑結(jié)合到可識(shí)別癌癥特異性抗原的單克隆抗體上以將抗腫瘤劑特異運(yùn)送至腫瘤細(xì)胞的方法也發(fā)展成有效的方法。
另外，在藥物傳送系統(tǒng)(DOS)中使用生物活性肽的方法在基因治療領(lǐng)域也很重要。George Y.Wu等人已開發(fā)出基因治療，其中聚賴氨酸(帶正電荷)通過化學(xué)方法與生物活性肽，如脫唾液酸血清類粘蛋白結(jié)合，此綴合物包含DNA質(zhì)粒(帶負(fù)電荷)以將DNA運(yùn)送到具有脫唾液酸糖蛋白受體的肝細(xì)胞中(J.Biol.Chem.，236，14621，1988)。通過靜脈內(nèi)注射，此綴合物可將此基因轉(zhuǎn)移至肝中，它很有希望成為有效的基因傳送系統(tǒng)。所要治療的疾病要依靠被傳送的基因。在基因治療的一種方法中，病毒的胸苷激酶基因被轉(zhuǎn)移至肝中，通過胸苷激酶被激活的抗病毒藥物9—(1，3—二羥—2—丙氧甲基)鳥嘌呤也被轉(zhuǎn)移，此抗病毒藥物只在肝中被激活，因而病毒疾病治療所產(chǎn)生的副作用較小。
當(dāng)核酸被施用于人體以進(jìn)行基因治療時(shí)，此核酸快速地被酶降解，否則DNA不能輕易進(jìn)入細(xì)胞。另外，在此基因治療中，當(dāng)基因插入基因組時(shí)，對(duì)一些插入部分而言細(xì)胞是不匹配的，或者說通過轉(zhuǎn)移基因表達(dá)的物質(zhì)有時(shí)與細(xì)胞不相匹配。所以，以下情況是必需的。
I)在核酸不被降解的條件下將核酸運(yùn)送至細(xì)胞。
II)核酸以高速轉(zhuǎn)移至細(xì)胞。
和核酸盡可能多地被轉(zhuǎn)移至需要治療的特異性細(xì)胞中。
針對(duì)上述問題的一個(gè)解決方案是使用一些聚合物來包裹核酸以抑制核酸的降解。另一個(gè)方法是將與細(xì)胞上特異性受體結(jié)合的配體與核酸包含物聯(lián)合，通過配體—受體結(jié)合，由細(xì)胞內(nèi)吞作用將核酸轉(zhuǎn)移至特異型細(xì)胞中，在這種情況下，有必要將包含有核酸的聚合物與作為配體的生物活性肽結(jié)合。
通常，當(dāng)生物活性肽通過化學(xué)反應(yīng)與修飾聚合物結(jié)合時(shí)，它們的生物活性趨于不相匹配，并通過不同的副反應(yīng)形成了副產(chǎn)品，使得難于維持所產(chǎn)生的藥物的質(zhì)量。此藥物需要保持不變的高質(zhì)量水平。有必要開發(fā)一種實(shí)用的方法，其中具有包含核酸能力的高分子物質(zhì)在適度的條件下可與生物活性肽特異地結(jié)合，而且在此方法中副反應(yīng)也應(yīng)該可以避免。
本發(fā)明涉及制備包含核酸的蛋白質(zhì)的方法，它包括在轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶存在下，將具有至少一個(gè)谷氨酰胺殘基的生物活性肽或蛋白質(zhì)與含有氨基酸供體，并且有包含核酸能力的高分子物質(zhì)反應(yīng)，在谷氨酰胺殘基的γ—位置處的酰胺部位與氨基酸供體的氨基基團(tuán)形成酰胺鍵。
本發(fā)明涉及生物活性肽或蛋白質(zhì)的綴合物，如白細(xì)胞介素—6和白細(xì)胞介素—2，以及具有包含基因能力的高分子物質(zhì)，如聚賴氨酸。
本發(fā)明涉及含有生物活性肽或蛋白質(zhì)的綴合物和具有包含基因能力的高分子物質(zhì)以及核酸的核酸組合物。
本發(fā)明也涉及用于基因轉(zhuǎn)移治療的藥物組合物，它包括所說綴合物和藥用可接受載體。
本發(fā)明也涉及用于基因轉(zhuǎn)移治療的藥物組合物，它包括所說核酸組合物和藥用可接受載體。


圖1所示為聚賴氨酸和IL—6的反應(yīng)溶液色譜圖。
圖2所示為經(jīng)純化的與聚賴氨酸結(jié)合的IL—6色譜圖。
圖3所示為IL—6和與聚賴氨酸結(jié)合的IL6體外活性結(jié)果。
圖4所示為與聚賴氨酸結(jié)合的IL—6和DNA組合物組成的電泳圖。
