專利名稱：豬圓環(huán)病毒Ⅱ型-豬肺炎支原體表達菌株的構(gòu)建及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及豬圓環(huán)病毒Ii型-豬肺炎支原體表達菌株的構(gòu)建及應(yīng)用，屬于生物技 術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
豬圓環(huán)病毒II型(Porcine circovirus 2，PCV2)可引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜 合癥(PMWS)，包括豬皮炎與腎炎綜合癥(PDNS)、增生性壞死性肺炎(PNP)、豬呼吸道綜合癥 (PRDC)等疾?。恢饕呐R床特點為進行性消瘦，衰弱及呼吸困難和淋巴結(jié)腫大，有時可見 腹瀉，蒼白，黃疸。該病的發(fā)病率及死亡率差異很大，急性暴發(fā)時死亡率可達15%以上；主 要的病理變化為淋巴細胞缺失，淋巴樣組織的組織細胞浸潤、間質(zhì)性肺炎、不同程度的肝炎 及間質(zhì)性腎炎。目前PCV2已經(jīng)在全世界廣泛流行，我國的PMWS抗體陽性率隨豬的年齡的 增長而上升。王忠田等和孫泉云等對國內(nèi)規(guī)模化豬場的血清學(xué)調(diào)查表明，我國規(guī)?；i場 中已經(jīng)廣泛存在PCV2的感染，該病的發(fā)生會引起混合感染，給我國的養(yǎng)豬業(yè)造成很大的經(jīng) 濟損失。目前國際上對該病的防控已經(jīng)研發(fā)出幾種疫苗可以使用，其中有PCV2滅活疫苗， PCV1-2嵌合疫苗，PCV2亞單位疫苗。但是滅活疫苗存在抗原含量低，生產(chǎn)成本高的缺陷。豬肺炎支原體可引起豬支原體肺炎，又稱豬喘氣病或豬地方性流行性肺炎，普遍 存在于世界各地?；疾∝i的主要臨床癥狀為咳嗽和氣喘，體溫基本正常，生長遲緩，飼料轉(zhuǎn) 化率低。解剖時以肺部病變?yōu)橹鳎纫詢煞涡娜~，中間葉和尖葉出現(xiàn)胰樣變和肉樣變?yōu)槠涮?征。幾乎所有的肺炎支原體都極易繼發(fā)感染。國內(nèi)豬肺炎支原體的感染率已達70%，該病 的控制目前有藥物治療及疫苗免疫，抗生素治療有耐藥性的問題，目前主要的防控措施是 疫苗免疫，國際主要的疫苗為滅活疫苗，但是該疫苗的使用不能夠完全的抵御肺炎支原體 的再次感染，國內(nèi)主要的疫苗為弱毒疫苗，該疫苗的免疫效果明顯，但是主要的問題是該疫 苗的生產(chǎn)成本高，并且免疫途徑特殊，嚴重的制約著該疫苗的推廣使用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供豬圓環(huán)病毒II型(PCV2)-豬肺炎支原體(Mhp)表達菌株的構(gòu)建方法， 該方法構(gòu)建的菌株為大腸桿菌表達宿主菌，其所表達重組蛋白免疫豬的效果明顯，可以產(chǎn) 生針對重組蛋白的抗體，能夠有效的抵抗豬圓環(huán)病毒及豬肺炎支原體的攻擊，該菌株還可 用來生產(chǎn)豬圓環(huán)病毒II型-豬肺炎支原體的防治疫苗，該疫苗免疫安全性好，免疫效果明
