專利名稱：：一種定量檢測重癥急性呼吸道綜合癥冠狀病毒的蛋白質(zhì)懸浮芯片及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種重癥急性呼吸道綜合癥冠狀病毒(SARS-CoV)的蛋白質(zhì)懸浮芯片及其制備方法和定量4企測方法。
背景技術(shù)：
：重癥急性呼吸道綜合癥冠狀病毒(SARS-CoV)引起本世紀第一種在全球暴發(fā)的烈性傳染病，SARS引起的恐慌至今人們?nèi)杂洃洩q新。SARS-CoV為單股正鏈RNA病毒，屬巢狀病毒目，冠狀病毒科，冠狀病毒屬。根據(jù)血清型，冠狀病毒屬主要分為3個型，包括多種哺乳動物冠狀病毒和鳥感染性支氣管炎病毒。SARS-CoV是引起人類嚴重疾病的第一個冠狀病毒。SARS-CoV主要結(jié)構(gòu)蛋白有S蛋白(刺突糖蛋白)、M蛋白(跨膜蛋白)、E蛋白(包膜蛋白)、N蛋白(核殼體蛋白)。N蛋白是其中最穩(wěn)定的一個結(jié)構(gòu)蛋白，也是感染過程中最豐富的病毒蛋白，證實是理想的診斷抗原。N蛋白是一長度從377-455個氨基酸不等，含有大量絲氨酸的堿性蛋白。SARS-CoV的N蛋白與其它冠狀病毒的N蛋白差異較大。臨床診斷SARS的實驗室檢測方法包括3類，即病毒分離、病毒核酸檢測和免疫學(xué)檢測，其中免疫學(xué)檢測方法以抗體檢測報道較多，抗原檢測的^良道較少。目前，基于微生物學(xué)、化學(xué)、分子生物學(xué)和免疫學(xué)理論發(fā)展起來的病原體快速斥僉驗方法可以分別對環(huán)境樣本中的生物威脅因子進行定性和定量檢測。定性檢測技術(shù)有常規(guī)的分離培養(yǎng)、血清學(xué)方法等，鑒定結(jié)果雖然準確可靠，但存在耗時長的缺陷，并且每次只能確定或排除一種病原微生物，往往延誤緊急突發(fā)公共衛(wèi)生事件的處置?？焖贆z測技術(shù)主要是以病原體遺傳物質(zhì)核酸為基礎(chǔ)的檢測方法如核酸分子雜交、PCR、多重PCR等以及基于病原體核酸或抗原檢測的生物傳感器技術(shù)，如光纖傳感器、電化學(xué)傳感器、上轉(zhuǎn)換磷光生物傳感器、納米傳感器等。其中，利用多重PCR方法進行單一或多種致病菌的試驗屢有報道。微生物定量檢測方法包括細胞培養(yǎng)法法、半lt致死量法、細胞計數(shù)法和阻抗計法等，但存在耗時長的缺陷；微生物定量檢測的新技術(shù)主要是實時定量PCR,近年來在多種病原微生物的定量檢測中得到廣泛應(yīng)用，但缺陷是只能檢測病原菌的核酸，不能4企測蛋白。懸浮芯片(suspensionarray)也稱液相芯片(liquidarray,liquidchip),是20世紀70年代美國Luminex公司研制出的新一代生物芯片技術(shù)，利用帶編碼的微球體作為載體，流式細胞儀作為檢測平臺，對核酸、蛋白質(zhì)等生物分子進行大規(guī)模測定。最早的報道是1977年Horan將該技術(shù)用于免疫學(xué)檢測，至今，該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于免疫分析、核酸研究、酶學(xué)分析、抗體篩選及受體與配體的識別分析等領(lǐng)域。懸浮芯片的基本原理是利用聚苯乙烯(polystyrene)所制作的微球，包覆不同比例的紅光及紅外光發(fā)色劑，而產(chǎn)生100種不同比例顏色，作為IOO種獨特的色彩編號，每顆微球大小約5.5pm,可依不同研究目的如免疫分析、核酸研究、酶分析、受體和配體識別分析等，并根據(jù)不同研究目的而標定特定抗體、核酸才冢針及各種受體探針。標記探針的微球與待測物在96孔板中進行反應(yīng)。