專利名稱：防治缺血性腦中風(fēng)的藥物組合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用取代的苯甲酸酯類化合物制備用于防治缺血性腦中風(fēng)的藥物、用于防治缺血性腦中風(fēng)的含有取代的苯甲酸酯類化合物的藥物組合物及其制備方法，本發(fā)明還涉及防治缺血性腦中風(fēng)的方法。
腦中風(fēng)是一種發(fā)病率高的致人于死的疾病，其生存者難以完全康復(fù)，腦中風(fēng)對(duì)患者身心打擊及對(duì)其家人經(jīng)濟(jì)影響極大。僅在美國就有200萬人由于腦中風(fēng)而殘疾，據(jù)美國心臟血管協(xié)會(huì)統(tǒng)計(jì)，由于腦中風(fēng)所引起的治療和生產(chǎn)力減少所導(dǎo)致的損失在1987年一年就高達(dá)128億美元之多。
75％的腦中風(fēng)屬于缺血性腦中風(fēng)。目前尚無有效的防治缺血性腦中風(fēng)的藥物。絕大部分缺血性腦中風(fēng)乃因腦血管的暫時(shí)性收縮痙孿而引起，其作用機(jī)理可能是因?yàn)槟X血管細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度(下文中稱之為[Ca2+]i)過高和腦細(xì)胞能量消費(fèi)過多所引起(Sauter等人，Neuroc hem 9211-236(1988))。腦血管收縮痙孿導(dǎo)致局部腦組織缺血或停止供血。眾所周知，神經(jīng)細(xì)胞高度依賴血液不斷提供氧氣和葡萄糖以維持生命，當(dāng)血流停止45分鐘以上時(shí)神經(jīng)細(xì)胞就會(huì)損傷和壞死，導(dǎo)致腦中風(fēng)。據(jù)信某些Ca2+拮抗劑(antagonist)對(duì)缺血性腦中風(fēng)有一些療效，但其療效十分有限(參見Nishikib等人Life Sci.431715-1723(1988)；Sauter等人，Neurochem，9211-236(1988)和Fieschi等人，EuropeJ.Pharmacol.81587-594(1982))。較近的研究指出腦血管的結(jié)構(gòu)和全身其它細(xì)管的結(jié)構(gòu)可能有所不同(McCaldlen等人，Am.J.Physiol，241H129-133(1981)；Allen等人，J.Neurosurg.44594-600(1976)；Van Breeman等人Cir.Res.46426-429(1980))，后者的細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i較多依賴細(xì)胞外Ca2+向細(xì)胞內(nèi)的流入，而腦血管細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i較多依賴于細(xì)胞內(nèi)存在的Sarcoplasmic reticulum(SR)的游離，因此一般的Ca2+拮抗劑因基于阻斷細(xì)胞外Ca2+向細(xì)胞內(nèi)的流入而能較為有效地使腦血管以外的血管松馳，降低全身血壓，但對(duì)腦血管的松馳作用不大而對(duì)缺血性中風(fēng)的防治未能發(fā)生良效。而且，就算少數(shù)普通Ca2+拮抗劑能松馳腦血管而有利于缺血性腦中風(fēng)的治療，但由于它們也能降低血壓而減少進(jìn)入腦的血流量，抵消了腦血管松馳后原本可以增加血流的作用(Voldby等人，Acta.Neurochirurgia 70243-254(1984)；Nishikibe等人，LifeSci.431715-1723(1988)。
