本發(fā)明屬于病毒分子檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種鯽魚冠狀病毒hb93的rt-lamp檢測引物及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
國際病毒分類委員會(internationalcommitteeontaxonomyofviruses,ictv)于2012年發(fā)表了最新的病毒分類第九次報告，將套式病毒目(nidovirales)中的冠狀病毒科(coronaviridea)中新設(shè)冠狀病毒亞科(coronavirinea)和環(huán)曲病毒亞科(torovirinae)。
冠狀病毒科是一類線形單股正鏈rna病毒，最早于1937年從雞身上分離出來，almeida等對這些病毒進行了形態(tài)學(xué)研究，電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)這些病毒的包膜上有形似日冕的棘突，故提出命名這類病毒為冠狀病毒[1]。1975年，國際病毒命名和分類委員會正式命名了冠狀病毒科。2002-2003年期間，自我國局部地區(qū)發(fā)生的非典型肺炎，即由冠狀病毒屬的嚴(yán)重急性呼吸綜合征病毒(sars-cov)引起，世界上有30多個國家和地區(qū)相繼報道出現(xiàn)病例，病死率超過10％。2012年，中東地區(qū)開始出現(xiàn)新型冠狀病毒，病死率超過50％，引起了世界范圍的廣泛關(guān)注，造成社會對冠狀病毒的恐慌。因此，對冠狀病毒進行深入研究具有重要意義。
目前對冠狀病毒科的研究主要集中在冠狀病毒亞科，而對環(huán)曲病毒亞科研究甚少。其中，2006年鳊魚病毒屬(bafinivirus)的中的鳊魚病毒(whitebreamvirus)由schützeh等科學(xué)家在鳊魚體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，這也是目前ictv分類中確定的唯一以水生動物為宿主的冠狀病毒。
目前鯽魚冠狀病毒(cruciancarpbafinivirus,ccbv)尚無公開報道，更也無有效的檢測方法。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種鯽魚冠狀病毒hb93的rt-lamp檢測引物，所述的引物如下：
f3：5’-actcgaaggaaacatccat-3’；
b3：5’-ctgggtgtgtggttgatg-3’；
fip：5’-gtcgtgtttcttccattccatagaatcatcttcgacctcagtca-3’；
bip：5’-ggctgggacaacaccaaaacactgagagttgatgtcatagc-3’。
本發(fā)明的目的在于提供了一種鯽魚冠狀病毒hb93的rt-lamp檢測引物的應(yīng)用，所述的引物可用于制備檢測鯽魚冠狀病毒的檢測試劑盒。
為了達到上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)措施：
一種鯽魚冠狀病毒hb93的rt-lamp檢測引物，所述的引物如下：
f3：5’-actcgaaggaaacatccat-3’；
b3：5’-ctgggtgtgtggttgatg-3’；
fip：5’-gtcgtgtttcttccattccatagaatcatcttcgacctcagtca-3’；
bip：5’-ggctgggacaacaccaaaacactgagagttgatgtcatagc-3’。
一種鯽魚冠狀病毒hb93的rt-lamp檢測引物的應(yīng)用，包括利用上述引物制備檢測鯽魚冠狀病毒的檢測試劑盒。
優(yōu)選的，當(dāng)制備成試劑盒時，該試劑盒的非診斷性檢測方法包括：
一種鯽魚冠狀病毒hb93的rt-lamp檢測方法，步驟包括：
1)提取待測樣品的rna；
2)rt-lamp擴增:
采用25μl反應(yīng)體系：內(nèi)引物fip和bip各0.8μm，外引物f3和b3各0.1μm，dntps1mm，betaine0.5m，dtt4mm，mgcl22-10mm，bstdna聚合酶8u，amv逆轉(zhuǎn)錄酶5u，模板rna5μl，10×thermopolreactionbuffer2.5μl，選擇55-65℃和30-120分鐘進行rt-lamp反應(yīng)之后，80℃滅活2分鐘；
3)、檢測結(jié)果判定，采用下述三種方式之一：
a、發(fā)生擴增反應(yīng)時，從dntps析出的焦磷酸根離子和反應(yīng)液中的鎂離子形成白色焦磷酸鎂沉淀，通過肉眼判斷：檢測管出現(xiàn)明顯渾濁為陽性，未見渾濁為陰性；
b、每25μl體系的反應(yīng)管加1000×sybrgreeni1-2μl，1-5min觀察結(jié)果，反應(yīng)液變綠為陽性，保持橙色為陰性；
c、取擴增產(chǎn)物，用2％w/v的瓊脂糖凝膠電泳后，置于凝膠成像系統(tǒng)中成像，電泳圖片顯示lamp特征性梯狀條帶，則結(jié)果為陽性；如無任何條帶，則結(jié)果為陰性。
以上所述的方法中，優(yōu)選的，mgcl2的濃度為7mm，反應(yīng)溫度為64℃，模板rna在95℃5分鐘后置于冰浴中進行預(yù)處理。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點：
1、本發(fā)明公開了一種鯽魚冠狀病毒rt-lamp檢測試劑盒；
2、特異性好，能有效檢測出ccbv病毒；
3、靈敏性好，最低檢測限可達11.48pg/μl的rna；