反應(yīng)后，利用機器自動將反應(yīng)液吸起并通過一微細管4士測通道，每次僅允許一個微球通過檢測通道。檢測通道中設(shè)有兩道激光，一道為紅色，激發(fā)微球基質(zhì)中的顏色，識別微球分類編碼以確定檢測項目；一道為綠色，激發(fā)報告分子的顏色，記錄信號強弱以檢測待測物的含量。當(dāng)待測樣本與特定微球的探針吸附在一起時，兩道激光所激發(fā)的光都可被檢測到。而若樣本中不含該標的物，則僅有微球中的激發(fā)光可被檢測到。再通過機器與計算機自動統(tǒng)計分析兩道激光所激發(fā)的微球種類與數(shù)量，從而判定待測樣本中有幾種測試目標物在其中，得知測試樣本中有無待測病原存在，或同時存在有幾種至數(shù)十種病原。懸浮芯片技術(shù)由于利用微球在溶液中反應(yīng)，克服了片膜芯片在大分子檢測時受表面張力、空間效應(yīng)等對反應(yīng)動力學(xué)的影響，同時利用激光檢測技術(shù)，大大提高了樣品檢測的準確性和重復(fù)性，具有優(yōu)于片膜芯片的操作簡便、重復(fù)性好等特點。目前利用懸浮芯片技術(shù)，國外已經(jīng)開發(fā)了抗體檢測、腫瘤標志、過敏原篩查、自身免疫病、細胞因子等微球懸浮芯片檢測技術(shù)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及一種重癥急性呼吸道綜合癥冠狀病毒(SARS-CoV)的蛋白質(zhì)懸浮芯片的制備及定量檢測方法。本發(fā)明提供一種纟全測SARS-CoV的方法，該方法采用雙抗體夾心免疫學(xué)檢測模式，檢測過程中全部反應(yīng)可在96孔濾板上進行也可在微量離心管中進行。包括下列步驟(1)每孔加入含已包被抗體編碼微球的工作溶液，用清洗液清洗；(2)加入檢測樣品，孵育后清洗；(3)加入用生物素化檢測抗體，孵育后清洗；(4)加入SA-PE,孵育后清洗，(5)加入檢測緩沖液后混勻，(6)用懸浮芯片系統(tǒng)讀取(平均焚光強度)FMI數(shù)值并分析數(shù)據(jù)。本發(fā)明還提供一種SARS-CoV的蛋白質(zhì)懸浮芯片的定量檢測方法，該方法包括下列步驟(1)加入的陽性檢測樣品或標準品經(jīng)4倍梯度倍比稀釋，(2)制作樣品濃度對應(yīng)FMI值的劑量-反應(yīng)曲線，(3)用分析軟件擬合劑量-反應(yīng)曲線和方程，(4)未知濃度樣品可根據(jù)劑量-反應(yīng)曲線和方程判斷樣品檢測濃度，可判定方法檢測限和動態(tài)檢測范圍。本發(fā)明人經(jīng)過大量和深入的研究，對SARS-CoV的蛋白質(zhì)懸浮芯片制備及其檢測條件作了實質(zhì)性的優(yōu)化，其具有下列優(yōu)點1、抗體包被量的改進抗體的包被量需要以檢測效果進行優(yōu)化，懸浮芯片所需的抗體包被量很低，每孔20-40ng/2500-5000個微球/測試，而傳統(tǒng)免疫學(xué)方法-ELISA的包被量為200ng/孔/測試。2、生物素標記的改進標記抗體所用的生物素是過量的，過量的值試劑盒中有參考的計算公式。理論上講，在檢測過程中，過量的生物素因未標記上抗體而不被微球上結(jié)合捕獲抗體的抗原連接，清洗時被抽濾掉，不會與隨后加入的SA-PE反應(yīng)，不影響才企測。但在實際檢測過程中，偶爾遇到過檢測信號可能降低的現(xiàn)象，因此建^l生物素標記抗體后，盡量去除多余的生物素。3、檢測的靈敏度及動態(tài)范圍本發(fā)明SARS-CoV蛋白質(zhì)懸浮芯片方法與經(jīng)典的免疫學(xué)檢測方法——ELISA相比，結(jié)果有著很好的吻合性(相關(guān)系數(shù)R2=0.9874)。