因此，用于對(duì)缺血性腦中風(fēng)進(jìn)行治療的一般的Ca2+拮抗劑不能有效地降低腦血管細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i，同時(shí)也不能以任何形式為腦細(xì)胞增加能源物質(zhì)，因此不能有效地用于缺血性腦中風(fēng)的防治和康復(fù)。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)一種化合物即式I化合物，能有效地減少腦血管細(xì)胞內(nèi)SR中Ca2+的游離，同時(shí)又能阻斷Ca2+由腦血管細(xì)胞外向腦血管細(xì)胞內(nèi)的流入，因而有效地降低腦血管細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i。令人驚異的是式I化合物還能增加腦細(xì)胞的cAMP，減低高能量環(huán)腺苷酸(cAMP)的消耗，保持和恢復(fù)神經(jīng)細(xì)胞生命力，使腦壞死部分復(fù)元。本發(fā)明式I化合物能有效地用于缺血性腦中風(fēng)的防治。
就本申請(qǐng)人所知，在先有技術(shù)中，曾發(fā)現(xiàn)某些式I化合物對(duì)心律不齊有很好的整心作用(Chiou等人，J.pharmacol.Exp.Ther，198444(1976)；Posner等人，Pharmacol 1497-103(1976)；Chiou等人，Europe J.Pharmacol 81587-594(1982))，但尚未見有關(guān)式I化合物用于防治缺血性腦中風(fēng)的報(bào)道。
本發(fā)明的第一目的是提供一種防治缺血性腦中風(fēng)的方法，包括給需要所述治療的患者施用式I化合物或其可藥用的酸加成鹽， 其中R1、R2、R3可相同或不同，并且各自獨(dú)立地代表氫和C1-4烷氧基，R4和R5可相同或不同，并且各自獨(dú)立地代表氫和C1-6烷基，n代表1～12的整數(shù)。
本發(fā)明的另一目的涉及一種用于防治缺血性腦中風(fēng)的藥物組合物，其中含有如上定義的式I化合物和/或其可藥用的酸加成鹽以及一種或多種藥學(xué)上可接受的藥物載體和輔助劑。
本發(fā)明的再一目的是所述藥物組合物的制備方法，該方法包括將如上定義的式I化合物和/或其可藥用的酸加成鹽與一種或多種藥學(xué)上可接受的藥物載體和輔助劑混合。
本發(fā)明的再一目的涉及如上定義的式I化合物或其可藥用的酸加成鹽在制備用于防治缺血性腦中風(fēng)的藥物中的應(yīng)用。
在本發(fā)明中，優(yōu)選的式I化合物是其中R1、R2、R3各自獨(dú)立地代表氫和C1-2烷氧基，R4和R5各自獨(dú)立地代表氫和C1-4烷基并且n代表1～12的整數(shù)的式I化合物或其可藥用的酸加成鹽。
在本發(fā)明中，更優(yōu)選的式I化合物是其中R1、R2、R3各自獨(dú)立地代表氫和甲氧基，R4、R5各自獨(dú)立地為甲基或乙基并且n代表1～12的整數(shù)的式I化合物或其可藥用的酸加鹽。
在本發(fā)明中，最優(yōu)選的式I化合物是下列化合物或其可藥用的酸加成鹽3，4，5-三甲氧基苯甲酸(N，N-二乙氨基)甲基酯，3，4，5-三甲氧基苯甲酸2-(N，N-二乙氨基)乙基酯3，4，5-三甲氧基苯甲酸3-(N，N-二乙氨基)丙基酯3，4，5-三甲氧基苯甲酸4-(N，N-二乙氨基)丁基酯3，4，5-三甲氧基苯甲酸5-(N，N-二乙氨基)戊基酯3，4，5-三甲氧基苯甲酸6-(N，N-二乙氨基)己基酯3，4，5-三甲氧基苯甲酸7-(N，N-二乙氨基)庚基酯3，4，5-三甲氧基苯甲酸8-(N，N-二乙氨基)辛基酯3，4，5-三甲氧基苯甲酸9-(N，N-二乙氨基)壬基酯，和/或3，4，5-三甲氧基苯甲酸10-(N，N-二乙氨基)癸基酯。
本發(fā)明式I化合物是已知化合物，可以按有機(jī)化學(xué)領(lǐng)域中常規(guī)的合成方法制備，例如按Sastry等人J.Org.Chem.231577(1958)中所述方法或其類似方法制備。該文獻(xiàn)的內(nèi)容并入本文作為參考。
本發(fā)明式I化合物由于其具有取代的氨基而呈堿性，它可以與任何可藥用的酸形成可藥用的酸加成鹽，本發(fā)明范圍包括式I化合物及其或藥用的酸加成鹽。
本發(fā)明術(shù)語“C1-6烷基”是指具有1-6個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基，包括C1-4烷基以及1-甲基丁基、2-甲基丁基、2-乙基丁基、正戊基、1-甲基戊基、2-甲基戊基等。
