專利名稱：牛肺炎支原體的診斷試劑及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及動(dòng)物診斷醫(yī)學(xué)，特別涉及牛肺炎支原體的診斷技術(shù)。
背景技術(shù)：
牛肺炎支原體(Mycoplasma bovis, MB)屬于原核生物界,厚壁菌門，柔膜體綱,支原體目，支原體科，支原體屬，是目前發(fā)現(xiàn)最小和最簡單的能自主復(fù)制的原核生物。60年代首次有報(bào)道稱牛肺炎支原體引起牛發(fā)生肺炎和乳腺炎，在這之后人們發(fā)現(xiàn)MB還可導(dǎo)致牛發(fā)生關(guān)節(jié)炎、角膜炎、耳炎、生殖道炎癥、流產(chǎn)等多種疾病。國外報(bào)道每年由牛呼吸道疾病引起的經(jīng)濟(jì)損失其中至少四分之一是由牛肺炎支原體引起，特別是在牛運(yùn)輸環(huán)節(jié)，全群發(fā)病率高達(dá)90%以上，持續(xù)時(shí)間長達(dá)三個(gè)月以上，嚴(yán)重影響牛的生長發(fā)育。目前，牛肺炎支原體疫苗并未得到推廣的情況下，早診斷早隔離是控制牛肺炎支原體群體感染的有效措施。因此，對牛肺炎支原體有效的診斷方法將直接影響到養(yǎng)牛業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。常見的牛肺炎支原體的臨床檢測方法:生物學(xué)檢測、免疫學(xué)檢測、以及分子生物學(xué)檢測。牛肺炎支原體在機(jī)體內(nèi)兼性厭氧、對營養(yǎng)要求極其嚴(yán)格，培養(yǎng)時(shí)須從體外攝取如膽固醇、脂肪酸、核糖前體、維生素等大分子物質(zhì)，若病料保存不當(dāng)則實(shí)驗(yàn)室常規(guī)分離鑒定十分困難，故實(shí)驗(yàn)室生物學(xué)檢測的方法臨床并不適用。分子生物學(xué)檢測操作復(fù)雜繁瑣，對儀器設(shè)備、實(shí)驗(yàn)室條件、以及實(shí)驗(yàn)人員的技術(shù)要求高，檢測成本亦相應(yīng)增加，也難以在基層和養(yǎng)殖場大規(guī)模開展。所以，免疫學(xué)檢測抗牛肺炎支原體抗體是目前診斷牛肺炎支原體感染的主要措施。免疫學(xué)方法檢測抗體最常見的檢測模式是間接酶聯(lián)免疫分析(ELISA)。而決定間接ELISA是否有效的關(guān)鍵在于抗原的選擇。間接ELISA檢測病原體抗體所用的抗原按照其來源和性質(zhì)可分為三類:全毒、重組表達(dá)蛋白、合成肽，合成肽的制備成本較高，所以不適合大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用，因此間接ELISA檢測抗體所用的抗原主要是全毒和基因重組表達(dá)的病原體蛋白。但以全毒作為包被抗原同時(shí)也具有培養(yǎng)條件要求高、有散毒隱患、批間差異大、具有一定的非特異性反應(yīng)的缺點(diǎn)，尤其是對于牛肺炎支原體，難以控制的體外培養(yǎng)條件限制了全毒作為捕獲抗原的應(yīng)用。重組表達(dá)蛋白作為捕獲抗原的優(yōu)點(diǎn)在于目的蛋白的反應(yīng)特異性高，且一旦技術(shù)路線成熟，可大量穩(wěn)定的制備，成本低，適合工業(yè)化生產(chǎn)的應(yīng)用。目前已經(jīng)商品化的牛肺炎支原體抗體檢測試劑盒或已經(jīng)報(bào)道的牛肺炎支原體抗體檢測方法均為利用基因重組技術(shù)制
備的病原體蛋白，主要分為兩類-膜黏附蛋白(Variable surface Lipoprotein,VSP)和
月吳蛋白。傳統(tǒng)的重組表達(dá)蛋白的技術(shù)路線都是針對某一種蛋白，其往往選擇經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證免疫原性強(qiáng)、抗體應(yīng)答持續(xù)時(shí)間長、且不同亞型之間相對保守的蛋白作為標(biāo)靶。但即便如此，理論上仍舊只能捕獲和檢測針對一種病毒蛋白的抗體。所以采用不同的蛋白作為標(biāo)靶，檢測結(jié)果就有可能不 一致，包括陽性程度(即抗體滴度)、甚至是漏檢(假陰性)。對于牛肺炎支原體而言，一個(gè)更為突出的問題是由于牛肺炎支原體的基礎(chǔ)研究相對滯后，目前尚未能明確該病原體感染后誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體的優(yōu)勢和保守抗原一即迅速誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體而且抗體產(chǎn)生的持續(xù)時(shí)間長，感染過程中抗原也不容易發(fā)生變異。