同時，懸浮芯片方法靈敏度(4.86ng/mL)高于ELISA方法(25ng/mL)靈敏度高5倍以上；并且懸浮芯片方法動態(tài)檢測范圍(3.91-25600ng/mL)高于ELISA方法動態(tài)檢測范圍(25-6400ng/mL)二個婆t量級。4、方法的特異性本發(fā)明通過選用SARS-CoV病毒主要結(jié)構(gòu)蛋白之一的N蛋白為檢測標的抗原，分別以SARS-CoVN32蛋白制備捕獲抗體，以SARS-CoVN13蛋白制備檢測抗體。本研究試驗證明，在存在重組HIVP24抗原、BSA、酪蛋白、胰蛋白胨、禽流感病毒HA蛋白、NH蛋白等干擾抗原存在條件下本方法具有良好的特異性。同時根據(jù)資料顯示，N蛋白是該病毒結(jié)構(gòu)蛋白中最穩(wěn)定的一種蛋白，也是感染過程中最豐富的病毒蛋白，由于SARS-CoV的N蛋白與其它冠狀病毒的N蛋白存在較大差異，因此能夠有效去除免疫學(xué)檢測中常出現(xiàn)的非特異現(xiàn)象。相關(guān)研究試驗也證實N蛋白是理想的診斷抗原(Che，X.Y.，Qiu，L.W.&Pan,Y.X.Sensitiveandspecificmonoclonalantibody-basedcaptureenzymeimmunoassayfordetectionofnucleocapsidantigeninserafrompatientswithsevereacuterespiratorysyndrome.J.Clin.Microbiol.2004:42(6),2629-2635.)。5、樣品的檢測能力本發(fā)明評價了懸浮芯片方法對"白色粉末，，等環(huán)境和食品樣品的檢測能力。通過對奶粉、小麥面粉、玉米淀粉、混合型果珍粉末等模擬添加樣品的檢測，初步證實了該方法在檢測可疑污染鼠疫菌等生物威脅因子的"白色粉末"樣品中的實用性。圖1:SARS-CoV檢測用044號微球包被SARS-CoVN蛋白抗體檢測示意圖2圖4蛋白質(zhì)懸浮芯片方法檢測SARS-CoVN蛋白標準曲線圖；ELISA方法檢測SARS-CoVN蛋白標準曲線圖；蛋白質(zhì)懸浮芯片與ELISA方法檢測SARS-CoV的相關(guān)性(具體實施例方式本發(fā)明涉及的定量檢測SARS-CoV病毒的蛋白質(zhì)懸浮芯片及其制備方法和檢測方法通過下面的具體實施方式作進一步說明，但本發(fā)明不以任何方式受該實施例的限定。一、材料本發(fā)明采用下列緩沖液來制備懸浮芯片并進行目標物的檢測(1)0.03MPB緩沖液(pH7.2):2.83gNa2HP04,1.36gKH2P04定容至1L。(2)0.01MPB緩沖液(pH7.2):由0.03MPB緩沖液稀釋而成。(3)PBS緩沖液(pH7.4):NaCl137mmol/L;KC12.7mmol/L;Na2HP0410mmol/L;KH2P042mmol/L。用800mL蒸餾水溶解8gNaCl，0.2gKCl，1.44gNa2HP04#0.24gKH2P04。用HC1調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.4,加水至1L。分裝后在15psi(1.05kg/cm2)高壓蒸汽20分鐘，或過濾除菌，保存于室溫。(4)微球清洗液PBS(pH7.4)，0.05%TWEEN-20。(5)微球活化緩沖液100mMNaH2P04:3gNaH2P04,5NNaOH1.5mL，定容于250mL，pH6.2。(6)微球包被緩沖液0.05MMES,pH5.0:2.44gMES,5NNaOH0.15mL,定容于250mL。(7)微球保存液PBS-TBN:PBS，0.1%BSA，0.02。