本發(fā)明術(shù)語“C1-4烷基”是指具有1～4個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基，例如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基和叔丁基等。
本發(fā)明術(shù)語“C1-4烷氧基”是具有1～4個(gè)碳原子的直鏈或支鏈的烷氧基，例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、異丁氧基和叔丁氧基等。
本發(fā)明術(shù)語“C1-2烷氧基”是指具有1～2個(gè)碳原子的烷氧基，例如甲氧基和乙氧基。
式I中“-(CH2)n-”是指具有1～12個(gè)(優(yōu)選1～10個(gè))碳原子的任意被C1-2烷基取代的直鏈或支鏈的亞烷基，例如是亞甲基、亞乙基、亞丙基、亞丁基、亞戊基、亞己基、亞辛基、亞壬基、亞癸基、亞十一烷基、亞十二烷基，以及所述基團(tuán)在不同碳位上被C1-2烷基取代的基團(tuán)，如2-甲基-亞戊基，3-乙基-亞己基等等。
在本發(fā)明中，“TMB”是指本發(fā)明中R1、R2和R3均為甲氧基并且R4和R5均為乙基的式I化合物，根據(jù)n數(shù)值的不同，而稱之為TMB-n，例如TMB-2是指3，4，5-三甲氧基苯甲酸2-(N，N-二乙氨基)乙酯，TMB-5是指3，4，5-三甲氧基苯甲酸5-(N，N-二乙氨基)戊酯，TMB-8是指3，4，5-三甲氧基8-(N，N-二乙氨基)辛酯；及其可藥用的酸加成鹽。
本發(fā)明術(shù)語“可藥用的酸加成鹽”是指本發(fā)明化合物與“可藥用的酸”形成的適于藥學(xué)應(yīng)用的鹽，所述鹽也包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。用于生成所述鹽的“可藥用的酸”包括無機(jī)酸和有機(jī)酸。典型的無機(jī)酸包括鹽酸、氫溴酸氫碘酸、硝酸、硫酸、磷酸、連二磷酸等。也可以應(yīng)用由有機(jī)酸生成的鹽，有機(jī)酸例如是脂肪族一或二羧酸、苯基取代的鏈烷酸、羥基鏈烷酸和羥基鏈烷二酸，以及芳香族酸、脂肪族和芳香族磺酸等等。所述可藥用的鹽包括乙酸鹽、苯基乙酸鹽、三氟乙酸鹽、丙烯酸鹽、抗壞血酸鹽、苯甲酸鹽、氯代苯甲酸鹽、二硝基苯甲酸鹽、羥基苯甲酸鹽、甲氧基苯甲酸鹽、甲基苯甲酸鹽、鄰乙酰氧基苯甲酸鹽、 -2-苯甲酸鹽、溴化物、異丁酸鹽、苯基丁酸鹽、β-羥基丁酸鹽、丁炔-1，4-二酸鹽、乙炔-1，4-二酸鹽、癸酸鹽、辛酸鹽、氯化物、肉桂酸鹽、檸檬酸鹽、甲酸鹽、富馬酸鹽、羥基乙酸鹽、庚酸鹽、馬尿酸鹽、乳酸鹽、蘋果酸鹽、馬來酸鹽、羥基馬來酸鹽、丙二酸鹽、扁桃酸鹽、甲磺酸鹽、煙酸鹽、異煙酸鹽、硝酸鹽、草酸鹽、鄰苯二甲酸鹽、對(duì)苯二甲酸鹽、磷酸鹽、磷酸一氫鹽、磷酸二氫鹽、偏磷酸鹽、焦磷酸鹽、丙炔酸鹽、丙酸鹽、苯基丙酸鹽、水楊酸鹽、癸二酸鹽、琥珀酸鹽、辛二酸鹽、硫酸鹽、硫酸氫鹽、焦硫酸鹽、亞硫酸鹽、亞硫酸氫鹽、磺酸鹽、苯磺酸鹽、對(duì)溴苯磺酸鹽、氯代苯磺酸鹽、乙磺酸鹽、2-羥基乙磺酸鹽、甲磺酸鹽、 -1-磺酸鹽、 -2-磺酸鹽、對(duì)甲苯磺酸鹽、二甲苯磺酸鹽、酒石酸鹽等。優(yōu)選的鹽是鹽酸鹽。
可藥用的酸加成鹽一般可通過式I化合物與等摩爾或過量的酸反應(yīng)制得。反應(yīng)物通常于常規(guī)有機(jī)溶劑如苯、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮或乙醚中或者在水中進(jìn)行反應(yīng)。鹽一般在約1小時(shí)～10天內(nèi)從溶液中析出，并且可以經(jīng)過濾分離，或者按常規(guī)方法除去溶劑。
如上述討論的那樣，式I的化合物和/或其可藥用的酸加成鹽可用于防治哺乳動(dòng)物的缺血性腦中風(fēng)。此方法包括給需此治療的哺乳動(dòng)物(優(yōu)選人)施用足量的一種或多種式I化合物，以獲得所需治療或預(yù)防作用。該化合物可通過多種途徑施用，包括口服、直腸、經(jīng)皮、皮下、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)或鼻腔內(nèi)等途徑。口服途徑是優(yōu)選的。無論選擇什么途徑施用，該給藥方式最好是借助藥物組合物完成，這些藥物組合物是運(yùn)用藥物科學(xué)領(lǐng)域熟知的技術(shù)制備的。
