一種基于基因修飾的復(fù)合多孔骨支架及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種基于基因修飾的復(fù)合多孔骨支架及其制備方法和應(yīng)用，所述基于基因修飾的復(fù)合多孔骨支架包括復(fù)合多孔骨支架以及分散在所述復(fù)合多孔骨支架中的重組慢病毒顆粒，其中，所述重組慢病毒顆粒含有編碼骨生長(zhǎng)因子的基因，本發(fā)明提供了的基因修飾的復(fù)合多孔骨支架具有優(yōu)異的生物相容性和可降解性，可在原位較長(zhǎng)時(shí)間表達(dá)骨再生因子，并且蛋白因子的活性不受到影響，從而有效促進(jìn)細(xì)胞向骨缺損部位遷移，達(dá)到骨修復(fù)的目的。
【專利說(shuō)明】
一種基于基因修飾的復(fù)合多孔骨支架及其制備方法和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)組織工程【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種基于基因修飾的復(fù)合多孔骨支架及其制備方法和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]疾病、創(chuàng)傷、感染、骨壞死、先天性畸形、骨腫瘤等原因造成的骨缺損尤其是臨界性骨缺損的修復(fù)和功能重建一直是骨科臨床的難題之一。骨缺損治療傳統(tǒng)的生物治療方法包括自體骨移植和異體骨移植。自體骨移植通常被看做是治療骨缺損的“黃金法則”，但是其應(yīng)用因供體有限，取材困難及易引起感染、出血、神經(jīng)損傷、功能缺失等問(wèn)題而受到很大的限制；異體骨移植雖然不受數(shù)量來(lái)源限制，但異體骨容易引起排斥反應(yīng)，通過(guò)加工處理可降低異體骨的排斥反應(yīng)，但其自身成骨誘導(dǎo)和骨生成作用已遭到破壞，存在新骨替代緩慢，生物力學(xué)性能較差等問(wèn)題，進(jìn)而影響治療效果。骨組織工程技術(shù)克服了傳統(tǒng)骨缺損移植技術(shù)的缺點(diǎn)，是目前再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)研究熱點(diǎn)。
[0003]目前，傳統(tǒng)方法所構(gòu)建骨組織工程支架由于缺乏骨誘導(dǎo)和骨傳導(dǎo)等特性，不能很好地起到修復(fù)骨組織的目的。為了提高骨的再生能力，通常將許多生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、趨化因子等具有生物活性的蛋白被加入到支架中，利用骨組織工程技術(shù)構(gòu)建含有促進(jìn)骨再生的活性蛋白成分的復(fù)合支架，來(lái)達(dá)到骨組織再生的目的。但是，在支架的制備過(guò)程中，把生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子等具有生物活性的蛋白成分直接加入到制備骨支架所需要采用的有機(jī)溶劑中，會(huì)造成蛋白活性功能降低或喪失；其次，活性蛋白在支架中的半衰期較短，移植體內(nèi)環(huán)境會(huì)快速的被降解失活。
[0004]因此，有必要提供一種能有效提高骨的再生能力的骨組織工程支架。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明實(shí)施例提供了一種基于基因修飾的復(fù)合多孔骨支架及其制備方法和應(yīng)用，該基因修飾的復(fù)合多孔骨支架具有優(yōu)異的生物相容性和可降解性，可在原位較長(zhǎng)時(shí)間表達(dá)骨再生因子，并且蛋白因子的活性不受到影響，從而有效促進(jìn)細(xì)胞向骨缺損部位遷移，達(dá)到骨修復(fù)的目的。
[0006]第一方面，本發(fā)明提供了一種基于基因修飾的復(fù)合多孔骨支架，所述基于基因修飾的復(fù)合多孔骨支架包括復(fù)合多孔骨支架以及分散在所述復(fù)合多孔骨支架中的重組慢病毒顆粒，其中，所述重組慢病毒顆粒含有編碼骨生長(zhǎng)因子的基因。
[0007]在本發(fā)明一實(shí)施例中，所述骨生長(zhǎng)因子為轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子家族(TGFs)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)、血小板衍生生長(zhǎng)因子(TOGF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)中的至少一種。
[0008]在本發(fā)明一優(yōu)選實(shí)施例中，所述骨生長(zhǎng)因子為BMP、TGF-13, bFGF、PDGF-BB, VEGF或 IGF。