Mo本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的本發(fā)明提供豬圓環(huán)病毒II型(PCV2)-豬肺炎支原體(Mhp)表達菌株的構(gòu)建方法， 其特征在于步驟如下(1)PCV2CAP基因和Mhp Rl基因的擴增及克隆分別以PCV2和Mhp毒株提取的DNA為模板，用特異性引物，PCR擴增，得到PCV2的CAP蛋白的核酸片段及豬肺炎支原體的主要抗原決定區(qū)Rl的核酸片段，其大小分別為 718bp和M6bp，然后將得到的克隆片段CAP及Rl分別克隆到克隆載體pMD_18_T上，得到 克隆載體 pMD-18-T-CAP 和 pMD-18-T-Rl ；(2)含有PCV2CAP基因和Mhp Rl基因的原核表達載體的構(gòu)建通過限制性內(nèi)切酶將克隆片段CAP及Rl分別連接到原核表達載體pET48a(+) 中，得到原核表達質(zhì)粒pET-28a (+) -Rl-CAP ；(3)含有原核表達質(zhì)粒pET18a(+)-Rl-CAP的表達菌株的獲得通過轉(zhuǎn)化的方法將原核表達質(zhì)粒pET18a(+)-Rl-CAP通過熱擊轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化到 大腸桿菌感受態(tài)細胞BL21(DE3)中，然后通過卡那霉素抗性篩選的方法得到陽性克隆菌 株，后小量提取質(zhì)粒進行雙酶切鑒定，最后進行測序鑒定，得到陽性原核表達菌株。其中，PCR擴增中用的PCV2和Mhpl的特異性引物，其序列分別如下CAP-Pl 5 ‘AAGCTTGCATGACGTATCCAAGGAG，3CAP-P2 5 iGTGCGGCCGCAGGGTTAAGTGGGGG' 3Rl-Pl 5 ‘GCGGATCCGCAGCAAAACCAGAAGC，3R1-P2 5 ‘GCAAGCTTGAGCAACTGGTTTTGCT， 3。本發(fā)明還提供了該豬圓環(huán)病毒II型(PCV2)-豬肺炎支原體(Mhp)表達菌株的構(gòu) 建方法所得到的表達菌株。本發(fā)明的豬圓環(huán)病毒II型(PCV2)-豬肺炎支原體(Mhp)表達菌株的構(gòu)建方法所 得到的表達菌株可以用于制備疫苗，在疫苗的制備過程中，利用表達菌株所表達的重組蛋 白作為抗原，抗原與油佐劑的比例為1 1 1 5 ；其中，油佐劑包含90-98wt%的白油、 2-10wt%的司本-80 ；將重量百分比為90-98%白油與2-10%司本-80混合，100毫升混合 液中加入1-2克硬脂酸鋁即得本發(fā)明的油佐劑。本發(fā)明疫苗的制備，其步驟如下(1)生產(chǎn)用抗原的制備大量培養(yǎng)表達菌株，得到抗原蛋白，作為生產(chǎn)用抗原；(2)生產(chǎn)用抗原的乳化按比例加入油佐劑，乳化配制成疫苗。其中，本發(fā)明所用的豬圓環(huán)病毒II型(PCV2)毒株可為當前中國國內(nèi)公開的任何 一株P(guān)CV2毒株，其基因序列已在Genebank中公開，也可參見本說明書的序列表部分，含有 ORFl和0RF2編碼區(qū)，不同的豬圓環(huán)病毒II型毒株基因序列會有一些差異，但都可以擴增得 到CAP基因。本發(fā)明中的豬肺炎支原體(Mhp)株，可為當前中國公開的任何一流行株，其基 因序列已在Genebank中公開，也可參見本說明書的序列表部分，不同的豬肺炎支原體株基 因序列會有一些差異，但都可以擴增得到Rl基因。本發(fā)明首次將豬圓環(huán)病毒II型及豬肺炎支原體的主要抗原蛋白構(gòu)建在原核表達 載體pET48a(+)上，得到一個重組表達菌株，該菌株可突破PCV2常規(guī)疫苗的局限性及Mhp 常規(guī)滅活疫苗和弱毒疫苗的局限性。用該菌株表達的重組蛋白制備疫苗，成本低，具有更好 的免疫安全性，并且免疫效果顯著。該基因工程菌的表達量高，后期可以采用生物發(fā)酵罐進 行生產(chǎn)，可以大大的降低生產(chǎn)成本，并且達到了一針防兩病的目的，比目前常規(guī)疫苗具有更 多的優(yōu)勢，會節(jié)約人力、物力和財力。