/。TWEEN,0.05%疊氮化物，pH7.4。(8)微球封閉液PBS-BN:PBS,1%BSA,0.05%疊氮化物,pH7.4。(9)檢測緩沖液PBS,1%BSA,pH7.4。(10)抗體稀釋液0.01mmol/LPB(pH7.2)。(11)微球稀釋液PBS,1%BSA，pH7.4。(12)樣品稀釋液:0.01MPB,pH7.2。(13)生物素化抗體稀釋液PBS-TBN(PBS，0.1%BSA,0.02%TWEEN-20，0.05%NaN3,pH7.4)。(14)SA-PE稀釋液PBS(pH7.4),1%BSA。二、抗原抗體本發(fā)明所使用SARS-CoVN蛋白抗原為重組SARS-CoV全長核蛋白-N32(aal-422)和重組SARS-CoV核蛋白片段N13(aa221-422),均經(jīng)鎳親和柱純化。本發(fā)明所使用捕獲抗體為兔抗SARS-CoVN32IgG,檢測抗體為生物素化兔抗SARS-CoVN13IgG。三、待測樣品的制備1、目標分析物樣品的制備目標分析物為SARS-CoV，但涉及烈性傳染病生物安全問題，以SARS-CoVN蛋白作為目標分析物樣品。干擾樣品或作為方法特異性測試的樣品是目標檢測物外的其它病毒或其它蛋白質(zhì)，包括重組HIVP24抗原、牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白、胰蛋白胨、禽流感病毒HA蛋白、禽流感病毒NH蛋白等。將上述待分析樣品均溶于樣品稀釋液液中，4°C保存。SARS-CoVN蛋白的儲備液濃度均為lmg/mL。比4支實-驗中，同樣的樣品用于ELISA和懸浮芯片的檢測。將待分析的SARS-CoVN蛋白用樣品稀釋液以4倍倍比稀釋為不同濃度樣品，以繪制樣品檢測劑量-反應(yīng)的標準曲線，其中幾個樣品濃度低于檢測的敏感度，高濃度樣品應(yīng)使編碼微球的結(jié)合位點處于飽和狀態(tài)。2、模擬污染樣品分別將0.5g奶粉、玉米淀粉、小麥面粉、速溶杲珍等粉末加入到5mL樣品稀釋液中，將不同濃度的SARS-CoVN蛋白摻入到粉末樣品中，經(jīng)充分振搖混勻，靜置2h以上，使目標分析物與待測模擬白色粉末充分吸附。再用脫脂棉、薄濾紙、厚濾紙、0.45nm濾膜濾紙過濾或j氐速離心(2000rpm,lmin)后，上清液作為待檢樣品進行懸浮芯片方法的^r測。實施例1、檢測SARS-CoV病毒的蛋白質(zhì)懸浮芯片的制備1、捕獲抗體包被編碼微球本發(fā)明采用的編碼微球可以購自LUMINEX、BIO-RAD等公司，所用的編碼微球用于標記可以捕獲SARS-CoV病毒N蛋白的抗體，即利用兔抗SARS-CoVN32IgG包被微球。A、編碼微球的活化取100jiL(1.25xl()6個)編碼微球到1.5mL離心管中，14000g離心，小心吸出并棄去上清液。加入lOO)iL的微球清洗緩沖液懸浮，震蕩并超聲后14000g離心，小心吸出并棄去上清液。加入100pL的微球活化緩沖液，接著先加入10pL新鮮配置的EDC(50mg/mL),緊接著加入10pL新鮮配置的Sulfo-NHS(50mg/mL),在室溫震搖20分鐘。加入150pL的PBS(pH7.4),震蕩后，14000g離心，小心吸出并棄去上清液。加入1(%L的PBS(pH7.4)懸浮編碼微球。B、用抗體包被編碼微球取捕獲抗體兔抗SARS-CoVN32IgG4-50昭加入到活化后的編碼微球中，用PBS緩沖液定容至500|iL,室溫震搖2小時。14000g離心，小心吸出并棄去上清液。用500pL的PBS緩沖液洗一次，14000g離心，小心吸出并棄去上清液。加入250pL的封閉緩沖液懸浮編碼微球，在室溫震搖30分鐘，14000g離心，小心吸出并棄去上清液。