[0009]在本發(fā)明一實(shí)施例中，所述重組慢病毒顆粒分散的方式為所述重組慢病毒顆粒通過(guò)物理吸附作用吸附在所述復(fù)合多孔骨支架的孔壁上。
[0010]在本發(fā)明一實(shí)施例中，所述重組慢病毒顆粒分散的方式為所述重組慢病毒顆粒通過(guò)多孔性骨支架的孔洞或微孔空間限制作用分布在孔洞或微孔中。
[0011]在本發(fā)明一實(shí)施例中，所述重組慢病毒顆粒均勻分散在所述復(fù)合多孔骨支架中。
[0012]在本發(fā)明一實(shí)施例中，所述重組慢病毒顆粒采用第三代慢病毒表達(dá)質(zhì)粒載體制備，所述第三代慢病毒表達(dá)質(zhì)粒載體包括但不限于pLenti6/5V-DEST。
[0013]在本發(fā)明一實(shí)施例中，所述復(fù)合多孔骨支架為可降解聚合物與含有鈣磷的工程材料的復(fù)合多孔骨支架，其中，所述含有鈣磷的工程材料包括但不限于磷酸三鈣或磷酸鈣。
[0014]在本發(fā)明一實(shí)施例中，所述復(fù)合多孔骨支架為可降解聚合物與羥基磷灰石的復(fù)合多孔骨支架。
[0015]在本發(fā)明一優(yōu)選實(shí)施例中，所述可降解聚合物選自聚3-羥基丁酸酯(PHB)、3-羥基丁酸-3羥基戊酸共聚酯(PHBV)、聚己內(nèi)酯(PCL)、聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸-乳酸共聚物(PLGA)和聚乙醇酸(PGA)中的至少一種。
[0016]在本發(fā)明一優(yōu)選實(shí)施例中，所述可降解聚合物和所述羥基磷灰石的質(zhì)量比為1.5 ?8:1。
[0017]更優(yōu)選地，在本發(fā)明一實(shí)施例中，所述可降解聚合物和所述羥基磷灰石的質(zhì)量比為2?3:1。
[0018]在本發(fā)明一實(shí)施例中，所述復(fù)合多孔骨支架為聚羥基丁酸羥基己酸酯/羥基磷灰石(PHBHHx/HAp)復(fù)合多孔骨支架。
[0019]如本發(fā)明所述的，“/”僅表示“與、和”的意思，為行業(yè)內(nèi)常用表達(dá)方式，并不限定本發(fā)明復(fù)合多孔骨支架的組分或結(jié)構(gòu)。
[0020]在本發(fā)明一優(yōu)選實(shí)施例中，所述聚羥基丁酸羥基己酸酯和所述羥基磷灰石的質(zhì)量比為1.5?8:1。
[0021]更優(yōu)選地，在本發(fā)明一實(shí)施例中，所述聚羥基丁酸羥基己酸酯和所述羥基磷灰石的質(zhì)量比為2?3:1。
[0022]在本發(fā)明一優(yōu)選實(shí)施例中，所述聚羥基丁酸羥基己酸酯的平均質(zhì)量Mn為5萬(wàn)?80萬(wàn)，聚合度為300?40000。
[0023]本發(fā)明采用的可降解聚合物和所述羥基磷灰石的質(zhì)量比優(yōu)選為2?3:1，可降解聚合物占比過(guò)高，羥基磷灰石的占比變低，制備出來(lái)的支架強(qiáng)度不夠高；反之，可降解聚合物占比過(guò)低，羥基磷灰石的占比變高，制備出來(lái)的支架降解太快；比如，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，所述聚羥基丁酸羥基己酸酯和羥基磷灰石的質(zhì)量比為1:1的時(shí)候，制備出來(lái)的支架強(qiáng)度不夠。
[0024]在本發(fā)明一實(shí)施例中，所述復(fù)合多孔骨支架具有多個(gè)孔洞，孔洞的連通率大于97%。
[0025]在本發(fā)明一實(shí)施例中，所述復(fù)合多孔骨支架具有多個(gè)孔洞，所述孔洞的孔徑為100?500微米。
[0026]在本發(fā)明一實(shí)施例中，所述復(fù)合多孔骨支架具有多個(gè)孔洞，所述孔洞的孔壁上形成有多個(gè)微孔，所述微孔的孔徑為5?100微米，孔深I(lǐng)?50微米，
[0027]在本發(fā)明一實(shí)施例中，所述復(fù)合多孔骨支架具有多個(gè)孔洞，所述多孔性骨支架的孔隙率為80?95%。
[0028]在本發(fā)明一實(shí)施例中，所述復(fù)合多孔骨支架為長(zhǎng)方體、圓柱體、正方體或橫截面為菱形的柱體，但不限于此。
[0029]在本發(fā)明一實(shí)施例中，所述復(fù)合多孔骨支架的大小為O?2.5)mm,但不限于此，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)具體細(xì)胞培養(yǎng)條件選擇并制備合適的相應(yīng)大小的復(fù)合多孔骨支架。
[0030]本發(fā)明提供的基于基因修飾的復(fù)合多孔骨支架具有優(yōu)異的生物相容性和可降解性，可在原位較長(zhǎng)時(shí)間表達(dá)骨再生因子，并且蛋白因子的活性不受到影響，從而有效促進(jìn)細(xì)胞向骨缺損部位遷移，達(dá)到骨修復(fù)的目的。
[0031]第二方面，本發(fā)明提供了一種基于基因修飾的復(fù)合多孔骨支架的制備方法，包括如下步驟:
[0032]I)提供或制備復(fù)合多孔骨支架、重組慢病毒顆粒；