例如，目前已有報(bào)道的VSP雖然具有很強(qiáng)的免疫原性，但卻容易出現(xiàn)變異而影響檢測的準(zhǔn)確性。所以，采用傳統(tǒng)的技術(shù)路線制備某一種特定的病原體蛋白作為捕獲抗原，其檢測結(jié)果就很有可能不能準(zhǔn)確反映病原體真實(shí)的感染情況。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明提供一種重組表達(dá)蛋白，其為多表位抗原，其能特異性捕獲牛肺炎支原體抗體。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為:多表位融合抗原，所述多表位融合抗原的氨基酸序列含有如SEQ ID NO:1所不,或所述多表位融合抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所不。本發(fā)明所設(shè)計(jì)的多表位融合抗原，基于已有的牛肺炎支原體全基因組研究為基礎(chǔ)，進(jìn)行了充分的生物信息學(xué)分析，尋找到了一種可用于檢測牛肺炎支原體抗體的牛肺炎支原體假定膜蛋白P33，截取其特異且保守部位的氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示。SEQID NO:1所示氨基酸的進(jìn)一步縮寫如下:“EAKSDNKMEKDIKINENTDEKNSSETMNNKQKQDKSSIDSKMEEKADNK TEKDIKINENTDEKNSSETMNNKQKQDKSSIDSKMEEKADNKTEKDIKINEN TDEKNSSETMNNKQKQDKSSIESKMKEKTEKQDSKTNSEKQDSETDDSSNEL TIPSESTPKDMPTEN”在此基礎(chǔ)上，結(jié)合已探明的牛肺炎支原體膜蛋白P30，設(shè)計(jì)了一種融合了不同牛肺炎支原體蛋白B細(xì)胞表位的抗原——即多表位融合抗原的重組蛋白，該蛋白的氨基酸序列如 SEQ ID NO:2 所示。SEQ ID NO:2所示氨基酸的進(jìn)一步縮寫如下:“EAKSDNKMEKDIKINENTDEKNSSETMNNKQKQDKSSIDSKMEEKA DNKTEKDIKINENTDEKNSSETMNNKQKQDKSSIDSKMEEKADNKTEKDIKIN ENTDEKNSSETMNNKQKQDKSSIESKMKEKTEKQDSKTNSEKQDSETDDSSN ELTIPSESTPKDMPTENGPGPGNDKKEEKKKVEEPAKQAEGAGTCDKTTSASG TANSNGASSNSTNAQKTDEKEIKETSDSPKKDGEKVSDKHKVAGPGPGKDIK DEDLIPPKTGNNKQVFFDTRDOTTKLSGKFKGKLPWGPGPGPIHKNRKGKIK ASGFVNVEKE⑶KLKIKFRFFKYNKGASP”。其中，如SEQ ID NO:1所示的肽段A是如SEQ ID NO:2所示的肽段B的截短片段。經(jīng)抗原特異性分析證實(shí)，如SEQ ID NO:1所示的肽段A為牛肺炎支原體抗體的特異性抗原，分析結(jié)果詳見圖1。多表位融合抗原首先建立在對牛肺炎支原體全集因組序列進(jìn)行充分分析的基礎(chǔ)上，針對P33和P30基因進(jìn)行與其他支原體特異性的驗(yàn)證；對牛肺炎支原體P33和P30進(jìn)行基因優(yōu)化和重組表達(dá)，并驗(yàn)證兩個(gè)重組蛋白的免疫原性。其次根據(jù)P33和P30氨基酸序列分析結(jié)果，建立多表位融合抗原蛋白的氨基酸一級結(jié)構(gòu)。

本發(fā)明的目的之二在于提供兩種種多表位融合抗原蛋白的應(yīng)用，該應(yīng)用為診斷牛肺炎支原體技術(shù)提供了新思路。同時(shí)，根據(jù)該應(yīng)用，制備了牛肺炎支原體診斷試劑，其具有較高的特異性和敏感性。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為:
所述的多表位融合抗原在制備牛肺炎支原體診斷試劑中的應(yīng)用。進(jìn)一步，牛肺炎支原體診斷試劑，所述牛肺炎支原體診斷試劑為牛肺炎支原體抗體的特異性抗原，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1-2任一所示。所述的多表位融合抗原和辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗牛的IgG聯(lián)合在檢測牛肺炎支原體抗體中的應(yīng)用。該聯(lián)合運(yùn)用被證實(shí)是最佳的抗體配對。牛肺炎支原體診斷試劑是通過如下思路制備的:確定多表位融合抗原蛋白的氨基酸序列基礎(chǔ)上，反向?qū)⑵浞g成核苷酸序列，人工合成所需基因片段并測序驗(yàn)證，克隆后通過雙酶切與表達(dá)載體pET-28a連接，轉(zhuǎn)染至BL21 (DE3) codon plus,通過卡那抗性篩選、發(fā)酵、IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，獲得目的抗原。