加入500jiL的微球保存液洗滌編碼微球，16000g離心，小心吸出并棄去上清液。最后用150nL的微球保存液懸浮編碼微球，于4。C避光保存?zhèn)溆?。C、包被微球的計數(shù)吸取適量微球，稀釋后，用血球計數(shù)板(0.10mm;1/400mm、在普通顯微鏡下計數(shù)。根據(jù)公式(每個大格數(shù)xlO、稀釋倍數(shù)x體積(mL))計算微球數(shù)量。2、檢測抗體標記的生物素A、生物素的標i己分別配制好濃度為10mM生物素溶液和2mg/mL的待標記抗體溶液，將計算好體積的生物素加入到待標記抗體溶液中，在室溫震搖30分鐘(或水上2小時)，過柱脫鹽后分裝，-2(TC凍存?zhèn)溆谩、抗體用量計算以標記2mg/mL的IgG(分子量150,000)1mL溶液為例，需加入IOmM生物素溶液約27jn。計算過程如下、2mglgG'immollgG20mmofBiofin，..1miigGx~~x-^——x-=0.000266mmolB,otin1m！IgG150,000呵!gG1mmolIgG0.000266mmolBio加x~——^——^-x------=26.6ylBiot!nReagentL10mmol結(jié)杲判定若陰性對照孔出現(xiàn)很淡藍色，陽性孔顏色很深，則生物素化抗體可使用；否則，需重新進行新一輪抗體的生物素化標記。實施例2、懸浮芯片制備條件的優(yōu)化1、微球包被不同抗體及包被量的選擇分另U以4)ig、8pg、10ng、16pg、24)ig、40pg、48^g的量包#:100pL編碼為044號的微球。經(jīng)質(zhì)控過程檢測，以10jig/1.25x106個微球即20-40ng/2500-5000個微球/測試包被效果最好，顯微鏡下計數(shù)后避光冷藏保存待用。優(yōu)化的懸浮芯片檢測系統(tǒng)可成功用于SARS-CoV檢測。包被SARS-CoV蛋白N抗體的044號微球均落在其正確檢測區(qū)域內(nèi)(如圖1所示)，并且獲得高信噪比結(jié)果(MFI值遠大于2000)。2、生物素化抗體的優(yōu)化本發(fā)明分別用氨基活性的生物素(生物素-LC-hydrazide)和羧基活性的生物素(即Sulfo-NHS-生物素，SH-活性的生物素)標記檢測抗體，經(jīng)檢測效果比較，本實驗中SH-活性的生物素標記檢測抗體檢測效果較好，檢測效果的方法采用本領(lǐng)域的常規(guī)方法或安裝制造商的產(chǎn)品說明書所述的方法。本發(fā)明人經(jīng)過試驗驗證，發(fā)現(xiàn)2mg/mL生物素化的抗體以1:1000稀釋作為檢測抗體進行檢測，檢測結(jié)果顯示生物素化檢測抗體Bio-兔抗SARS-CoVN13可獲得高檢測值和低背景值的檢測效果。實施例3、懸浮芯片檢測樣品的制備和檢測1、待測樣品制備用樣品稀釋液將SARS-CoVN蛋白抗原配置為不同濃度待測樣品進行蛋白懸浮芯片檢測。2、樣品的檢測采用雙抗體夾心免疫學(xué)檢測模式，檢測過程中全部反應(yīng)均在％孔濾板上進行。1)每孔加入50pL含相應(yīng)編碼微J泉的工作溶液，用清洗液洗滌并用真空泵抽濾；2)加入50(iL才全測樣品，混勻后室溫避光震搖30分鐘，用清洗液洗滌并抽濾；3)加入50適當(dāng)濃度的用抗體稀釋液稀釋后的生物素化抗體，混勻后室溫避光震搖30分鐘，洗液洗滌并真空泵抽濾；ii4)加入50|xL的SA-PE,混勻后室溫避光震搖IO分鐘。洗液洗滌并真空泵抽濾；5)加入125pL的檢測緩沖液，經(jīng)蝸旋重懸混勻；6)用懸浮芯片系統(tǒng)讀取FMI數(shù)值并分析數(shù)據(jù)。