圖1擴增的CAP片段電泳2擴增的Rl片段電泳3構(gòu)建的原核表達載體pET48a(+)-Rl-CAP的質(zhì)粒電泳4雙酶切原核表達載體pET48a(+)-Rl-CAP的電泳5克隆質(zhì)粒pMD-18-T-CAP的構(gòu)建圖譜圖6克隆質(zhì)粒pMD-18-T-Rl的構(gòu)建圖譜圖7原核表達質(zhì)粒pET_28a (+) -Rl-CAP的構(gòu)建圖譜
具體實施例方式實施例1豬圓環(huán)病毒II型-豬肺炎支原體原核表達菌株的構(gòu)建(1)PCV2CAP基因和Mhp Rl基因的擴增及克隆A、引物的設(shè)計根據(jù)Genebank中PCV2的全基因組序列設(shè)計表達CAP蛋白的0RF2基因序列的引 物，并且根據(jù)所選擇的原核表達載體pET18a(+)的酶切位點在所設(shè)計的引物中加入酶切 位點，其引物序列具體如下CAP-Pl 5 ‘CAAGCTTGCATGACGTATCCAAGGA’ 3CAP-P2 5 ‘GTGCGGCCGCTTAAGGGTTAAGTGG’ 3根據(jù)Genebank中Mhp的全基因組序列設(shè)計重復(fù)序列區(qū)Rl的基因序列的引物，并 且根據(jù)所選擇的原核表達載體pET18a(+)的酶切位點在所設(shè)計的引物中加入酶切位點， 其引物序列具體如下Rl-Pl 5 ‘GCGGATCCGCAGCAAAACCAGAAGC，3R1-P2 5 ‘GCAAGCTTGAGCAACTGGTTTTGCT， 3B、目的片段的克隆通過PCR的方法，分別以PCV2和Mhp所提取的DNA為模板，擴增目的片段CAP及 Rl0 PCR的反應(yīng)程序為94°C預(yù)變性anin，94°C變性45s，57°C退火30s，72°C延伸lmin，循 環(huán)30次，最后72°C延伸lOmin。反應(yīng)結(jié)束后，制備的TAE瓊脂糖凝膠，將PCR產(chǎn)物與10μ 16X上樣緩沖液均勻 混合后加樣，IOOV電壓電泳30分鐘左右，然后將凝膠放在紫外燈下觀察，并在凝膠成像系 統(tǒng)中成像并分析，在紫外燈下，切下目的片段的膠塊，放于一個印pendorf管內(nèi)。然后使用 瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進行回收。分別得到克隆片段CAP和Rl。C、克隆質(zhì)粒 pMD18T-CAP 和 pMD18T_Rl 的構(gòu)建通過TA連接的方法將克隆片段CAP和Rl分別連接到pMD18T克隆載體上。具體 的步驟回收產(chǎn)物加A0加A反應(yīng)體系回收PCR產(chǎn)物30 μ L，dATPl μ L，IOxbuffer3. 5 μ L， TaqDNA聚合酶0. 5 μ L。將所有的物質(zhì)混勻后放于PCR反應(yīng)儀中72°C作用15min。然后進 行凝膠電泳，對產(chǎn)物進行回收。然后連接構(gòu)建T載體克隆質(zhì)粒，反應(yīng)體系為加A后回收的 產(chǎn)物 4. 5yL，pMD-18T 載體 0. 5yL，Solution I 5 μ L, Total 10 μ L0 然后輕輕混勻后，于 16°C連接過夜。