在制備這些組合物中，常將一種或多種活性成分與載體混合，或用載體稀釋，或包封在諸如膠囊、香囊、紙狀或其它容器中。當(dāng)載體用作稀釋劑時(shí)，它可以是固體、半固體或液體物質(zhì)，它作為該活性成分的載體，賦形劑或介質(zhì)。因此，該組合物可以是片劑、丸劑、粉劑、錠劑、香囊劑、扁囊劑、酏劑、懸浮液劑、乳劑、溶液劑、糖漿劑、氣霧劑、軟膏劑、軟和硬明膠膠囊劑、栓劑、無菌注射液及無菌包裝的粉針劑。其中口服劑型是最優(yōu)選的。
適宜的載體、賦形劑和稀釋劑是無毒的藥學(xué)上適用的載體、賦形劑和稀釋劑，其實(shí)例包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯膠、磷酸鈣、海藻酸鹽、黃耆膠、明膠、硅酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、水、鹽水溶液、糖漿、甲基纖維素、羥甲基纖維素、羧甲基纖維素、羥基苯甲酸甲酯或丙酯類、滑石粉、硬脂酸鎂和礦物油等等。該制劑另外可包括潤滑劑、潤濕劑、乳化劑和懸浮劑、防腐劑、甜味劑或芳香劑，這些添加劑對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員都是熟知的。通過使用本領(lǐng)域熟悉的方法可配制該組合物，以使該組合物施用后給患者提供速釋、緩釋或延遲釋放的該活性成分。緩釋制劑可以這樣構(gòu)成，即使得它們最好在腸道的特定部位或者其它特定的給藥部位，在一定時(shí)間內(nèi)連續(xù)釋放活性成分，并在一定時(shí)間內(nèi)維持有效的血藥濃度，例如可將本發(fā)明的活性成分制成包衣小丸的膠囊劑或制成包衣顆粒，或?qū)⒒钚猿煞职卦谌芪g性骨架材料或親水性膠體物質(zhì)中，或者利用離子交換樹脂或多孔性載體及海綿通道型載體材料配制制劑，這些制劑技術(shù)都是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的，可參見任何有關(guān)藥劑學(xué)教科書和手冊(cè)。
優(yōu)選以單位劑量形式配制該組合物，這樣每劑含有約1～1000mg、更經(jīng)常是約25～500mg的活性成分。術(shù)語“單位劑量形式”指適宜用于人或其它哺乳動(dòng)物單次劑量使用的物理獨(dú)立單元，每單位含有依計(jì)算產(chǎn)生所需防治效果的預(yù)定量的活性成分，以及一種或多種適宜的稀釋劑、賦形劑或載體。
口服制劑是本發(fā)明組合物的優(yōu)選劑型。所用載體或賦形劑是如上文所述的任何藥學(xué)上無毒的適宜物質(zhì)?？诜苿┌ㄈ芤簞?、懸浮液劑、丸劑、粒劑、粉劑、膠囊劑和片劑等，其中包括緩釋劑型等。這些制劑可含有1～95％、優(yōu)選1～10％(重量)的活性藥物成分。非胃腸道給藥劑型也是本發(fā)明優(yōu)選的劑型，包括注射給藥例如皮下注射、肌內(nèi)注射或靜注等所用制劑，例如是溶液劑、乳劑或懸浮液劑，或者是粉針劑，其在注射前即時(shí)配制成便于注射用的溶液劑、乳劑或懸浮液劑，其適當(dāng)?shù)娜軇┗蜉d體包括無菌水、生理鹽水、葡萄糖、甘油、酒精等，如果需要也可加入其它藥學(xué)上適用的添加劑如表面活性劑、乳化劑、緩沖劑(如乙酸鈉、三乙醇胺等)。所述口服制劑，包括片劑、膠囊劑、粒劑、丸劑、粉劑等在內(nèi)，均可以制成緩釋制劑，例如按Ariens等人，Drug Design，VolIV p37-73，Academic Press，New York and London，1973中所述方法制成多聚物樹脂珠粒、多孔性載體型或海綿通道型制劑等等，上述文獻(xiàn)內(nèi)容并入本文作為參考。本藥也可用植入法給藥，使藥品在緩慢恒定的速度下釋放活性成分，有關(guān)植入法給藥及其劑型可參見Ueno等人專著Controlled Drug Delivery Vol.II，chap 4，CRC Pressed，1983，該文獻(xiàn)有關(guān)內(nèi)容并入本文作為參考。上述制劑包括口服制劑和非胃腸道給藥的制劑的制法對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是熟知的，可參見Remington′s PharceuticalSciences，Mack Pull.Co.Easton PA，15th版，1975。