該抗原為胞內(nèi)表達(dá)，超聲破菌后收集菌液，依次通過鎳金屬螯合層析、Q-HP層析、重復(fù)鎳金屬螯合層析得到電泳純的抗原。以純化的抗原作為捕獲抗原進(jìn)行包被酶標(biāo)板，檢測牛肺炎支原體抗體陽性樣本，同時(shí)設(shè)置不包被該抗原的對照，以此驗(yàn)證該抗原蛋白的敏感性和特異性。更多信息參見分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版，J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，科學(xué)出版社，2002年)。本發(fā)明的目的之三在于提供一種診斷試劑盒，其能準(zhǔn)確的檢測牛肺炎支原體抗體。含有所述的牛肺炎支原體診斷試劑的試劑盒，所述試劑盒為ELISA試劑盒，包括包被有包被抗原的固相載體，酶標(biāo)二抗和顯色底物，所述包被抗原的氨基酸序列如SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2所示。該試劑盒是基于間接ELISA法的原理設(shè)計(jì)的。其中，所述的牛肺炎支原體診斷試劑的試劑盒中的所述酶標(biāo)二抗為辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、葡萄糖氧化物酶或半乳糖苷酶標(biāo)記的標(biāo)記的抗牛IgG。其中，所述的 牛肺炎支原體診斷試劑的試劑盒中所述酶標(biāo)二抗優(yōu)選為辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗牛的IgG。本發(fā)明的目的之四在于提供一種牛肺炎支原體抗體的檢測方法，該方法為判斷涉及畜牧牛來源的食品的安全提供了檢測保障技術(shù)。運(yùn)用所述的試劑盒檢測牛肺炎支原體抗體的方法，具體包括以下步驟:A固相載體的包被將所述包被抗原用包被抗原稀釋液稀釋后，包被于固定載體上，在固相載體上添加待測樣品孵育，再加入所述酶標(biāo)二抗孵育，加入顯色底物反應(yīng)充分后，用所述終止液終止反應(yīng);B讀取數(shù)據(jù)用儀器分別讀取待測樣品組和標(biāo)準(zhǔn)樣品組的數(shù)值，通過與已知含量的標(biāo)準(zhǔn)樣品或陰性對照品比較，求得待測樣品的牛肺炎支原體抗體含量或判定待測樣品是否為陽性。對于結(jié)果是否屬于正?；蚍钦５呐卸?biāo)準(zhǔn)，可以采用一切可實(shí)現(xiàn)的定性或定量方法。優(yōu)選的所述的方法中，所述步驟A中，所述包被抗原純度以質(zhì)量計(jì)算為95%時(shí)，所述包被抗原被稀釋成濃度為1-10 μ g/ml，酶標(biāo)二抗為稀釋濃度以體積計(jì)為1: 2000-3000的辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗牛的IgG，所述顯色底物為辣根過氧化物酶的顯色底物。HRP標(biāo)記的羊抗牛IgG干粉購自美國KPL公司(貨號14-12-06)，按照附帶的說明書所述的步驟重懸成貯存液后，以沖洗緩沖液稀釋2000-3000倍。在上述稀釋配比下，檢測結(jié)果最佳。例如，待測樣品為牛奶，用酶標(biāo)儀在450nm波長下讀取待測樣品數(shù)據(jù)，在實(shí)驗(yàn)有效的前提下，IRPC ^ 20為陽性樣本，反之為陰性樣本。另外，待測樣品可以為血清、尿液等體液。本發(fā)明的有益效果:1)同生物學(xué)檢測、以及分子生物學(xué)檢測相比較，本方法操作簡便，無需依靠復(fù)雜的儀器設(shè)備，對實(shí)驗(yàn)室條件、以及實(shí)驗(yàn)人員的技術(shù)要求不高，檢測成本相對較低，適合于基層和養(yǎng)殖場大規(guī)模開展。2)在抗原的種類選擇方面，同合成肽相比,本多表位融合抗原制作成本低，適合大規(guī)模應(yīng)用；同全毒相比，在保證靈敏度的前提下特異性高，批間差異小，也不像全度一樣需要要求較高的培養(yǎng)條件。3)本多表位融合抗原適合作為血清學(xué)的檢測重組抗原。4)采用多表位作為標(biāo)靶，其檢測結(jié)果一致性高。