然后通過抗性篩選得到陽性質(zhì)粒即為所構(gòu)建成功的克隆質(zhì)粒PMD18T-CAP和 pMD18T-Rl。(2)含有PCV2CAP基因和Mhp Rl基因的原核表達載體的構(gòu)建原核表達載體pET48a(+)雙酶切，根據(jù)擴增片段Rl所選擇的酶切位點HindIII 和BamH I對表達載體進行雙酶切，然后將目的片段Rl同樣進行HindIII和BamH I雙酶 切，然后進行連接反應(yīng)，將目的片段插入到表達載體上得到pET48a(+) -Rl質(zhì)粒。同理根 據(jù)擴增片段CAP所選擇的酶切位點HindIII和Nco I對pET_28a(+)-Rl質(zhì)粒進行雙酶 切，然后將目的片段CAP同樣進行HindIII和Nco I雙酶切，同理進行連接反應(yīng)。得到 pET-28a(+)-Rl-CAP原核表達質(zhì)粒。通過卡那霉素抗性篩選得到陽性質(zhì)粒。(3)含有原核表達質(zhì)粒pET48a(+)-Rl-CAP的表達菌株的獲得將構(gòu)建得到的陽性表達質(zhì)粒pET48a(+)-Rl-CAP轉(zhuǎn)化到表達宿主菌BL21 (DE3) 中，構(gòu)建得到原核表達菌株。實施例2豬圓環(huán)病毒II型-豬肺炎支原體原核表達菌株表達產(chǎn)物的誘導(dǎo)及大量 生產(chǎn)(1)原核表達菌株的誘導(dǎo)表達將篩選出的陽性菌進行誘導(dǎo)篩選。方法a將保存的菌液按1 1000的比例接種 加有Kan抗性的5mLhYT培養(yǎng)基，37°C過夜培養(yǎng)14h。其中要接種一管空質(zhì)粒菌作為對照。 b次日將過夜培養(yǎng)的新鮮菌以1 1000的比例接種到加有Kan抗性的5mLhYT培養(yǎng)基中， 每個菌接種兩管其中一個用于誘導(dǎo)，一個用于非誘導(dǎo)對照，于37 °C培養(yǎng)池。使OD6tltlnm值達到 0. 4 0. 5。c然后其中一管加入誘導(dǎo)劑IPTG使終濃度為lmmol/1，于37°C培養(yǎng)釙。d每個 菌取1. 5mL到印pendorf管中，12000rpm離心，棄去上清得到沉淀，然后每管中加入100 μ L 的PBS洗滌一次，最后加入300 μ LPBS和100 μ L4x蛋白上樣buffer，充分混勻，冰上作用 15min，100°C煮沸3 5min。e煮沸后于12000rpm離心lOmin。f取離心后的上清液進行 SDS-PAGE，誘導(dǎo)和非誘導(dǎo)樣一組，檢測每個菌的誘導(dǎo)能力。比較表達的目的蛋白的大小及表 達的蛋白條帶的寬度來判斷每個菌的表達能力。g每個蛋白挑選表達能力高的兩個菌。準 備用于大量的蛋白的表達。(2)表達產(chǎn)物的鑒定按照常規(guī)的SDS-Page方法對表達產(chǎn)物進行鑒定。(3)表達產(chǎn)物的純化用Ni-NTA His. Bind Resin純化柱純化融合蛋白。方法將lmL50 %的Ni-NTA His. Bind Resin填充材料于4mLlxNi_NTA Bind Buffer輕輕混勻。在重力作用下使樹脂堆 積，然后用槍頭除去4mL的上清液。然后加入4mL的溶解物(表達的上清液)與填料混勻， 在4°C搖床上混勻作用lh。然后將填料加到層析柱中，填料沉積下來后，打開柱子底下的 帽，打開蛋白純化儀進行純化，收集流出的液體，留作SDS-PAGE。然后用h4mLlxNi-NTAwash buffer洗柱子，收集洗出的液體，留作SDS-PAGE，接著用乜0. 5mLIxNi-NTA Elution Buffer 洗脫下來蛋白，收集洗脫液，留作SDS-PAGE。(4)表達產(chǎn)物的大量表達及表達產(chǎn)物的定量根據(jù)上述步驟大量誘導(dǎo)表達目的蛋白，同樣對表達產(chǎn)物進行純化，最后用 NanoDrop ND-1000spectrophotometer蛋白定量儀器對表達產(chǎn)物進行蛋白含量的定量，得 到2000mg/L的蛋白。