[0033]2)按照如下操作的任意一種將所述重組慢病毒顆粒均勻負(fù)載在所述復(fù)合多孔骨支架中，得到基于基因修飾的復(fù)合多孔骨支架:
[0034]a)將所述含有重組慢病毒顆粒的溶液滴加到所述復(fù)合多孔骨支架上，將所述滴加了液體的復(fù)合多孔骨支架置于-50?-20°C下孵育15?30min，得到所述基于基因修飾的復(fù)合多孔骨支架；
[0035]b)使用電噴圖設(shè)備，在電場(chǎng)力作用下將含有重組慢病毒顆粒的溶液沉積在所述復(fù)合多孔骨支架的表面及內(nèi)部孔洞中，得到所述基于基因修飾的復(fù)合多孔骨支架；
[0036]其中，所述基于基因修飾的復(fù)合多孔骨支架包括復(fù)合多孔骨支架以及分散在所述復(fù)合多孔骨支架中的重組慢病毒顆粒，其中，所述重組慢病毒顆粒含有編碼骨生長(zhǎng)因子的基因。
[0037]在本發(fā)明一實(shí)施例中，所述步驟(2a)中，將所述含有重組慢病毒顆粒的溶液滴加到所述復(fù)合多孔骨支架上后，再滲透30?60分鐘，然后再置于-50?-20°C下孵育15?30mino
[0038]在本發(fā)明一優(yōu)選實(shí)施例中，所述步驟(2a)中，所述滲透30?60分鐘后的方法包括:真空條件下，將所述滴加了液體的復(fù)合多孔骨支架靜置30?60分鐘，或真空條件下，將所述滴加了液體的復(fù)合多孔骨支架置于器皿中翻轉(zhuǎn)使得含有重組慢病毒顆粒的溶液充分流入、滲入支架孔洞中。
[0039]在本發(fā)明一實(shí)施例中，所述步驟(2a)中，采用真空低溫冷凍設(shè)備對(duì)所述滴加了液體的復(fù)合多孔骨支架進(jìn)行孵育。
[0040]本發(fā)明采用真空低溫冷凍設(shè)備中對(duì)滴加了液體的復(fù)合多孔骨支架進(jìn)行共孵育，便于含有骨生長(zhǎng)因子的慢病毒與PHBHHx/HAp支架進(jìn)行充分的吸附結(jié)合。
[0041]本發(fā)明在步驟(2b)中采用電噴圖設(shè)備，利用液體在電場(chǎng)力作用下形成大頸縮比的穩(wěn)定射流和納米級(jí)霧化沉積滴，從而將慢病毒顆粒可控沉積在復(fù)合多孔骨支架的表面及內(nèi)部孔洞中。
[0042]在本發(fā)明一實(shí)施例中，所述步驟(2b)中，所述電噴圖設(shè)備沉積的功率為2.4X 16 ?1.76X 107kw
[0043]在本發(fā)明一實(shí)施例中，所述步驟(2b)中，所述電噴圖設(shè)備沉積的速度為0.1?100 μ L/min。
[0044]在本發(fā)明一實(shí)施例中，所述步驟(2b)中，所述電噴圖設(shè)備沉積的流量為2.0X10—11 ?3.810_nm3/s。
[0045]在本發(fā)明一優(yōu)選實(shí)施例中，所述含有重組慢病毒顆粒的溶液中，病毒滴度為1.0X106?1.85X 108TU/ml，但不限于此，本領(lǐng)域技術(shù)人員當(dāng)然可以使用更高滴度的病毒液，以達(dá)到更好的效果。
[0046]在本發(fā)明一實(shí)施例中，若無(wú)特殊說(shuō)明，所述步驟(2a)或(2b)的操作為在低溫進(jìn)行。
[0047]在本發(fā)明一優(yōu)選實(shí)施例中，若無(wú)特殊說(shuō)明，所述步驟(2a)或(2b)的操作為在4?10°c下進(jìn)行。在本發(fā)明一實(shí)施例中，所述步驟(2)中，所述骨生長(zhǎng)因子為轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子家族(TGFs)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)、血小板衍生生長(zhǎng)因子(TOGF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)中的至少一種。
[0048]在本發(fā)明一優(yōu)選實(shí)施例中，所述步驟⑵中，所述骨生長(zhǎng)因子為BMP、TGF-13、bFGF、PDGF-BB、VEGF 和 IGF 中的至少一種。
[0049]在本發(fā)明一實(shí)施例中，所述步驟(2)中，所述重組慢病毒顆粒分散的方式為所述重組慢病毒顆粒通過(guò)物理吸附作用吸附在所述復(fù)合多孔骨支架的孔壁上。
[0050]在本發(fā)明一實(shí)施例中，所述步驟(2)中，所述重組慢病毒顆粒分散的方式為所述重組慢病毒顆粒通過(guò)多孔性骨支架的孔洞或微孔空間限制作用分布在孔洞或微孔中。
[0051]在本發(fā)明一實(shí)施例中，所述步驟(2)中，所述重組慢病毒顆粒均勻分散在所述復(fù)合多孔骨支架中。
[0052]在本發(fā)明一實(shí)施例中，所述步驟(2)中，所述重組慢病毒顆粒采用第三代慢病毒表達(dá)質(zhì)粒載體制備，所述第三代慢病毒表達(dá)質(zhì)粒載體包括但不限于pLenti6/5V-DEST。