本發(fā)明人進(jìn)行了許多研究以解決上述問題，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在使用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的適度條件下，具有包含核酸能力的高分子物質(zhì)可與生物活性肽結(jié)合。
轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(EC 2.3.2.13)(系名蛋白質(zhì)—谷氨酰胺γ—谷氨?；D(zhuǎn)移酶)是一已知酶，通過它，肽或蛋白質(zhì)的谷氨酰胺殘基可與具有氨基基團(tuán)物質(zhì)的氨基基團(tuán)特異性地結(jié)合。在不同的文獻(xiàn)中已報(bào)道了轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，例如
(a)J.E.Folk et al.，Adv.Protein Chem.31，1—133，1977(b)J.E.Folk et al.，Adv.Enzymol，38，109—191，1973(c)H.Bohn et al.，Mol.Cell Biochem.20，67—75，1978(d)L.Lorand et al.，Handbook of Biochemistry andMolecular Biology，Vol.2，Proteins，ed G.D.Fasman，pp.669—685，ClevelandCRC.3rd ed.
(e)Guinea pig and rabbit liver transglutaminaseT.Abe etal.，Biochemistry，16，5495—5501(1977)(f)Human red blood cells transglutaminaseS.C.Brenner etal.，Biochem.Biophys.Acta.522，74—83，1978(g)Rat coagulating gland transglutaminaseJ.Wilson etal.，F(xiàn)ed.Proc.，38，1809(Abstr.)，(1979)根據(jù)tje起源已經(jīng)知道不同種類的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。它們的例子包括衍生于微生物的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶[細(xì)菌轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，下文簡(jiǎn)稱為“BTG”，它報(bào)道于H.Ando et al.，Agric.Biol.Chem.，53(10)，2613—2617(1989)，and K.Washizu et al.，Biosci.Biotech.Biochem.，58(1)，82—87(1994)]，和哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，如肝轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，血漿因子XIIIa，血小板和盤因子XIIIa，毛囊轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，表皮轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶以及前列腺轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。這些轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶中的任何一個(gè)都可用于本發(fā)明，優(yōu)選的是BTG。
在通過轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶結(jié)合中，反應(yīng)只在特定位置處進(jìn)行。因此，只形成很少幾種副產(chǎn)物，此反應(yīng)因而容易控制。另外由于酶解反應(yīng)，在化學(xué)反應(yīng)中可得到下列好處I)綴合物在特定位置處形成而不降低所結(jié)合物質(zhì)功能的可能性很大。