實施例3豬圓環(huán)病毒II型-豬肺炎支原體原核表達菌株表達產(chǎn)物的疫苗制備(1)生產(chǎn)用抗原的制備按照實施例2制備的蛋白作為生產(chǎn)疫苗用的抗原。(2)抗原的乳化將生產(chǎn)用的抗原按照1 1的比例(抗原油佐劑)加入油佐劑，乳化得到實驗
用疫苗。所用的油佐劑配制為90wt%白油和10wt%司本-80組成的油佐劑混合液中加入 硬脂酸鋁，其中硬脂酸鋁加入量為1克/100毫升油佐劑混合液。本實施例共制備了 1批豬 圓環(huán)病毒II型-豬肺炎支原體疫苗，制備的疫苗物理性狀檢驗、安全檢驗、效力檢驗等均 合格。所制備疫苗的質(zhì)量標準①性狀外觀乳白色乳劑。劑型為油包水型。取一個清潔吸管，吸取少量疫苗滴于冷水中，除第1滴外，均 應(yīng)不擴散。穩(wěn)定性取疫苗IOmL加入離心管中，以3000rpm離心15min，應(yīng)不分層，管底析出 的水相應(yīng)不大于0. 5mL。粘度用ImL吸管(下口的內(nèi)徑1. 2mm，上口內(nèi)徑2. 7mm)吸取25°C左右的疫苗 ImL,令其垂直自然流出，記錄流出0. 4mL所需的時間，應(yīng)在8秒以內(nèi)。②無菌檢驗按《中國獸藥典》進行，應(yīng)無菌生長。③安全檢驗選取3-4周齡PCV2和Mhp抗原抗體陰性的健康仔豬10頭，分為2組，每組各5頭， 分別進行一次超劑量(4mL)和單劑量重復(fù)(ImLX2)接種的安全性試驗，同時設(shè)不進行接種 的豬10頭作為空白對照，同樣條件下飼養(yǎng)。每次接種后觀察14日。應(yīng)不出現(xiàn)由疫苗引起 的任何局部和全身不良反應(yīng)。④效力檢驗選取3-4周齡PCV2和Mhp抗原抗體陰性的健康仔豬10頭，其中5頭耳后根肌肉 注射疫苗1ml，免疫后15天，所有豬肌肉注射PCV2和Mhp菌毒培養(yǎng)液(PCV2病毒含量為 105 0TCID50/mL, Mhp菌株滴度為108 (lCCU/mL) 3mL，其中對照豬分別肌肉注射PCV2強毒(5 頭)和Mhp強毒(5頭)，每天測溫觀察并隔周采集血清進行血清學(xué)檢測，攻毒后21天迫殺 解剖。攻擊PCV2強毒的對照豬(》3/5)在攻毒后應(yīng)出現(xiàn)明顯的PCV2病毒血癥和一過性的 體溫升高，且攻毒后21天迫殺解剖可見多種淋巴組織出現(xiàn)不同程度的腫大和充血，肺出現(xiàn) 不同程度的水腫和肉變，腎發(fā)黃表面有壞死灶等。免疫豬(》4/5)免疫后15天PCV2ELISA 抗體滴度應(yīng)> 1 1000，攻毒后應(yīng)無明顯臨床癥狀、PCV2病毒血癥及病理變化。攻擊Mhp 強毒的對照豬(>3/5)在攻擊強毒后應(yīng)該出現(xiàn)明顯的Mhp臨床癥狀，并且于21日迫殺解 剖可見肺部出現(xiàn)明顯的肉樣病變。免疫豬(》4/5)免疫后15天的MhpELISA抗體滴度應(yīng) ^ 1 1000，攻毒后應(yīng)無明顯臨床癥狀及病理變化。表1本發(fā)明疫苗免疫后PCV2和Mhp ELISA抗體檢測結(jié)果
權(quán)利要求