下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述。圖1為SEQ ID NO:1氨基酸序列抗原特異性分析圖。圖2為牛肺炎支原體P33蛋白氨基酸序列抗原特異性分析圖。圖3為牛肺炎支原體P30蛋白氨基酸序列抗原特異性分析圖。圖4 為 BamHI/Not I 酶切質(zhì)粒 pMD18_T_P33。圖5 為 BamHI/Xho I 酶切質(zhì)粒 pMD18-T_P30。圖6為P33蛋白在BL21 (DE3)菌中28°C表達(dá)SDS-PAGE電泳圖；其中，M =ProteinRuler II ；Lane1:未加入 IPTG ；Lane2:加入 IPTG 誘導(dǎo) 5h。圖7為P30蛋白在BL21 (DE3)菌中28°C表達(dá)SDS-PAGE電泳圖；其中，M =ProteinRuler II ；Lane1:加入 IPTG 誘導(dǎo) 5h ；Lane2:未加入 IPTG0圖 8 為 MbP33 蛋白 Western-Blotting 圖；其中 M:EasySee Western Marker ；Lanel:未加入 IPTG BL21 (DE3) pET_28a_P33 菌體蛋；Lane2:加入 IPTG 誘導(dǎo) 5h 后的BL21(DE3)菌體蛋白。圖 9 為 MbP30 蛋白 Western-Blotting 圖，M:EasySee Western Markek ； Lane I:pET-28a-P30 融合蛋白質(zhì)(27kDa+20kDa) ；Lane2:未加 IPTG 誘導(dǎo)的 TransSetta 菌蛋白。圖10為多表位融合蛋白P39經(jīng)N1-Sephorse.6F.F純化后SDS-PAGE電泳結(jié)果。圖11為多表位融合蛋白P39經(jīng)Q-HP陰離子層析圖譜。圖12為多表位融合蛋白P39經(jīng)Q-HP陰離子層析SDS-PAGE電泳結(jié)果。圖13為多表位融合蛋白P39經(jīng)凝膠層析結(jié)果。圖14為多表位融合蛋白P39經(jīng)鎳金屬螯合層析結(jié)果。圖15為終純化后PAGE電泳結(jié)果。
具體實(shí)施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面對本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。以下將參照附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)描述。優(yōu)選實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版，J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，科學(xué)出版社，2002年)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件進(jìn)行。氨基酸的縮寫如下:
甘氨酸gly G ;絲氨酸Ser S ;丙氨酸ala A ;蘇氨酸t(yī)hr T ;繳氨酸val V ;異亮氨酸ile I ;亮氨酸leu L ;酪氨酸t(yī)yr Y;苯丙氨酸phe F ;組氨酸his H ;脯氨酸pro P ;天冬氨酸asp D ;甲硫氨酸met M ;谷氨酸glu E ;色氨酸t(yī)rp W ;賴氨酸Iys K ;半胱氨酸cysC ;精氨酸arg R牛肺炎支原體73個(gè)膜蛋白和36個(gè)分泌蛋白中，其中，致病相關(guān)蛋白P33和特異性膜蛋白P30，其除了某些稀有密碼子，兩段基因還含有編碼色氨酸的TGA密碼子，TGA在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中是終止子，本設(shè)計(jì)將兩個(gè)蛋白的基因組序列進(jìn)行重新優(yōu)化，再利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)對兩個(gè)蛋白片段基因進(jìn)行了原核表達(dá)。利用western-blotting確定了兩個(gè)蛋白的抗原免疫特性，將兩段蛋白基因糅合為一個(gè)能容易大量制備、質(zhì)量控制可靠、無散毒風(fēng)險(xiǎn)的重組蛋白，該重組蛋白能夠捕獲針對MB膜蛋白和致病蛋白抗原的抗體，以檢測出感染早期以及應(yīng)答持續(xù)時(shí)間長的抗體，從而避免漏檢，提高血清抗體和牛奶檢測的準(zhǔn)確性。本專利中所涉及的氨基酸序列，均是以從氮端到碳端的順序書寫。