II)由于結(jié)合是在生理?xiàng)l件下進(jìn)行的，所結(jié)合的物質(zhì)不會(huì)變性。
III)由于質(zhì)量水平可以維持，則可以生成高質(zhì)量的藥物，產(chǎn)品可保持不變地具有獨(dú)特的、限定結(jié)構(gòu)。
同時(shí)，通過基因互相聯(lián)合的重組DNA方法可使蛋白質(zhì)互相結(jié)合，與重組DNA方法相比，使用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的方法具有下列優(yōu)點(diǎn)I)與重組DNA方法相比，此方法也可以結(jié)合不能直接由DNA合成的物質(zhì)，如糖鏈，糖蛋白，糖脂，PEG(聚乙二醇)等等。
II)重組DNA方法僅僅產(chǎn)生融合蛋白，其中蛋白質(zhì)與另一蛋白質(zhì)的N—末端或C—末端結(jié)合。
III)因?yàn)橹亟MDNA方法僅僅產(chǎn)生一融合蛋白，其中蛋白質(zhì)與另一蛋白質(zhì)的N—末端或C—末端結(jié)合，故活性中心存在于蛋白質(zhì)的末端。以致融合蛋白丟失其活性的可能性很大。
另一方面，當(dāng)使用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶時(shí)，具有氨基基團(tuán)的物質(zhì)只與谷氨酰胺的氨基基團(tuán)結(jié)合。因此，可得到不同于由重組DNA方法得到的綴合物，其中通過BTG控制結(jié)合，可維持兩種化合物的活性。
在轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶所使用的酶反應(yīng)條件下，具有包含核酸能力的高分子化合物可與生物活性肽結(jié)合。
例如，使用BTG時(shí)，反應(yīng)可在4至55℃的溫度下進(jìn)行，優(yōu)選30至50℃，pH值為5至8，優(yōu)選6至7。
測(cè)量轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性的方法本發(fā)明中所指的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性可按下述測(cè)量。即將含有芐氧基羰基—L—谷氨酰胺甘氨酸和羥胺作為底物的反應(yīng)系統(tǒng)與溶于tris—緩沖液的(PH6.0)動(dòng)物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶在37℃，5mM Ca2+存在下發(fā)生反應(yīng)，反應(yīng)系統(tǒng)與微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶反應(yīng)時(shí)不需要5mM Ca2+。所得到的異羥肟酸在三氟酯酸的存在下形成離子復(fù)合物，然后測(cè)量525nm下的吸收值，從校準(zhǔn)曲線上可計(jì)算出異羥肟酸的量。將1M異羥肟酸形成1分鐘所用氧氣的量定義為1個(gè)單元(1V)，也即轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性的單位。
本發(fā)明中含有氨基酸供體，并且有包含核酸能力的高分子物質(zhì)可以是分子中含有氨基基團(tuán)，并具有包含核酸，尤其是DNA能力的任何物質(zhì)，建議物質(zhì)應(yīng)滿足下列條件。
I)保護(hù)DNA使之不降解的能力強(qiáng)。
II)此物質(zhì)不應(yīng)在人體循環(huán)系統(tǒng)的任何部分被非特異性地捕獲。
III)此物質(zhì)不損害人體。
IV)當(dāng)DNA與受體聯(lián)合進(jìn)入細(xì)胞并在細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，此物質(zhì)不會(huì)起到有害作用。
滿足此條件的物質(zhì)優(yōu)選含有氨基基團(tuán)的肽或蛋白質(zhì)。由于DNA質(zhì)粒一般帶負(fù)電荷，則應(yīng)提及帶正電荷的高分子物質(zhì)，其分子量為5,000至200,000，優(yōu)選10,000至100,000，更優(yōu)選的是聚賴氨酸。