為防治缺血性腦中風(fēng)所應(yīng)用的本發(fā)明式I化合物的具體劑量將取決于由主治醫(yī)師決定的疾病的嚴(yán)重程度、給藥途徑以及有關(guān)因素，對(duì)于口服給藥的本藥劑量大致為1～50mg/kg體重，預(yù)防給藥時(shí)可在中風(fēng)前分成一天3次給藥即每6小時(shí)給藥一次；中風(fēng)發(fā)作后應(yīng)多次給藥，例如每4～8小時(shí)給藥一次，維持3～10天，通常是每6小時(shí)給藥一次共給5～7天左右。非胃腸道途徑給藥例如注射給藥劑量為0.1～20mg/kg體重，給藥次數(shù)和時(shí)間與口服給藥相似。至于植入法緩釋給藥，可將本藥調(diào)制成釋放劑量為0.1～20mg/kg/天，可在中風(fēng)前植入，也可在中風(fēng)后植入以防止眼盲的發(fā)生，新的植入物可在每3～10天植入一次而維持到60天左右，最常用劑量是每5～7天植入一次并維持30天左右。
本發(fā)明式I化合物的效用及其藥理學(xué)特性可通過下述附圖和藥理實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步說明和證實(shí)。


圖1表示的是本發(fā)明化合物對(duì)缺血性大腦壞死的效果，大腦經(jīng)TTC染色。圖A是對(duì)照組大腦；圖B是經(jīng)TMB-2治療的大腦；圖C是經(jīng)TMB-5治療的大腦；圖D是經(jīng)TMB-8治療的大腦。
圖2是指由50mM KCl刺激后細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增加的時(shí)間過程。180秒處的箭頭是指加入50mM KCl。每一數(shù)值點(diǎn)代表均值±SEM(n＝6)。
圖3表示TMB-2對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣離濃度的影響。200秒處的箭頭是指加入0.1mg/ml TMB-2，而400秒處的箭頭是指加入50mM KCl。圖示結(jié)果表明TMB-2抑制高濃度KCl所增加的鈣離子向細(xì)胞內(nèi)的流入。每一數(shù)值點(diǎn)代表均值±SEM(n＝6)。
圖4表示TMB-5對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣子濃度的影響。200秒處的箭頭是指加入0.1mg/ml TMB-5，而400秒處的箭頭是指加入50mM KCl。圖示結(jié)果表明TMB-5抑制由于注入高濃度KCl導(dǎo)致的鈣離子經(jīng)L-型鈣離子通道的進(jìn)入。每一數(shù)值點(diǎn)代表均值±SEM(n＝6)。
圖5表示TMB-8對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響。200秒處的箭頭是指加入0.1mg/ml TMB-8，而400秒處的箭頭是指加入50mM KCl。圖示結(jié)果表明TMB-8不僅阻斷由于高濃度KCl所增加的鈣離子的流入，而且還降低細(xì)胞內(nèi)游離的鈣離子濃度。每一數(shù)值點(diǎn)代表均值±SEM(n＝6)。
藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)及其方法實(shí)驗(yàn)所用TMB化合物按Sastry等人，J.Org.Chem.231577(1985)所述方法合成制得，這些TMB皆可溶于水，在使用時(shí)臨時(shí)配制成水溶液。TTC(氯化2，3，5-三苯基四唑翁)、Dowex 50w、三氯醋酸、cAMP(環(huán)腺苷酸)、牛血清蛋白和Fura-2-AM皆購自Sigma化學(xué)化司(ST.Louis，Mo)。[3H]-cAMP(28.9Ci/mmol)購自NEW(Du Pont，Boston，MA).