實施例4、懸浮芯片對SARS-CoVN蛋白抗原的特異性檢測應(yīng)用懸浮芯片檢測方法分別對重組HIVP24抗原、BSA、酪蛋白、胰蛋白胨、禽流感病毒HA蛋白、禽流感病毒NH蛋白等進行4僉測，僅SARS-CoVN蛋白抗原為陽性，其余干擾抗原均為陰性。說明本發(fā)明所建立的SARS-CoVN蛋白抗原懸浮芯片檢測方法與其它測試抗原均不發(fā)生交叉反應(yīng)或非特異反應(yīng)。實施例5、懸浮芯片定量檢測模型的建立1、SARS-CoVN蛋白抗原標準曲線樣品制備用樣品稀釋液將SARS-CoVN蛋白抗原標準品由25.6嗎/mL以4倍倍比梯度稀釋至0.391ng/mL成系列濃度樣品。同時，相同樣品用于ELISA方法檢測。2、劑量-反應(yīng)標準曲線的繪制按照實施例3中的檢測方法檢測上述系列濃度樣品，并根據(jù)懸浮芯片系統(tǒng)檢測結(jié)果繪制對數(shù)-對數(shù)劑量-反應(yīng)標準曲線(如圖2所示)。其中，X軸代表抗原的濃度(ng/mL),Y軸代表懸浮芯片儀檢測的熒光值(MFI)。每個數(shù)據(jù)代表3次的檢測結(jié)果平均值，坐標軸以對數(shù)-對數(shù)關(guān)系設(shè)定。懸浮芯片系統(tǒng)根據(jù)檢測結(jié)果擬合劑量-反應(yīng)標準曲線方程FI=0.921362+(9400.93-0.921362)/[1+(Cone/U40.28)-。604039]2199953、懸浮芯片檢測SARS-CoVN蛋白抗原的靈敏度和動態(tài)范圍本發(fā)明定義最低檢出限(LOD值)為臨界值(Cutoff)對應(yīng)的檢測物濃度。其中，Cutoff的定義是采用空白對照樣品(Blank)熒光檢測信號MFI均值加3倍標準差(SD),即Cutoff值為=MFIBlank+3xSD。根據(jù)最低檢出限定義和標準曲線方程，判定懸浮芯片檢測SARS-CoVN蛋白抗原的靈敏度為4.86ng/mL，其Cutoff-104.68(Blank二87.5,SD=5.66)。本發(fā)明定義最高檢出限為使編碼微球的結(jié)合位點處于飽和狀態(tài)的檢測物濃度。根據(jù)標準曲線隨著SARS-CoVN蛋白抗原濃度的升高，其對應(yīng)的MFI值也隨之遞增，當(dāng)SARS-CoVN蛋白抗原濃度超過25600ng/mL時，抗原抗體的免疫反應(yīng)達到飽和狀態(tài)，MFI值開始進入平臺期，說明樣品中的待檢物濃度過高，需要將樣品稀釋后再檢測。因此，根據(jù)最低檢出限與最高檢出限可以判定本發(fā)明即懸浮芯片定量檢測SARS-CoVN蛋白抗原的動態(tài)范圍為4.86~25600ng/mL。實施例6、蛋白懸浮芯片方法與ELISA方法檢測SARS-CoVN蛋白抗原的比較1、雙抗體夾心ELISA檢測方法作為對這，采用包括下列步驟的雙抗體夾心ELISA檢測1)向普通ELISA微孔板每孔加入50^iL用PB緩沖液稀釋的捕獲抗體5-50嗎，4。C靜止過夜；2)加入封閉液，在37。C封閉2小時；3)洗液洗3次，拍千；4)加入檢測樣品，每孔50fiL,室溫放置40分鐘；洗液洗3次，拍干；5)加入適量生物素化檢測抗體，每孔50pL，室溫放置30分鐘；洗液洗3次，拍干；6)加入適量SA/HRP(辣根酶標記鏈霉親和素)，50pL/孔，室溫放置3分^lf;洗液洗3次，拍干；7)加入TMB顯色液(可溶型單組分TMB底物溶液)顯色，50jiL/孔，室溫放置IO分鐘；8)用2MH2S04終止反應(yīng)；9)應(yīng)用酶標儀測讀A45o師數(shù)值。2、樣品的懸浮芯片檢測方法采用雙抗體夾心免疫學(xué)檢測模式，檢測過程中全部反應(yīng)均在96孔濾板上進行。