本發(fā)明中可以使用任何在氨基酸序列中含有谷氨酰胺，并特異性地與組織、器官、細(xì)胞或類似物結(jié)合的生物活性肽。以上提及的生物活性肽或蛋白質(zhì)是優(yōu)選的，更優(yōu)選的是白細(xì)胞介素—2和白細(xì)胞介素—6。
定向于核酸，尤其是DNA的生物活性肽，靶細(xì)胞和器官將在下文提及。
靶分子IL—2或抗—IL—2受體的抗體(抗α—鏈，β—鏈或γ—鏈的抗體)靶細(xì)胞，器官和治療目的1)IL—2受體有時(shí)在特異性的白血病細(xì)胞如ATL中表達(dá)，此細(xì)胞被消除。
2)當(dāng)移植器官或骨髓細(xì)胞時(shí)會(huì)發(fā)生排斥，排斥是由被激活的T—細(xì)胞引起的，此T—細(xì)胞表達(dá)IL—2受體，此細(xì)胞被消除。
3)在慢性風(fēng)濕病中，表達(dá)IL—2受體的淋巴細(xì)胞存在于局部，并參與自身—抗體的產(chǎn)生，可導(dǎo)致疾病的發(fā)作或發(fā)展，此淋巴細(xì)胞被消除。
靶分子IL—6或抗—IL—6受體的抗體(抗gp80或gpl30的抗體)靶細(xì)胞，器官和治療目的1)具有IL—6受體的白血病細(xì)胞，此白血病細(xì)胞被消除。
2)在慢性風(fēng)濕病中，表達(dá)IL—6受體的淋巴細(xì)胞存在于局部，并參與自身—抗體的產(chǎn)生，它可導(dǎo)致疾病的發(fā)作或發(fā)展，此淋巴細(xì)胞被消除。
靶分子抗—巨核細(xì)胞的抗體靶細(xì)胞，器官和治療目的具有巨核細(xì)胞特異性抗原的細(xì)胞，將與血小板減少癥有關(guān)的如IL—6，IL—11，mpl—配體或類似物的基因轉(zhuǎn)移至巨核細(xì)胞中以誘導(dǎo)巨核細(xì)胞有選擇性地增殖和成熟。
靶分子抗—CD34的抗體靶細(xì)胞，器官和治療目的具有CD34的骨髓瘤細(xì)胞。將遺傳缺乏基團(tuán)，例如，ADA(腺苷脫氨酶)轉(zhuǎn)移至骨髓瘤細(xì)胞治療遺傳疾病。此外，malti—藥物—抗性(MRD)基團(tuán)轉(zhuǎn)移到骨髓中使其具有藥物抗性，其后，通過化療治療腫瘤。
靶分子抗—CD4抗體靶細(xì)胞，器官和治療目的具有CD4的細(xì)胞。將抑制HIV增殖的基因轉(zhuǎn)移至受HIV感染的細(xì)胞中以治療AIDS。
靶分子聚合的HSA或抗—白蛋白受體的抗體靶細(xì)胞，器官和治療目的聚合的HSA與肝白蛋白受體結(jié)合。通過轉(zhuǎn)移相應(yīng)于肝細(xì)胞瘤的抗—致癌基因可治療肝細(xì)胞瘤。
靶分子抗—ErbB2抗體靶細(xì)胞，器官和治療目的
具有ErbB2的癌癥。通過將抗—致癌基因轉(zhuǎn)移至癌細(xì)胞可治療癌癥。
靶分子EGF靶細(xì)胞，器官和治療目的將抗—致癌基因轉(zhuǎn)移至具有EGF—受體的卵巢癌或類似癌的癌細(xì)胞中以治療癌癥。
靶分子抗大腸、結(jié)腸和直腸癌特異性抗原的抗體靶細(xì)胞，器官和治療目的將抗—致癌基因轉(zhuǎn)移至大腸、結(jié)腸和直腸癌的細(xì)胞中以治療癌癥。
帶正電的高分子物質(zhì)包括帶負(fù)電的DNA分子水溶液以保護(hù)DNA分子。有可能通過高分子物質(zhì)與靶分子生物活性肽結(jié)合所得的綴合物可與DNA分子混合以形成組合物，其中DNA包含于靶分子中。通過體內(nèi)給藥，此組合物可將基因特異性地轉(zhuǎn)移至相應(yīng)于靶分子的組織中，使蛋白質(zhì)的產(chǎn)生成為可能。在以下實(shí)施例中，聚賴氨酸被用作高分子物質(zhì)，然而包含DNA的分子并不局限于聚賴氨酸。對(duì)DNA其有某種親合力，對(duì)人體無(wú)害，難以被循環(huán)系統(tǒng)的某些部分捕捉的任何物質(zhì)都是適用的。
以下所列為本發(fā)明中生物活性肽或蛋白質(zhì)和具有包含核酸能力物質(zhì)的綴合物例子，以及綴合物和核酸組合物的例子，但本發(fā)明中綴合物和組合物不局限于此。
聚賴氨酸—IL—6/胸苷激酶基因表達(dá)質(zhì)粒將自殺基因轉(zhuǎn)移至表達(dá)IL—6受體的滑膜細(xì)胞以治療慢性風(fēng)濕病，通過插入自殺基因可治療具有IL—6受體的癌癥，如骨髓瘤。