大鼠缺血性腦中風(fēng)模型按Chen等人，Stroke 17738～743(1986)所述類似方法產(chǎn)生并測定大腦皮層的梗死形成將體重250～350g的Long Evans大鼠用100g/kg鹽酸氯胺酮(Parke-Davis)肌注麻醉，將兩側(cè)頸總動(dòng)脈分離后，將右頸總動(dòng)脈永遠(yuǎn)結(jié)扎，然后把顳骨打開以暴露出顴骨和Squamosal骨，用微手術(shù)法用牙科鉆在顴骨和Squamosal骨的前邊連接處后方1mm處打開一個(gè)2mm的洞。之后用第11號(hào)的手術(shù)刀將腦膜細(xì)心地穿刺以免刺到大腦。然后用0.10mm×0.06mm的夾子把腦中間動(dòng)脈(MCA)暴露出來，并加熱封死，之后使傷口止血，并用浸有50IU/ml青霉素的生理鹽水的棉花蓋住。之后把左頸總動(dòng)脈(CCA)暫時(shí)壓扎停止血流60分鐘。將TMB-2、TMB-5和TMB-8溶解在PBS中，于結(jié)扎止血前1小時(shí)和結(jié)扎止血后0、1、6小時(shí)以2mg/kg的劑量進(jìn)行腹膜內(nèi)注射。手術(shù)后3天，將動(dòng)物斷頭活殺，并迅速取出全腦，并將全腦放入新配制的2％TTC生理鹽水中，在37℃維持2小時(shí)進(jìn)行染色。之后，將該已染色的全腦放入10％福爾馬林溶液中，缺血壞死的大腦表面面積變成白色。進(jìn)行6倍放大照相用以測量其面積。實(shí)驗(yàn)結(jié)果參見表1。
表1 經(jīng)TTC染色后大腦壞死面積的定量<
>>*與對(duì)照組比較，p＜0.01。
在左頸總動(dòng)脈(CCA)閉塞60分鐘后，經(jīng)腹膜內(nèi)注射給藥TMB-2、TMB-5和TMB-8(2mg/kg)。所有數(shù)值均以均值±SEM(n＝6)表示。
當(dāng)MCA被閉塞60分鐘后，大致有一半的腦會(huì)部分壞死(216mm2)(表1，圖1A)。當(dāng)2mg/kg之TMB-2，TMB-5和TMB-8在MCA被閉塞前一小時(shí)給藥時(shí)，大腦壞死面積幾乎完全消失到對(duì)照腦的5％、1％和8％左右(表1及圖1B、1C、1D)。將TMB-2、TMB-5和TMB-8在MCA閉塞的0小時(shí)和1小時(shí)后給藥時(shí)所得的結(jié)果和MCA閉塞前1小時(shí)給藥結(jié)果相似(表1)，不過在MCA閉塞后6小時(shí)才給TMB-2、TMB-5和TMB-8時(shí)大腦壞死的面積就不被完全地打消而分別有17％、22％和9％壞死的面積出現(xiàn)(表1)，由此可知本發(fā)明化合物預(yù)防給藥可有效地防止缺血性腦中風(fēng)的發(fā)生，在中風(fēng)后盡早給藥可有效地治療并有利于康復(fù)。給藥時(shí)間拖長后(＞6小時(shí))其藥效就大為減弱。
細(xì)胞培養(yǎng)從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(Rockville，MD)購得大鼠胚胎大動(dòng)脈衍生的穩(wěn)定細(xì)胞系A(chǔ)7r5。將這些細(xì)胞在補(bǔ)充有10％胎牛血清、3.8mML-谷氨酰胺、50IU/ml青霉素和50mg/ml鏈霉素的Dulbecco′s改性的Eagle′s培養(yǎng)基(GLBCO，Grand Island，NY)中培養(yǎng)。將培養(yǎng)物保持在溫度為37℃、濕度為100％的內(nèi)含5％CO2～95％空氣的保溫箱中培養(yǎng)，并在2～3天更換一次培養(yǎng)基。細(xì)胞在6孔培養(yǎng)板(Costar牌)上進(jìn)行傳代培養(yǎng)以用于cAMP測定，或者在9×22mm玻璃蓋片上培養(yǎng)以用于測定細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度。
細(xì)胞內(nèi)cAMP的測定用三氯醋酸將cAMP由其它核酸物中分離并用Dowex 50w樹脂(200-400目)精制(Fong等人，Biochem.Biophys.Res.Comm.1811385-1391(1991)后，采用cAMP蛋白結(jié)合測定法測定細(xì)胞內(nèi)cAMP(Brown等人，Adv.Cyclic Nucleotide Res.225-40(1972))。簡述之，在按上述方法得到的單層A7r5細(xì)胞培養(yǎng)物中加入0.1mg/ml的TMB-2、TMB-5、TMB-8或?qū)φ找?，保?小時(shí)。隨后用含有128mM NaCl、4.7mM KCl、1.25mM CaCl2、1.25mM MgSO4和10mM磷酸鈉的KRP緩沖液(pH7.4)洗滌3次，再將細(xì)胞在1ml 10％三氯醋酸中均漿并于12000g離心5分鐘。將上清液倒入Dowex 50w樹脂上分離三氯醋酸及其它核酸物質(zhì)。向液體樣品中加入500cpm的[3H]-cAMP作為內(nèi)標(biāo)，之后用Brown等人(1972)所述蛋白結(jié)合法測定cAMP濃度。按Lowry等人，J.Boil.Chem.193265-275(1951)所述方法測定蛋白本身。實(shí)驗(yàn)結(jié)果參見表2。