1)每孔加入50pL含相應(yīng)編碼農(nóng)(球的工作溶液，洗液洗滌并用真空泵抽濾2次；2)加入50^L^r測樣品，混勻后室溫避光震搖30分鐘，用清洗液洗滌并4由濾3次；3)加入50|iL適當(dāng)濃度的用抗體稀釋液稀釋后的生物素化抗體，混勻后室溫避光震搖30分鐘，洗液洗滌并真空泵抽濾3次；4)加入50(iL的SA-PE,混勻后室溫避光震搖10分鐘。用清洗液洗滌并真空泵抽濾3次；5)加入125pL的檢測緩沖液，經(jīng)蝸旋重懸混勻；6)用Bio-Plex懸浮芯片系統(tǒng)讀取FMI數(shù)值并分析數(shù)據(jù)。3、兩種檢測方法的靈敏度和動態(tài)范圍及相關(guān)性的比較實施例5中制備的相同一組SARS-CoVN蛋白抗原樣品同時應(yīng)用懸浮芯片和ELISA方法進行檢測。繪制ELISA方法檢測SARS-CoVN蛋白抗原的標準曲線(圖2和圖3中橫坐標為樣品濃度，縱坐標為吸光度值，坐標軸取對數(shù)-對數(shù)關(guān)系)，并與實施例5中懸浮芯片方法結(jié)果進行比較。根據(jù)兩種方法標準曲線懸浮芯片方法(如圖2所示)靈敏度為4.86ng/mL,線性凈全測范圍4.86~25600ng/mL;ELISA方法(如圖3所示)靈敏度為25ng/mL,線性檢測范圍25-6400ng/mL。可以得出結(jié)論檢測相同SARS-CoVN蛋白抗原樣品，蛋白懸浮芯片方法比ELISA方法具有更高的檢測靈敏度，即高5倍；并且具有更寬的動態(tài)檢測范圍，即高2個數(shù)量級。另外，將兩種方法檢測結(jié)果在25-6400ng/mL范圍內(nèi)進行比較，如圖4所示，可以判定蛋白懸浮芯片方法與ELISA方法有良好的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)為0.9874。實施例7、人工污染"白色粉末"樣品的檢測1、人工污染"白色粉末"樣品的制備將一定含量的SARS-CoVN蛋白或空白(樣品稀釋液)依照不同濃度分別摻入奶粉、淀粉、面粉、速溶果珍等粉末樣品制備人工污染樣品。將0.5g粉末加入到5mL樣品稀釋緩沖液中，充分混勻，靜置2小時，讓待測樣品與白色粉末充分吸附。2、人工污染"白色粉末，，樣品的檢測對上述被污染的"白色粉末"樣品進行處理，選用棉花、薄濾紙、厚濾紙、0.45nm濾膜、0.22nm濾膜過濾，以及2000rpm、5分鐘和1000rpm、4分鐘低速離心等方法處理人工添加樣品后的粉末溶液，收集濾液或上清液后按照實施例進行懸浮芯片分析檢測。表1懸浮芯片對人工污染"白色粉末"樣品的檢測結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>注十代表檢測結(jié)果陽性；一代表檢測結(jié)果陰性根據(jù)所檢測的18個樣品中，檢測結(jié)果如表1所示全部正確，初步證明了蛋白懸浮芯片方法可以快速、準確、高效地應(yīng)用于SARS-CoV病毒污染的"白色粉末"樣品的實際檢測工作。權(quán)利要求1、一種采用雙抗體夾心免疫學(xué)檢測模式檢測重癥急性呼吸道綜合癥冠狀病毒(SAS-CoV)的方法，其特征在于，檢測過程中全部反應(yīng)可在96孔濾板或者微量離心管中進行，該方法包括下列步驟(1)向孔加入含已包被抗體編碼微球的工作溶液，用清洗液清洗；(2)加入待測樣品，孵育后清洗；(3)加入用生物素化的檢測抗體，孵育后清洗；(4)加入SA-PE，孵育后清洗；(5)加入檢測緩沖液后混勻；(6)用懸浮芯片系統(tǒng)讀取平均熒光強度(FMI)數(shù)值并分析數(shù)據(jù)。