聚賴氨酸—抗—CD14抗體/ADA基因表達(dá)質(zhì)粒SCID病人。將ADA基因轉(zhuǎn)移至造血干細(xì)胞的治療。
聚賴氨酸—抗—CD14抗體/β—球蛋白基因表達(dá)質(zhì)粒將正常的β—球蛋白基因引入造血干細(xì)胞以治療地中海貧血。
聚賴氨酸—抗—CD4抗體/胸苷激酶表達(dá)質(zhì)粒通過將自殺基因轉(zhuǎn)移至受HIV感染的下細(xì)胞中以治療AIDS。
聚賴氨酸—抗—CD4抗體/逆轉(zhuǎn)錄酶反義基因表達(dá)質(zhì)粒通過將HIV增殖抑制基因轉(zhuǎn)移至受HIV感染的T—細(xì)胞可治療AIDS。
在特定的適度條件下使用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，含有谷氨酰胺的生物活性肽或蛋白質(zhì)可在肽或蛋白質(zhì)的谷氨酰胺殘基處與含有氨基基團(tuán)并具有包含核酸(DNA或類似物)能力的高分子化合物結(jié)合。由于此綴合物可包含核酸而不失去生物活性肽或蛋白質(zhì)的任何特性，利用生物活性肽或蛋白質(zhì)可特異性地在組織、器官、細(xì)胞等處積累的特性，核酸可以高效率、選擇性地轉(zhuǎn)移至細(xì)胞中。相應(yīng)地，本發(fā)明也適用于基因治療等等。
參考以下實(shí)施例將更特別地闡明本發(fā)明，然而，本發(fā)明并不局限于這些實(shí)施例。
實(shí)施例1使用不同分子量的聚賴氨酸制備與聚賴氨酸結(jié)合的IL—6將10mg聚賴氨酸溴化物(分子量為7,900，45,700或83,800，由Sigma Co.出品)溶于4ml 50mM tris—HCl(ph7.5)中，在此溶液中加入50μIBTG溶液(14u/ml于50mMtris—HCl，pH7.5中)。將混合溶液在室溫下放置30分鐘，在混合溶液中加入2ml rhIL—6(重組的人IL—6)溶液(2mg/ml于10mM檸檬酸鈉，pH7.0中)，攪拌混合物，再在37℃下放置2.5小時(shí)(當(dāng)聚賴氨酸的分子量為7,900時(shí))或20小時(shí)(當(dāng)聚賴氨酸的分子量為45,700或83,800時(shí))。通過反相HPLC純化反應(yīng)溶液。
圖1所示為使用分子量為7,900的聚賴氨酸時(shí)反應(yīng)溶液的色譜圖。圖1中，峰1(22.14分鐘)表示聚賴氨酸，峰2(27.57分鐘)表示與聚賴氨酸結(jié)合的rh IL—6，峰3(29.66分鐘)表示rhIL—6。圖1中，4表示與聚賴氨酸結(jié)合的rhIL—6級(jí)分。
柱多孔層實(shí)心球蛋白質(zhì)C4 214TP54(4.6×250mm)溶劑A0.1％三氟醋酸(TFA)和B0.1％TFA80％乙腈流速1ml/min表1所示為色譜的洗脫程序。
表1洗脫程序時(shí)間(分鐘) A％ B％0.0 100 05.0 100 05.1604035.0 0 10050.0 0 100收集與聚賴氨酸結(jié)合的IL—6餾分，通過相同的反相HPCL濃縮，在超過5分鐘的期間，通過于A緩沖液中的B緩沖液濃度從0％至100％線性增加進(jìn)行洗脫(A和B溶劑(緩沖液)與圖1中相同)。通過凝膠過濾層析進(jìn)一步純化與聚賴氨酸結(jié)合的IL—6餾分。
柱Sephadex G—75(1×10cm)緩沖液20mM tris—HCl，0.5M NaCl(pH8.5)流速2ml/min通過HPLC測(cè)量由此純化的與聚賴氨酸結(jié)合的IL—6的純度，其色譜圖示于圖2。
在圖2—1中，峰(a)表示rh IL—6(保留時(shí)間為14.12分鐘)。
在圖2—2中，峰(b)表示與分子量為7,900的聚賴氨酸結(jié)合的rh IL—6(保護(hù)時(shí)間為12.38分鐘)。
在圖2—3中，峰(c)表示與分子量為45,700的聚賴氨酸結(jié)合的rhIL—6(保留時(shí)間為12.16分鐘)。
在圖2—4中，峰(d)表示與分子量為83,800的聚賴氨酸結(jié)合的rh IL—6(保留時(shí)間為11.46分鐘)。
HPLC的條件如下。