[0053]在本發(fā)明一實(shí)施例中，所述步驟(2)中，所述復(fù)合多孔骨支架為可降解聚合物與含有鈣磷的工程材料的復(fù)合多孔骨支架，其中，所述含有鈣磷的工程材料包括但不限于磷酸三鈣或磷酸鈣。
[0054]在本發(fā)明一實(shí)施例中，所述步驟(2)中，所述復(fù)合多孔骨支架為可降解聚合物與羥基磷灰石的復(fù)合多孔骨支架。
[0055]在本發(fā)明一優(yōu)選實(shí)施例中，所述步驟(2)中，所述可降解聚合物選自聚3-羥基丁酸酯(PHB)、3_羥基丁酸-3羥基戊酸共聚酯(PHBV)、聚己內(nèi)酯(PCL)、聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸-乳酸共聚物(PLGA)和聚乙醇酸(PGA)中的至少一種。
[0056]在本發(fā)明一優(yōu)選實(shí)施例中，所述可降解聚合物和所述羥基磷灰石的質(zhì)量比為1.5 ?8:1。
[0057]更優(yōu)選地，在本發(fā)明一實(shí)施例中，所述可降解聚合物和所述羥基磷灰石的質(zhì)量比為2?3:1。
[0058]在本發(fā)明一實(shí)施例中，所述步驟(2)中，所述復(fù)合多孔骨支架為聚羥基丁酸羥基己酸酯/羥基磷灰石(PHBHHx/HAp)復(fù)合多孔骨支架。
[0059]在本發(fā)明一優(yōu)選實(shí)施例中，所述聚羥基丁酸羥基己酸酯和所述羥基磷灰石的質(zhì)量比為1.5?8:1。
[0060]更優(yōu)選地，在本發(fā)明一實(shí)施例中，所述聚羥基丁酸羥基己酸酯和所述羥基磷灰石的質(zhì)量比為2?3:1。[0061 ] 在本發(fā)明一優(yōu)選實(shí)施例中，所述聚羥基丁酸羥基己酸酯的平均質(zhì)量Mn為5萬(wàn)?80萬(wàn)，聚合度為300?40000。
[0062]在本發(fā)明一實(shí)施例中，所述步驟(2)中，所述復(fù)合多孔骨支架具有多個(gè)孔洞，孔洞的連通率大于97%。
[0063]在本發(fā)明一實(shí)施例中，所述步驟(2)中，所述復(fù)合多孔骨支架具有多個(gè)孔洞，所述孔洞的孔徑為100?500微米。
[0064]在本發(fā)明一實(shí)施例中，所述步驟(2)中，所述復(fù)合多孔骨支架具有多個(gè)孔洞，所述孔洞的孔壁上形成有多個(gè)微孔，所述微孔的孔徑為5?100微米，孔深I(lǐng)?50微米，
[0065]在本發(fā)明一實(shí)施例中，所述步驟(2)中，所述復(fù)合多孔骨支架具有多個(gè)孔洞，所述多孔性骨支架的孔隙率為80?95%。
[0066]在本發(fā)明一實(shí)施例中，所述步驟(2)中，所述復(fù)合多孔骨支架為長(zhǎng)方體、圓柱體、正方體或橫截面為菱形的柱體，但不限于此。
[0067]在本發(fā)明一實(shí)施例中，所述復(fù)合多孔骨支架的大小為O?2.5)mm,但不限于此，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)具體細(xì)胞培養(yǎng)條件選擇并制備合適的相應(yīng)大小的復(fù)合多孔骨支架。
[0068]在本發(fā)明一優(yōu)選實(shí)施例中，所述步驟(I)中，所述復(fù)合多孔骨支架為聚羥基丁酸羥基己酸酯/羥基磷灰石(PHBHHx/HAp)復(fù)合多孔骨支架，所述PHBHHx/HAp復(fù)合多孔骨支架由如下方法制得:
[0069](01)將聚羥基丁酸羥基己酸酯溶解在第一有機(jī)溶劑中，得到聚羥基丁酸羥基己酸酯溶液，其中，所述聚羥基丁酸羥基己酸酯和第一有機(jī)溶劑的質(zhì)量體積比為1:10?15 ；
[0070](02)將直徑為200?400nm的羥基磷灰石加入到步驟(01)的聚羥基丁酸羥基己酸酯溶液中，得到混合溶液，所述混合溶液中，所述聚羥基丁酸羥基己酸酯和羥基磷灰石的質(zhì)量比為1.5?8:1 ；
[0071](03)將步驟(02)所得的混合溶液加入3D打印設(shè)備中打印成型，得到復(fù)合骨支架，將所得復(fù)合骨支架放入-20?-40°C下6?10小時(shí)后，轉(zhuǎn)移到真空低溫冷凍干燥裝置中，在-20?50°C下干燥3?5天，得到所述PHBHHx/HAp復(fù)合多孔骨支架。
[0072]在本發(fā)明上述優(yōu)選實(shí)施例中，所述步驟(01)中，所述第一有機(jī)溶劑優(yōu)選為三氯甲烷，但不限于此。
[0073]本發(fā)明提供的基于基因修飾的復(fù)合多孔骨支架的制備方法，從基因水平出發(fā)，采用重組慢病毒顆粒修飾復(fù)合多孔骨支架，并可根據(jù)骨再生需要可較長(zhǎng)時(shí)間原位表達(dá)骨再生生長(zhǎng)因子，促進(jìn)成骨前體細(xì)胞或干細(xì)胞等細(xì)胞定向成骨分化，從而實(shí)現(xiàn)骨再生的目的，進(jìn)而有效地解決了傳統(tǒng)支架制備方法制備的骨支架的活性蛋白功能降低和半衰期較短的問(wèn)題；此外，本發(fā)明提供的制備方法采用的復(fù)合多孔骨支架具有優(yōu)異的生物相容性和可降解性。