表2 本發(fā)明化合物對(duì)A7r5細(xì)胞內(nèi)cAMP的顯著效果
與相應(yīng)的對(duì)照組比較，P＜0.01。
將細(xì)胞在含有TMB的培養(yǎng)基中培養(yǎng)1小時(shí)后，測定cAMP。所有數(shù)據(jù)均以均值±SEM(n＝6)表示。
令人驚異的是本發(fā)明化合物能使A7r5細(xì)胞內(nèi)cAMP顯著提高(表2)。因此本發(fā)明化合物在腦細(xì)胞短暫性缺血時(shí)能增強(qiáng)其能源供應(yīng)，有利于腦中風(fēng)的預(yù)防和康復(fù)。
細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的測定按Yates等人，J.Neurosci.Res.32255-260(1992)所述類似方法測定細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度。將長滿A7r5單層細(xì)胞的9×22mm玻璃蓋片用含有128mM NaCl、4.7mM KCl、1.25mMMgSO4和10mM磷酸鈉的對(duì)照緩沖液(pH7.4)洗滌兩次后將其放入含有5μM Fura-2-AM和0.25％牛血清蛋白的同一緩沖液中于37℃培養(yǎng)60分鐘，當(dāng)細(xì)胞充足了Fura-2-AM后，將玻璃蓋片用對(duì)照緩沖液洗滌并放入到含有3ml對(duì)照緩沖液的Cuvette內(nèi)，用螢光光譜儀(Hitach F-4010；Hitachi Koki Co.，Japan)測定鈣值，測定時(shí)把玻璃蓋片放成與激發(fā)光光路交疊成30°角。在340nm或380nm光波下激發(fā)細(xì)胞，并在發(fā)射螢光波長510nm處分析鈣量。在對(duì)照緩沖液平衡180秒后加入1mMCaCl2，再在180秒后用340nm和380nm光波激發(fā)之。在此情形下，自動(dòng)螢光會(huì)被20mM Mn2+所吸收，因而可以測定其中細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度并以在340nm和380nm下測得的螢光比值表示(在附圖中表示為比值(340/380))。
50mM的KCl能明顯增加細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i(圖2)，這個(gè)現(xiàn)象可被TMB-2和TMB-5部分抵消(圖3和圖4)，TMB-8作用最強(qiáng)大，它不但能降低細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i，還能完全抵消由KCl所引起的細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i的增加作用(圖5)。這些結(jié)果明白地表明本發(fā)明化合物是Ca2+拮抗劑，能有效地降低腦血管細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i，導(dǎo)致腦血管松馳，增加血流，減少腦動(dòng)脈壞死。
下面是本發(fā)明制劑的說明性的一些具體實(shí)施例，應(yīng)當(dāng)明白，本發(fā)明制劑絕不僅限于此，并且它不以任何方式限制本發(fā)明的范圍，如上文所述，通過閱讀本申請(qǐng)，參照或模仿本發(fā)明方法，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能作出各種變化，將本發(fā)明化合物制成適于各種給藥方式的各種制劑，所有這些制劑均包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。制劑中活性成分是指本發(fā)明式I化合物或其可藥用的酸加成鹽，例如TMB-8或TMB-5。
實(shí)施例1 片劑成分 量(mg/片)活性成分 120mg微晶纖維素120mg二氧化硅 50mg硬脂酸鎂 15mg將上述成分混合并壓制成片劑。