4、快速高效，檢測時間約1小時，非常適用于ccbv的現(xiàn)場快速檢測；
5、不需要特殊試劑與設(shè)備，檢測成本低；
6、鑒定簡單，通過從dntps析出的焦磷酸根離子和反應(yīng)液中的鎂離子形成白色焦磷酸鎂沉淀，經(jīng)肉眼就可判斷結(jié)果，通過加入1000×sybrgreeni，可提高結(jié)果的靈敏度。
具體實施方式
本發(fā)明所述技術(shù)方案，如未特別說明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方案，所用試劑或原料，如未特別說明，均購自商業(yè)渠道或是已公開。
實施例1：
一種鯽魚冠狀病毒hb93(本發(fā)明或稱為ccbv-hb93)，其分離過程如下：
1)將攜帶病毒的鯽魚肝、腦、脾、腎等組織取出并碾磨后，培養(yǎng)基稀釋100倍，2000rpm離心后取上清過濾，接種到草魚性腺細(xì)胞(grasscarpovarycellline,gco)單層，25℃培養(yǎng)7天，產(chǎn)生細(xì)胞病變效應(yīng)(cpe)，可見gco細(xì)胞收縮變圓、折光度增加，部分細(xì)胞開始脫落，細(xì)胞單層開始破裂。
培養(yǎng)基：m199，10％胎牛血清，ph7.0～7.2
2)收集病變細(xì)胞，利用透射電鏡進行形態(tài)學(xué)鑒定。
3)收集病毒，對其進行全基因組測序，序列為seqidno.1所示。
鯽魚冠狀病毒hb93的形態(tài)特征：病毒呈棒狀，四周有明顯的日冕狀棘突結(jié)構(gòu)，與典型的冠狀病毒形態(tài)相符，該病毒已于2017年5月11日送至中國典型培養(yǎng)物保藏中心進行保藏，分類命名：鯽魚冠狀病毒(cruciancarpbafinivirus)hb93，保藏編號：cctccno：v201722，地址：中國武漢武漢大學(xué)。
實施例2：
一種鯽魚冠狀病毒hb93rt-lamp檢測引物，包括：
f3：5’-actcgaaggaaacatccat-3’；
b3：5’-ctgggtgtgtggttgatg-3’；
fip：5’-gtcgtgtttcttccattccatagaatcatcttcgacctcagtca-3’；
bip：5’-ggctgggacaacaccaaaacactgagagttgatgtcatagc-3’。
實施例3：
利用鯽魚冠狀病毒hb93rt-lamp檢測引物檢測鯽魚冠狀病毒hb93的方法，包括：
1)、病毒rna的獲取:
采用
2)、rt-lamp擴增:
采用25μl反應(yīng)體系：內(nèi)引物fip和bip各0.8μm，外引物f3和b3各0.1μm，dntps1mm，betaine0.5m，dtt4mm，mgcl27mm，bstdna聚合酶8u，amv逆轉(zhuǎn)錄酶5u，模板rna5μl，10×thermopolreactionbuffer2.5μl，選擇64℃和60分鐘進行rt-lamp反應(yīng)之后，80℃滅活2分鐘；
3)、檢測結(jié)果判定，采用下述三種方式之一：
a、發(fā)生擴增反應(yīng)時，從dntps析出的焦磷酸根離子和反應(yīng)液中的鎂離子形成白色焦磷酸鎂沉淀，通過肉眼判斷：檢測管出現(xiàn)明顯渾濁為陽性，未見渾濁為陰性；
b、每25μl體系的反應(yīng)管加1000×sybrgreeni1-2μl，1-5min觀察結(jié)果，反應(yīng)液變綠為陽性，保持橙色為陰性；
c、取擴增產(chǎn)物，用2％w/v的瓊脂糖凝膠電泳后，置于凝膠成像系統(tǒng)中成像，電泳圖片顯示lamp特征性梯狀條帶，則結(jié)果為陽性；如無任何條帶，則結(jié)果為陰性。
實施例4：
鯽魚冠狀病毒rt-lamp檢測引物特異性實驗
利用實施例3所述的方法，對表1中的待檢病毒樣品進行檢測，同時設(shè)置陰性對照組(雙蒸水)和陽性對照組(ccbv-hb93)，待檢病毒樣品具體為：鯉春病毒血癥病毒(svcv)，草魚呼腸孤病毒873(gcrv-873)，草魚呼腸孤病毒9014(gcrv-9014)，傳染性造血器官壞死病毒(ihnv)。
表1鯽魚冠狀病毒rt-lamp檢測試劑盒特異性試驗
結(jié)果如表1所示，僅陽性對照組(ccbv-hb93)顯示lamp特征性梯狀條帶，其余組均無特征條帶，說明鯽魚冠狀病毒hb93rt-lamp檢測引物具備很強的特異性。
實施例5：
鯽魚冠狀病毒rt-lamp檢測引物的靈敏度
將濃度為1148ng/μl的ccbv-hb93rna模板10倍梯度稀釋，利用實施例3的方法，檢測利用本發(fā)明提供的rt-lamp引物的檢測限，105倍稀釋還可觀察到特征性梯狀條帶，也就是最低可檢測11.48pg/μl的rna模板。
sequencelisting
<110>湖北出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心
<120>一種鯽魚冠狀病毒hb93的rt-lamp檢測引物及應(yīng)用
<130>一種鯽魚冠狀病毒hb93的rt-lamp檢測引物及應(yīng)用
<160>5
<170>patentinversion3.1
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<213>人工序列
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atctttgaccaactccaccctgaaacacaagctatgcttaaagacgaataccacattaaa9060
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