柱多孔層實(shí)心球蛋白質(zhì)C4 214TP54(4.6×250mm)溶劑A—0.1％三氟醋酸(TFA)B—0.1％TFA—80％乙腈流速1ml/min。
洗脫程序示于表2表2洗脫程序時(shí)間(分鐘) A％ B％0.0 60 4020.00 100所有經(jīng)純化的與聚賴氨酸結(jié)合的IL—6大約都顯示出單一的峰。
結(jié)果經(jīng)證明BTG具有使不同分子量的所有聚賴氨酸與IL—6結(jié)合的能力。
實(shí)施例2I)與聚賴氨酸結(jié)合的IL—6的體外活性方法
所用細(xì)胞系為亞克隆IL—6依賴的鼠雜交瘤MH60BSF2所得的MH60.32系(Matsuda T.et al.，Eur.J.Immunol.，18，951，1988)。在96孔培養(yǎng)板的每一孔都加入下列溶液。
a)在培養(yǎng)基中逐步稀釋的100μl樣品溶液。
b)在培養(yǎng)基中洗滌三次并懸浮于100μl培養(yǎng)基中的5×103MH60雜交瘤。在37℃，5％CO2存在下凈雜交瘤培養(yǎng)60小時(shí)后，使用MTT測(cè)定法測(cè)定細(xì)胞數(shù)目，MTT測(cè)定法按下述進(jìn)行。
在每孔中加入50μl MTT溶液(于大量1mg/ml PBS溶液中的3—(4，5—二甲基噻唑—2—基)—2，5，—二苯四唑溴化物)，培養(yǎng)完成后，移出150ml上清液，在殘留物中加入100μl MTT溶液(20％SDS0.04NHCl溶液)，將此混合物培養(yǎng)過夜。通過微量培養(yǎng)板讀數(shù)器測(cè)量光吸收值(從570m至630nm)實(shí)施例2中所用培養(yǎng)基是PRMI 1640(Gibco)和10％FCS(滅活的)。結(jié)果有關(guān)MH60的增殖活性，與聚賴氨酸結(jié)合的IL—6(分子量為7,900)體外活性的結(jié)果示于圖3。從結(jié)果看，它遵循與聚賴氨酸結(jié)合的IL—6活性等于IL—6活性，與分子量為45,700或83,800的聚賴氨酸結(jié)合的與聚賴氨酸結(jié)合的IL—6也顯示出與IL—6活性相等的活性。
II)與聚賴氨酸結(jié)合的IL—6的體內(nèi)活性方法給健康的約6周齡的體重約為25克的ICR—系小鼠皮下注射樣品(0.1ml)。此樣品用PBS稀釋并懸浮于PBS中。一組試驗(yàn)動(dòng)物含有5只動(dòng)物。樣品一天(白天和晚上)給藥兩次，一直到第5天早上共9次。末次給藥后4至8小時(shí)，收集每只試驗(yàn)動(dòng)物的心血并與抗凝劑混合。自收集血液起3小時(shí)內(nèi)，用檢測(cè)抗性變化的方法對(duì)血小板數(shù)目計(jì)數(shù)。計(jì)算出每單位體積血小板的平均數(shù)目。結(jié)果使用與分子最為7,900的聚賴氨酸結(jié)合的聚賴氨酸結(jié)合的IL—6時(shí)的結(jié)果示于表3。從表3中可清楚地看出與IL—6相比，聚賴氨酸—IL—6在體內(nèi)增加了血小板數(shù)目。
與分子量為45,700或83,800的聚賴氨酸結(jié)合的與聚賴氨酸結(jié)合的IL—6顯示出與表3所示相同的活性。
表3聚賴氨酸rh IL—6的體內(nèi)活性(血小板數(shù)目的增加
p><p>實(shí)施例3與聚賴氨酸結(jié)合的IL—6和DNA組合物的形成方法1μlDNA溶液(2μg/μl)中加入100μl與聚賴氨酸結(jié)合的IL—6(0.3mg/ml于0.2M檸檬酸鈉，pH6.0中)，用渦流攪拌器將混合物攪拌15秒鐘，再在室溫下放置30分鐘以形成兩種成分的組合物，將與聚賴氨酸結(jié)合的IL—6和DNA的組合物以及單獨(dú)的DNA在0.8％瓊脂膠上跑電泳以在溴化乙錠存在下，用紫外光證實(shí)組合物的形成能力。結(jié)果I)電泳圖示于圖4，在圖4中，1和4是標(biāo)記物(用λ-HindIII消化過)，2是質(zhì)粒載體(pSV—β—半乳糖苷酶載體)，3是DN和與聚賴氨酸結(jié)合的IL—6的組合物。