實(shí)施例2 片劑成分 量(mg/片)活性成分 120mg淀粉 45mg微晶纖維素35mg聚乙烯吡咯烷酮(10％水溶液)4mg羧甲基纖維素鈉4.5mg硬脂酸鎂 0.5mg滑石 1mg將活性成分、淀粉和纖維素通過45目網(wǎng)篩，并充分地混合，使聚乙烯吡咯烷酮溶液與得到的粉末混合，過篩并于50～60℃干燥并再過18目篩。將預(yù)先通過60目網(wǎng)篩的羧甲基纖維素鈉、硬脂酸鎂和滑石加到顆粒中，混合以后壓制成片。
實(shí)施例3膠囊劑成分 量(mg/粒)活性成分 120mg羥丙基甲基纖維素 150mg硬脂酸鎂 9mg將上述成分混合制粒，通過45目網(wǎng)篩，并將其裝入硬明膠膠囊中。
實(shí)施例4 錠劑、膠囊劑成分量(mg/粒)活性成分120mg乳糖180mg將上述成分混合制粒，通過45目網(wǎng)篩，然后裝入膠囊中，或者制成錠劑。
實(shí)施例5 粉針劑成分量(mg/安瓿)活性成分120mg注射用水6ml將活性成分和注射用水分裝在兩個(gè)獨(dú)立的安瓿瓶中，在給藥前混合溶解，用于注射。
實(shí)施例6 懸浮液劑成分量(mg/3ml)活性成分120mg羧甲基纖維素3mg糖漿適量調(diào)味劑、著色劑 適量注射用水 加至 3ml將活性成分與羧甲基纖維素和糖漿混合，調(diào)成糊狀。用一些水將適量調(diào)味劑、著色劑稀釋，然后攪拌下加入足量水至3ml。
權(quán)利要求
1.式I化合物或其可藥用的酸加成鹽在制備用于防治缺血性腦中風(fēng)的藥物中的應(yīng)用， 其中R1、R2、R3可相同或不同，并且各自獨(dú)立地代表氫和C1-4烷氧基，R4和R5可相同或不同，并且各自獨(dú)立地代表氫和C1-6烷基，n代表1～12的整數(shù)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中R1、R2、R3可相同或不同，并且各自獨(dú)立地代表氫和C1-2烷氧基，R4和R5可相同或不同，并且各自獨(dú)立地代表氫和C1-4烷基，n代表1～12的整數(shù)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中R1、R2、R3各自獨(dú)立地代表氫和甲氧基，R4和R5各自獨(dú)立地為甲基或乙基，n代表1～12的整數(shù)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中式I化合物是下列化合物或其可藥物的酸加成鹽3，4，5-三甲氧基苯甲酸(N，N-二乙氨基)甲基酯；3，4，5-三甲氧基苯甲酸2-(N，N-二乙氨基)乙基酯；3，4，5-三甲氧基苯甲酸3-(N，N-二乙氨基)丙基酯；3，4，5-三甲氧基苯甲酸4-(N，N-二乙氨基)丁基酯；3，4，5-三甲氧基苯甲酸5-(N，N-二乙氨基)戊基酯；3，4，5-三甲氧基苯甲酸6-(N，N-二乙氨基)己基酯；3，4，5-三甲氧基苯甲酸7-(N，N-二乙氨基)庚基酯；3，4，5-三甲氧基苯甲酸8-(N，N-二乙氨基)辛基酯；3，4，5-三甲氧基苯甲酸9-(N，N-二乙氨基)壬基酯；和/或3，4，5-三甲氧基苯甲酸10-(N，N-二乙氨基)癸基酯。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中所述可藥用的酸加成鹽是鹽酸鹽。
6.一種用于防治缺血性腦中風(fēng)的藥物組合物，其中含有權(quán)利要求1中的式I化合物和/或其可藥用的酸加成鹽以及一種或多種藥學(xué)上可接受的藥物載體和輔助劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的藥物組合物，它是一種口服制劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求6的藥物組合物，其中所述口服劑是緩釋制劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求6的藥物組合物，它是一種非胃腸給藥的制劑。
10.權(quán)利要求6的藥物組合物的制備方法，該方法包括將權(quán)利要求1中的式I化合物和/或其可藥用的酸加成鹽與一種或多種藥學(xué)上可接受的藥物載體和輔助劑混合。
全文摘要
本發(fā)明發(fā)現(xiàn)下列式I化合物可用于防治缺血性腦中風(fēng)，本發(fā)明涉及用式I化合物制備防治缺血性腦中風(fēng)的藥物，本發(fā)明還涉及含有式I化合物的藥物組合物及其制備方法，其中R
文檔編號(hào)A61K31/245GK1132071SQ9511691
公開日1996年10月2日 申請(qǐng)日期1995年8月30日 優(yōu)先權(quán)日1995年8月30日
發(fā)明者邱春億 申請(qǐng)人:永光制藥有限公司