[0074]本發(fā)明提供的基于基因修飾的復(fù)合多孔骨支架的制備方法成本低廉，在患者承受范圍之內(nèi)，可以在臨床中廣泛使用。
[0075]第三方面，本發(fā)明還提供了一種如第一方面所述的基于基因修飾的復(fù)合多孔骨支架或如第二方面所述的基于基因修飾的復(fù)合多孔骨支架的制備方法在制備骨修復(fù)材料中的應(yīng)用。
[0076]本發(fā)明的有益.效果
[0077]本發(fā)明提供的基于基因修飾的復(fù)合多孔骨支架具有優(yōu)異的生物相容性和可降解性，可在原位較長(zhǎng)時(shí)間表達(dá)骨再生因子，并且蛋白因子的活性不受到影響，從而有效促進(jìn)細(xì)胞向骨缺損部位遷移，達(dá)到骨修復(fù)的目的。本發(fā)明提供的基于基因修飾的復(fù)合多孔骨支架的制備方法成本低廉，可以在臨床中廣泛使用。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0078]圖1是本發(fā)明實(shí)施例1提供的制備PHBHHx/HAp復(fù)合多孔骨支架的流程圖。
[0079]圖2為本發(fā)明實(shí)施例3提供的制備基因修飾的PHBHHx/HAp復(fù)合多孔骨支架的流程圖。
[0080]圖3為本發(fā)明實(shí)施例3提供的熒光顯微鏡觀察結(jié)果。
[0081]圖4為細(xì)胞遷移數(shù)結(jié)果。
[0082]圖5為病毒從支架上的釋放效率結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
[0083]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)指出，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0084]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
[0085]下述實(shí)施例中所用的方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法，具體步驟可參見(jiàn):((Molecular Cloning:A Laboratory Manual)) (Sambrook, J., Russell, David W.，MolecularCloning:A Laboratory Manual, 3rd edit1n, 2001, NY, Cold Spring Harbor)。
[0086]若無(wú)特別說(shuō)明，本發(fā)明實(shí)施例采用的試劑皆為市售商品。
[0087]實(shí)施例1
[0088]圖1為種制備PHBHHx/HAp復(fù)合多孔骨支架的方法的流程圖，結(jié)合圖1，本發(fā)明實(shí)施例提供了一種制備PHBHHx/HAp復(fù)合多孔骨支架的方法，包括如下步驟:
[0089]步驟(I):以聚羥基丁酸羥基己酸酯為原料即PHBHHx (平均質(zhì)量Mn = 30萬(wàn)，平均聚合度為15000)，用三氯甲烷做溶劑，制備聚羥基丁酸羥基己酸酯溶液，其中聚羥基丁酸羥基己酸酯與三氯甲烷的質(zhì)量體積(w/v)比為1:10，在50°C條件下磁力攪拌回流2h，使聚羥基丁酸羥基己酸酯材料完全溶解在三氯甲烷中，形成均勻的溶液；
[0090]步驟(2):將直徑為200nm的羥基磷灰石顆粒即HAp，加入到(I)所形成的溶液中，其中聚羥基丁酸羥基己酸酯溶液與羥基磷灰石顆的質(zhì)量比(w/w)為1:4，37°C條件下磁力攪拌2h形成均勻的溶液；
[0091]步驟(3):將步驟(2)中的混合溶液加入3D打印設(shè)備中，在預(yù)先設(shè)定的成型支架的參數(shù)下進(jìn)行三維支架的構(gòu)建，得到PHBHHx/HAp復(fù)合多孔骨支架；
[0092]步驟(4):將3D打印的PHBHHx/HAp復(fù)合多孔骨支架放入_40°C低溫冰箱8h，然后迅速轉(zhuǎn)移支架到真空低溫冷凍干燥裝置中，進(jìn)行一周的真空干燥，以便三維支架中的三氯甲烷充分揮發(fā)；然后進(jìn)行無(wú)菌消毒處理(即采用75%酒精浸泡30min，紫外照射2.5h)，得到所述PHBHHx/HAp復(fù)合多孔骨支架(即圖1中的PHBHHx/HAp復(fù)合多孔支架)，所述PHBHHx/HAp復(fù)合多孔骨支架的孔隙率為80?95%，孔洞的孔徑為100?500微米。
[0093]實(shí)施例2
[0094]本發(fā)明實(shí)施例提供了一種克隆重組慢病毒顆粒的制備方法，包括如下步驟:
[0095]步驟(I):按照分子生物學(xué)的方法和步驟，將血小板衍性生長(zhǎng)因子BB(PDGF-BB)基因序列，克隆到含有綠色熒光蛋白(在本發(fā)明其他實(shí)施例中，可以采用紅色熒光蛋白)作為報(bào)告基因的第三代慢病毒表達(dá)載體上，隨后進(jìn)行克隆子的測(cè)序篩選，得到含有正確PDGF-BB基因序列的表達(dá)載體，其中，所述第三代慢病毒表達(dá)載體為pLenti6/5V-DEST，所述TOGF-BB基因序列的Genebank登錄號(hào)為NM_011057.3，所述TOGF-BB基因插入病毒載體的Spe I和Sal I位點(diǎn)；
[0096]步驟(2):按照標(biāo)準(zhǔn)的磷酸鈣轉(zhuǎn)染法包裝所述含有TOGF-BB的表達(dá)載體，得到所述重組慢病毒顆粒，方法如下:
[0097]1.在轉(zhuǎn)染的前一天，在1cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中接種293FT細(xì)胞，其密度為8 X 15
[0098]2.在轉(zhuǎn)染的前三個(gè)小時(shí)，所有的細(xì)胞培養(yǎng)皿換成新鮮的培養(yǎng)基
[0099]3.37°C條件下，溶解所有的轉(zhuǎn)染試劑，并混合轉(zhuǎn)染試劑和質(zhì)粒DNA，準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染復(fù)合物，室溫靜置30分鐘(輔助質(zhì)粒:pLPl，pLP2, pVSV-G)
[0100]4.每一個(gè)1cm培養(yǎng)皿中加入Iml轉(zhuǎn)染復(fù)合物，在37°C，5%C02條件下培養(yǎng)48-72h
[0101]5.收集上清，25000rpm離心2h，獲得慢病毒顆粒。
[0102]步驟(3):對(duì)所述重組慢病毒顆粒進(jìn)行效價(jià)滴度測(cè)定，滴度為1.85 X 108TU/ml。
[0103]實(shí)施例3
[0104]結(jié)合圖2，本發(fā)明實(shí)施例提供了一種基因修飾的PHBHHx/HAp復(fù)合多孔骨支架的制備方法，包括如下步驟:
[0105]步驟(I):在4°C條件下，將實(shí)施例2制備的重組慢病毒顆粒按體積比為1:5?10的比例溶解在磷酸鹽緩沖液，得到重組慢病毒顆粒溶液(在本發(fā)明其他實(shí)施例中，可以采用H-DMEM培養(yǎng)基，或其它不影響慢病毒顆?；钚缘娜芤?；
[0106]在4°C條件下，將所述重組慢病毒顆粒溶液滴加在實(shí)施例1制備的PHBHHx/HAp復(fù)合多孔骨支架上，等支架表面上的液滴充分被吸收后(約放30分鐘?60分鐘)，置于真空低溫冷凍設(shè)備中共孵育30min，利用羥基磷灰石本身特性使重組慢病毒顆粒與PHBHHx/HAp復(fù)合多孔骨支架進(jìn)行充分的吸附結(jié)合；
[0107]步驟(2):用磷酸鹽緩沖液沖洗步驟(I)中負(fù)載重組慢病毒顆粒的PHBHHx/HAp復(fù)合多孔骨支架，以便除去多余的沒(méi)有結(jié)合到支架上的重組慢病毒顆粒，得到所述。
[0108]圖2為本發(fā)明實(shí)施例3的流程示意圖，圖2A?E分別表基因修飾的PHBHHx/HAp復(fù)合多孔骨支架示:
[0109]A:PHBHHx/HAp復(fù)合多孔骨支架；B:重組慢病毒顆粒；C:PHBHHx/HAp復(fù)合多孔骨支架負(fù)載重組慢病毒顆粒；D:低溫冷凍干燥重組慢病毒顆粒-支架復(fù)合體；E:基因修飾的PHBHHx/HAp復(fù)合多孔骨支架。
[0110]為充分說(shuō)明本發(fā)明的有效效果，驗(yàn)證基因修飾的PHBHHx/HAp復(fù)合多孔骨支架上的慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞的能力，本發(fā)明實(shí)施例還提供了效果實(shí)施例，包括如下步驟:將HEK-293T和Raw264.7細(xì)胞分別接種到實(shí)施例3制備的基因修飾的PHBHHx/HAp復(fù)合多孔骨支架上，在48h和72h可以分別觀察到綠色熒光在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。
[0111]圖3為熒光顯微鏡觀察結(jié)果，Raw264.7(小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞)和HEK-293T(人源胚胎的腎細(xì)胞)細(xì)胞轉(zhuǎn)染的結(jié)果分別如圖3(A)和圖3(B)所示。由圖3可知，本發(fā)明提供的PHBHHx/HAp復(fù)合多孔骨支架可以轉(zhuǎn)染Raw264.7和HEK-293T細(xì)胞，并在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)表達(dá)骨再生生長(zhǎng)因子，且所標(biāo)的的骨再生生長(zhǎng)因子能維持在一定的濃度范圍，有效延長(zhǎng)了活性蛋白的半衰期。