如圖4所示，當(dāng)DNA與與賴氨酸結(jié)合的IL—6形成組合物時(shí)，在0.8％瓊脂凝膠上跑不了電泳，只停留在原來的位置。這是因?yàn)槭褂肂TG制備的與聚賴氨酸結(jié)合的IL—6與DNA形成了組合物，因此，經(jīng)證明與聚賴氨酸結(jié)合的IL—6有與DNA形成組合物的能力。
在圖4中，使用了與分子量為7,900的聚賴氨酸結(jié)合的與聚賴氨酸結(jié)合的IL—6。當(dāng)使用與分子量為45,700或83,800的聚賴氨酸結(jié)合的與聚賴氨酸結(jié)合的IL—6時(shí)，提供了相同的結(jié)果。
實(shí)施例4用與聚賴氨酸結(jié)合的IL—6(1)將基因特異性地轉(zhuǎn)移至含有IL—6受體的細(xì)胞中方法將用與實(shí)施例3相同的方法制備的，含有20μg DNA和10μg與聚賴氨酸結(jié)合的IL—6的組合物加入培養(yǎng)細(xì)胞中，將傳代培養(yǎng)物細(xì)胞裝入1×1056—孔培養(yǎng)板中的2ml培養(yǎng)基中，培養(yǎng)幾小時(shí)，以上提及的與聚賴氨酸結(jié)合的IL—6/DNA組合物被加入其中，在37℃，5％CO2存在下將培養(yǎng)物培養(yǎng)48小時(shí)，然后按上述測(cè)定β—半乳糖苷酶的表達(dá)量。
關(guān)于細(xì)胞，分別地，U266被用作含有IL—6受體的細(xì)胞，CEM被用作沒有IL—6受體的細(xì)胞。pSV—β—半乳糖苷酶載體(由Promega，USA出品)被用作DNA。根據(jù)Promega技術(shù)簡(jiǎn)報(bào)(參考文獻(xiàn)，F(xiàn).C.Lucibello et al.，Met.Mol.CellBiol.，Vol.1，9，1989)測(cè)定β—半乳糖苷酶的活性。結(jié)果結(jié)果示于表4。從表4中可明顯看出，含有IL—6受體的細(xì)胞U266與不具有IL—6受體的細(xì)胞CEM相比，顯示出顯著高的β—半乳糖苷酶活性。
另外，在U266中，和結(jié)合有聚賴氨酸的IL—6和DNA的組合物一起培養(yǎng)的細(xì)胞與單獨(dú)同結(jié)合有聚賴氨酸的IL—6或DNA一起培養(yǎng)的細(xì)胞相比，其β—半乳糖苷酶的活性較高。
表4用聚賴氨酸IL—6轉(zhuǎn)移β—半乳糖苷酶(lac Z)基因左405—595nm處的吸收值細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基U266CEM空白對(duì)照0.080.07培養(yǎng)基對(duì)照物0.300.25含有DNA有培養(yǎng)基 0.290.23含有與聚賴氨酸(分子量為7,900)結(jié)合 0.340.24的rh IL—6的培養(yǎng)基含有與聚賴氨酸(分子量為45,700)結(jié)0.250.23合的rh IL—6的培養(yǎng)基含有與聚賴氨酸(分子量為83,800)結(jié)0.350.25合的rh IL—6培養(yǎng)基含有與聚賴氨酸(分子量為7,900)結(jié)合 1.080.24的rh IL—6/DNA組合物的培養(yǎng)基含有與聚賴氨酸(分子量為45,700)結(jié)1.100.25合的rh IL—6/DNA組合物的培養(yǎng)基含有與聚賴氨酸(分子量為83,800)結(jié)1.030.23實(shí)施例5用與聚賴氨酸結(jié)合的IL—6(2)將基因特異性地轉(zhuǎn)移至含有IL—6受體的細(xì)胞中方法用與實(shí)施例3相同的方法制備與聚賴氨酸結(jié)合的IL—6以及DNA和與聚賴氨酸結(jié)合的IL—6的組合物。在含有DNA的培養(yǎng)基中，含有與聚賴氨酸結(jié)合的IL—6的培養(yǎng)基中以及含有DNA和與聚賴氨酸結(jié)合的IL—6的組合物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。DNA，與聚賴氨酸結(jié)合的IL—6以及DNA和與聚賴氨酸結(jié)合的IL—6的組合物所加入的量以及培養(yǎng)方法與實(shí)施例3中相同。U266或U937被用作含有IL—6受體的細(xì)胞，Hepg2或Hep3B被用作不含IL—6受體的細(xì)胞。