1.豬圓環(huán)病毒II型(PCV2)-豬肺炎支原體(Mhp)表達菌株的構(gòu)建方法，其特征在于步 驟如下(DPCV2CAP基因和Mhp Rl基因的擴增及克隆分別以PCV2和Mhp毒株提取的DNA為模板，用特異性引物，PCR擴增，得PCV2的CAP 蛋白的核酸片段及豬肺炎支原體的主要抗原決定區(qū)Rl的核酸片段，其大小分別為718bp和 M6bp，然后將得到的克隆片段CAP及Rl分別克隆到克隆載體pMD-18-T上，得到克隆載體 pMD-18-T-CAP 和 pMD-18-T-Rl ；(2)含有PCV2CAP基因和MhpRl基因的原核表達載體的構(gòu)建通過限制性內(nèi)切酶將克隆片段CAP及Rl分別連接到原核表達載體pET48a(+)中，得 到原核表達質(zhì)粒pET48a(+)-Rl-CAP ；(3)含有原核表達質(zhì)粒pET18a(+)-Rl-CAP的表達菌株的獲得通過轉(zhuǎn)化的方法將原核表達質(zhì)粒pET18a(+)-Rl-CAP通過熱擊轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化到大腸 桿菌感受態(tài)細胞BL21(DE3)中，然后通過卡那霉素抗性篩選的方法得到陽性克隆菌株，后 小量提取質(zhì)粒進行雙酶切鑒定，最后進行測序鑒定，得到陽性原核表達菌株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬圓環(huán)病毒II型(PCV2)-豬肺炎支原體(Mhp)表達菌株的 構(gòu)建方法，其特征在于PCR擴增中用的PCV2和Mhpl的特異性引物，其序列分別如下CAP-Pl 5 iAAGCTTGCATGACGTATCCAAGGAG’ 3CAP-P2 5 iGTGCGGCCGCAGGGTTAAGTGGGGG， 3Rl-Pl 5 ‘GCGGATCCGCAGCAAAACCAGAAGC‘ 3R1-P2 5 ‘GCAAGCTTGAGCAACTGGTTTTGCT， 3。
3.如權(quán)1或2所述的豬圓環(huán)病毒II型(PCV2)-豬肺炎支原體(Mhp)表達菌株的構(gòu)建 方法所得到的表達菌株。
4.如權(quán)3所述的豬圓環(huán)病毒II型(PCV2)-豬肺炎支原體(Mhp)表達菌株的構(gòu)建方法 所得到的表達菌株在制備疫苗中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及豬圓環(huán)病毒II型-豬肺炎支原體表達菌株的構(gòu)建及應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明方法構(gòu)建的表達豬圓環(huán)病毒II型-豬肺炎支原體主要抗原蛋白的原核表達工程菌株，該菌株能夠同時表達豬肺炎支原體的主要抗原蛋白R1蛋白及豬圓環(huán)病毒的主要抗原蛋白CAP蛋白，純化得到的重組蛋白能夠刺激機體產(chǎn)生抵抗豬圓環(huán)病毒II型及豬肺炎支原體攻擊的保護性免疫反應(yīng)，能夠有效的防止豬圓環(huán)病毒及豬肺炎支原體的感染。
文檔編號C12R1/19GK102080074SQ20101056309
公開日2011年6月1日 申請日期2010年11月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月29日
發(fā)明者盧會英, 杜金玲, 趙亞榮 申請人:北京大北農(nóng)科技集團股份有限公司