2、如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，用于包被微球的捕獲抗體為兔抗SARS-CoVN32IgG,采用生物素標記的兔抗SARS-CoVN13作為檢測抗體，并且其組合組成雙抗夾心;險測體系。3、如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述的包被微球的捕獲抗體兔抗SARS-CoVN32IgG用量為10嗎/1.25x106個編碼微球或20-40ng/2500-5000個微球/測試。4、如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述方法中的標記^^測抗體兔抗SARS-CoVN13的生物素為l基活性的生物素。5、如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，2mg/mL生物素化的檢測抗體Bio-兔抗SARS-CoVN13以1:1000稀釋作為檢測抗體進行檢測。6、一種定量檢測重癥急性呼吸道綜合癥冠狀病毒(SAS-CoV)的蛋白質(zhì)懸浮芯片方法，其特征在于，該方法包括下列步驟(1)加入的陽性檢測樣品或標準品經(jīng)梯度倍比稀釋，所述梯度倍比稀釋為4倍；(2)將系列稀釋樣品在懸浮芯片中檢測讀取對應(yīng)熒光值(MFI);(3)制作樣品濃度對應(yīng)MFI值的劑量-反應(yīng)曲線；(4)用分析軟件擬合劑量-反應(yīng)曲線和方程；(5)未知濃度樣品可根據(jù)劑量-反應(yīng)曲線和方程判斷樣品檢測濃度，可判定方法檢測限。7、如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，在測定待測樣品的FMllt值時包括以下的步驟(1)加入含相應(yīng)編碼微球的工作溶液，洗涂；(2)加入待測樣品，混勻后室溫避光震搖，洗滌；(3)加入適當(dāng)濃度的用抗體稀釋液稀釋后的生物素化抗體，混勻后室溫避光震搖，洗滌；(4)加入SA-PE,室溫避光震搖，洗滌；(5)加入的檢測緩沖液，經(jīng)振搖重懸混勻，用懸浮芯片系統(tǒng)讀取FMI數(shù)值并分析數(shù)據(jù)。8、如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，用于包被微球的捕獲抗體為兔抗SARS-CoVN32IgG,采用生物素標記的兔抗SARS-CoVN13作為檢測抗體。9、如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述的包被微球的捕獲抗體兔抗SARS-CoVN32IgG用量為10嗎/1.25x106個編碼微球或20-40ng/2500-5000個微球/測試。10、如權(quán)利要求6所迷的方法，其特征在于，所述方法中的標記檢測抗體兔抗SARS-CoVN13的生物素為氣基活性的生物素。11、如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，2mg/mL生物素化的檢測抗體Bio-兔抗SARS-CoVNl3以1:1000稀釋作為4全測抗體進行檢測。全文摘要本發(fā)明涉及一種定量檢測重癥急性呼吸道綜合癥冠狀病毒(SAS-CoV)的蛋白質(zhì)懸浮芯片及其制備方法。本發(fā)明的方法檢測能力好、靈敏度高、特異性強、動態(tài)范圍寬，并建立了新的檢測模式化平臺。文檔編號G01N33/569GK101493461SQ20091007881公開日2009年7月29日申請日期2009年3月4日優(yōu)先權(quán)日2009年3月4日發(fā)明者蕾周,孫肖紅,宇楊,靜王,胡孔新,邱茂鋒申請人:中國檢驗檢疫科學(xué)研究院