在所用的與聚賴氨酸結(jié)合的IL—6中聚賴氨酸的分子量為7,900，所用DNA是pSV2CAT(Gorman，C.M.et al.，Mol.Cell Biol.，2，1044，1982)。
通過Murray法測(cè)定氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)活性(Murray，I.A.，et al.，Nucleic Acids Res.，19，6648，1991)。結(jié)果結(jié)果示于表5，從表5中可明顯看出加入DNA和與聚賴氨酸結(jié)合的IL—6的組合物培養(yǎng)的細(xì)胞與單獨(dú)加入DNA或與聚賴氨酸結(jié)合的IL—6培養(yǎng)的細(xì)胞相比，顯示出顯著高的CAT活性。
表5用與聚賴氨酸結(jié)合的rh IL—6轉(zhuǎn)移CAT基因CPM×103細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基U266U937 HepG2Hep3B空白對(duì)照 0.1 0.1 0.1 0.1培養(yǎng)基對(duì)照物 3.0 2.2 4.5 3.5含有DNA的培養(yǎng)基 4.3 2.3 5.0 4.5含有與聚賴氨酸結(jié)合的rh IL—63.2 3.3 4.5 3.5的培養(yǎng)基含有與聚賴氨酸結(jié)合的rh IL—25.215.2 10.0 12.06/DNA組合物的培養(yǎng)基
權(quán)利要求
1.制備包含核酸的蛋白質(zhì)的方法，包括在轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶存在下，將具有至少一個(gè)谷氨酰胺殘基的生物活性肽或蛋白質(zhì)與含有氨基酸供體，并具有包含核酸能力的高分子物質(zhì)反應(yīng)，以在谷氨酰胺殘基的γ—位置處的酰胺部位與氨基酸供體的氨基基團(tuán)形成酰胺鍵。
2.如權(quán)利要求1的方法，其中轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶是衍生于微生物的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。
3.可由權(quán)利要求1方法制備的生物活性肽或蛋白質(zhì)與具有包含基因能力的高分子物質(zhì)的綴合物。
4.如權(quán)利要求3的綴合物，其中高分子物質(zhì)是聚賴氨酸。
5.如權(quán)利要求3或4的綴合物，其中生物活性蛋白質(zhì)是白細(xì)胞介素—6。
6.如權(quán)利要求3或4的綴合物，其中生物活性蛋白質(zhì)是白細(xì)胞介素—2。
7.核酸組合物，包含如權(quán)利要求3所述的生物活性肽或蛋白質(zhì)與具有包含基因能力的高分子物質(zhì)的綴合物以及核酸。
8.如權(quán)利要求7的核酸組合物，其中核酸是DNA。
9.如權(quán)利要求7或8的核酸組合物，其中綴合物是權(quán)利要求4，5和6中任何一個(gè)中所提及的一個(gè)。
10.用于基因轉(zhuǎn)移治療的藥物組合物，包括權(quán)利要求3至6中任何一個(gè)所提及的綴合物以及藥用可接受載體。
11.用于基因轉(zhuǎn)移治療的藥物組合物，包括權(quán)利要求7至9中任何一個(gè)所提及的核酸組合物以及藥用可接受載體。
全文摘要
本發(fā)明涉及制備包含核酸的蛋白質(zhì)的方法，包括在轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶存在下，將具有至少一個(gè)谷氨酰胺殘基的生物活性肽或蛋白質(zhì)與含有氨基酸供體，并具有包含核酸能力的高分子物質(zhì)反應(yīng)，以在欲氨酰胺殘基的γ-位置處的酰胺部位與氨基酸供體的氨基基團(tuán)形成酰胺鍵以及核酸包含物。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1129737SQ9511685
公開日1996年8月28日 申請(qǐng)日期1995年9月28日 優(yōu)先權(quán)日1994年9月29日
發(fā)明者高原義之, 山田尚之, 本木正雄 申請(qǐng)人:味之素株式會(huì)社