[0112]細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)證明本發(fā)明提供的PHBHHx/HAp復(fù)合多孔骨支架可以促進(jìn)細(xì)胞遷移，具有成骨能力；其中，所述細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)的步驟為:
[0113]1.取細(xì)胞培養(yǎng)板，設(shè)置陰性對(duì)照孔、陽(yáng)性對(duì)照孔和實(shí)驗(yàn)組，其中，陰性對(duì)照孔只添加DMEM培養(yǎng)基，陽(yáng)性對(duì)照孔添加DMEM培養(yǎng)基和10% FBS,實(shí)驗(yàn)組添加DMEM培養(yǎng)基以及負(fù)載慢病毒的PHBHHx/HAp復(fù)合多孔骨支架(按實(shí)施例3方法制備，體積為每孔添加1個(gè)支架)，分別接種MSCs (間充質(zhì)干細(xì)胞)，密度為5X 105個(gè)/mL。
[0114]2.培養(yǎng)48h后，把PHBHHx/HAp復(fù)合多孔骨支架移到遷移小室下方，遷移小室上方接種MSCs，密度為5父104個(gè)/11^，在371:，5% C02條件下培養(yǎng)72h。
[0115]3.利用流式細(xì)胞術(shù)來(lái)計(jì)數(shù)細(xì)胞從遷移小室上方遷移到下方的數(shù)量。
[0116]結(jié)果如圖4所示，縱坐標(biāo)為細(xì)胞遷移數(shù)的相對(duì)值，柱-1、柱-2和柱-3分別表示DMEM對(duì)照組、DMEM-10% FBS對(duì)照組、以及LV-PHBHHx/HAp復(fù)合多孔骨支架實(shí)驗(yàn)組，由于FBS中有一定量的生長(zhǎng)因子，因此，DMEM-10% FBS對(duì)照組的細(xì)胞遷移數(shù)高于DMEM對(duì)照組，而LV-PHBHHx/HAp復(fù)合多孔骨支架實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞遷移數(shù)最高，說(shuō)明本發(fā)明提供的基因修飾的復(fù)合多孔骨支架能促進(jìn)細(xì)胞遷移。
[0117]實(shí)施例4
[0118]本發(fā)明實(shí)施例提供了一種基因修飾的PHBHHx/HAp復(fù)合多孔骨支架的制備方法，包括如下步驟:
[0119]步驟(1):在4°C條件下，將實(shí)施例2制備的重組慢病毒顆粒按體積比為1:5?10比例溶解在磷酸鹽緩沖液(在本發(fā)明其他實(shí)施例中，可以采用Η-DMEM培養(yǎng)基，或其它不影響慢病毒顆粒活性的溶液)；
[0120]步驟(2)使用電噴圖設(shè)備，利用液體在電場(chǎng)力作用下形成大頸縮比的穩(wěn)定射流和納米級(jí)霧化沉積滴(所述電噴圖設(shè)備沉積的功率為2.4X 106kw，所述電噴圖設(shè)備沉積的速度為0.1 μ L/min，所述電噴圖設(shè)備沉積的流量為2.0X 10-nm3/s)，從而將慢病毒顆?？煽爻练e在實(shí)施例1制備的無(wú)菌PHBHHx/HAp支架表面及其內(nèi)部，得到所述基因修飾的PHBHHx/HAp復(fù)合多孔骨支架。
[0121]步驟(3):將HEK-293T和Raw264.7細(xì)胞分別接種到步驟⑵所制備的基因修飾的PHBHHx/HAp復(fù)合多孔骨支架上，在48h和72h可以分別觀察到綠色熒光在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。
[0122]由實(shí)施例3和4可知，本發(fā)明實(shí)施例提供的方法所制備的的含有生長(zhǎng)因子基因修飾的PHBHHx/HAp支架，不僅具有良好的生物相容性和機(jī)械性能，而且可以有效緩釋生長(zhǎng)因子TOGF-BB的長(zhǎng)期釋放，誘導(dǎo)體內(nèi)局部或全身性的成骨前體細(xì)胞或干細(xì)胞向骨組織受損部位的遷移，從而促進(jìn)成骨前體細(xì)胞或干細(xì)胞在骨缺損處向成骨細(xì)胞的定向分化，從而達(dá)到修復(fù)骨缺損的目的。
[0123]為充分說(shuō)明本發(fā)明的有益效果，本發(fā)明還提供了對(duì)比實(shí)施例，本對(duì)比實(shí)施例采用侵泡的方法2.將制備好的多孔支架浸泡在慢病毒溶液中，并檢測(cè)病毒從支架上的釋放效率步驟如下:
[0124]1.多孔支架的制備如前所述
[0125]2.將制備好的多孔支架浸泡在慢病毒溶液中，孵育30?60min
[0126]3.用PBS緩沖液洗滌支架三次，去除未結(jié)合的病毒
[0127]4.將支架和293T細(xì)胞共培養(yǎng)72h
[0128]5.利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)慢病毒的釋放數(shù)目。
[0129]此外，本發(fā)明還對(duì)實(shí)施例3提供的基因修飾的PHBHHx/HAp復(fù)合多孔骨支架進(jìn)行檢測(cè):其病毒從支架上的釋放效率如圖5所示。在圖5中，浸泡方法的實(shí)驗(yàn)組(對(duì)比實(shí)施例所制備的侵泡法所得支架)和冷凍干燥方法的實(shí)驗(yàn)組(實(shí)施例3所制備的復(fù)合多孔骨支架)的慢病毒釋放數(shù)目差異較大，實(shí)施例3所制備的復(fù)合多孔骨支架的慢病毒釋放數(shù)目大，說(shuō)明本發(fā)明提供的基因修飾的復(fù)合多孔骨支架慢病毒釋放效率較高。
[0130]對(duì)于本【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種基于基因修飾的復(fù)合多孔骨支架，其特征在于，所述基于基因修飾的復(fù)合多孔骨支架包括復(fù)合多孔骨支架以及分散在所述復(fù)合多孔骨支架中的重組慢病毒顆粒，其中，所述重組慢病毒顆粒含有編碼骨生長(zhǎng)因子的基因。
2.如權(quán)利要求1所述的基于基因修飾的復(fù)合多孔骨支架，其特征在于，所述骨生長(zhǎng)因子為轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子家族(TGFs)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)、血小板衍生生長(zhǎng)因子(TOGF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)中的至少一種。
3.如權(quán)利要求1所述的基于基因修飾的復(fù)合多孔骨支架，其特征在于，所述復(fù)合多孔骨支架為可降解聚合物與含有鈣磷的工程材料的復(fù)合多孔骨支架，其中，所述含有鈣磷的工程材料為磷酸三鈣、磷酸鈣或羥基磷灰石。
4.如權(quán)利要求3所述的基于基因修飾的復(fù)合多孔骨支架，其特征在于，所述可降解聚合物和所述羥基磷灰石的質(zhì)量比為1.5?8:1。
5.一種基于基因修飾的復(fù)合多孔骨支架的制備方法，其特征在于，包括如下步驟: 1)提供或制備復(fù)合多孔骨支架、重組慢病毒顆粒； 2)按照如下操作的任意一種將所述重組慢病毒顆粒均勻負(fù)載在所述復(fù)合多孔骨支架中，得到所述基于基因修飾的復(fù)合多孔骨支架: a)將含有所述重組慢病毒顆粒的溶液滴加到所述復(fù)合多孔骨支架上，將所述滴加了液體的復(fù)合多孔骨支架置于-50?-20°C下孵育15?30min，得到所述基于基因修飾的復(fù)合多孔骨支架； b)使用電噴圖設(shè)備，在電場(chǎng)力作用下將含有重組慢病毒顆粒的溶液沉積在所述復(fù)合多孔骨支架的表面及內(nèi)部孔洞中，得到所述基于基因修飾的復(fù)合多孔骨支架； 其中，所述基于基因修飾的復(fù)合多孔骨支架包括復(fù)合多孔骨支架以及分散在所述復(fù)合多孔骨支架中的重組慢病毒顆粒，其中，所述重組慢病毒顆粒含有編碼骨生長(zhǎng)因子的基因。
6.如權(quán)利要求5所述的基于基因修飾的復(fù)合多孔骨支架的制備方法，所述骨生長(zhǎng)因子為轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子家族(TGFs)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)、血小板衍生生長(zhǎng)因子(TOGF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)中的至少一種。
7.如權(quán)利要求5所述的基于基因修飾的復(fù)合多孔骨支架的制備方法，其特征在于，所述復(fù)合多孔骨支架為可降解聚合物與含有鈣磷的工程材料的復(fù)合多孔骨支架，其中，所述含有鈣磷的工程材料為磷酸三鈣、磷酸鈣或羥基磷灰石。
8.如權(quán)利要求7所述的基于基因修飾的復(fù)合多孔骨支架的制備方法，其特征在于，所述可降解聚合物和所述羥基磷灰石的質(zhì)量比為1.5?8:1。
9.如權(quán)利要求5所述的基于基因修飾的復(fù)合多孔骨支架的制備方法，其特征在于，所述電噴圖設(shè)備進(jìn)行沉積的速度為0.1?lOOyL/min，沉積的流量為2.0X10_n?3.8Xl(TV/s。
10.一種如權(quán)利要求1所述的基于基因修飾的復(fù)合多孔骨支架或如權(quán)利要求5所述的基于基因修飾的復(fù)合多孔骨支架的制備方法在制備骨修復(fù)材料中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61L27/54GK104383603SQ201410647550
【公開(kāi)日】2015年3月4日 申請(qǐng)日期:2014年11月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月14日
【發(fā)明者】任培根, 李健, 滕斌 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院