實(shí)施例1多表位融合抗原一牛肺炎支原體致病相關(guān)蛋白P33和特異性膜蛋白P30基因載體的構(gòu)建lpMD18-T-P33 和 pMDl8_T-P30 構(gòu)建P33基因片段全長903bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3，其中有含有5個(gè)編碼色氨酸的TGA密碼子，P33的B細(xì)胞表位分析見圖2 ；SEQ ID N0.3:“ggatccatattattgacaacactatcgccaattatctcattgccatttttatctgctagttg catcaccgaagcaaaatcagat aacaaaatggaaaaagatattaagataaacgaaaatacagatgaaa aaaattcttctgaaacaatgaataacaaacaaaaacaagataaaagcagtatagattcaaagatggaa gaaaaagcagataacaaaacggaaaaagatattaagataaacgaaaatacagatgaaaaaaattcttc tgaaacaatgaataacaaacaaaaacaagataaaagcagtatagattcaaagatggaagaaaaagcag ataacaaaacggaaaaagatattaagataaacgaaaatacagatgaaaaaaattcttctgaaacaatg aataacaaacaaaaacaagataaaagcagtatagaatcgaaaatgaaagaaaaaacagaaaagcaaga ttcaaaaactaactcagaaaaacaagattcagaaactgatgacagtagtaatgaattaacaataccta gtgaaagcacaccaaaagatatgccaacagaaaattctgaaataaacgactatttagacaaagttaag gaatacggaaaagaagcatcagaattttatgaattactttctaaattatttaaaacaaagtataaaga taaaataattcaaaaaattggtaagtttgagaaaataatcaaagaattttctaaattatatgagggaa caaagaacaacttagaccaaattattgaaggatttaaagaacctgattttaagaaagcattattagaa cttttgaatagttacaaagaatctagagaagaaataaaaaatgcaattaaagaattaaaagaaattgaaaatgaaagtagattttaactcgag，，。P30基因片段全長738bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，其中有含有I個(gè)編碼色氨酸的TGA密碼子，P30的B細(xì)胞表位分析見圖3 ；SEQ ID N0.4:“ggatccatgtttaagaggaatccaaaatttatgaaacacaaactattattaagtttaggaactgtattaactgcta ctttttcttttcctttaattgctgctaaatgtgatggcaatgacaagaaggaagaaaagaaaaaagttgaagaacctgcaaa acaagctgaaggagctggaacaggtgataaaacaacctctgcaagtggaactgctaattctaatggcgcaagttctaat agtactaatgcacaaaaaacagatgaaaaagaaataaaagaaacttccgattcacctaaaaaagatggagaaaaggttt cagataaacataaagtagcttacaaggatattgattttgatttttctaagattaaaatcgtaattagtaaaaaagacatcaag gatgaagacttaattccgcctaaaacaggcaataataagcaagttttctttgatactcgtgatggagatacaaagttaagc ggaaagttcaagggaaaattaccttgaaaaggtgttgaaattggaactgttactggtctaccagacggatattcaattgct agtgttgagaatccaatccacaaaaacagaaaaggcaaaattaaagctagtggatttgtcaatgttgaaaaagaaggag acaaactaaaaattaagtttagattctttaagtacaacaaaggagcaagcccaacagtttcaacaaaggtttacgaagca attatttcttagctcgag，，。本發(fā)明中的核苷酸序列均按照從5’端到3’端的順序進(jìn)行書寫。重組質(zhì)粒及表達(dá)將P33和P30的稀有密碼子進(jìn)行優(yōu)化，人工合成兩段基因組序列分別連入PMD18-T載體，形成pMD18-T-P33和pMD18-T_P30。P33和P30密碼子優(yōu)化后的序列，為 SEQ ID N0.5 和 SEQ ID N0.6。SEQ ID N0.5:tagaactcggtacgcgcggatcttccagagattggatccatcctgctgaccaccctgtctccgatcatctctctgcc gttcctgtctgcttcttgcatcaccgaagctaaatctgacaacaaaatggaaaaagacatcaaaatcaacgaaaacaccga cgaaaaaaactcttctgaaaccatgaacaacaaacagaaacaggacaaatcttctatcgactctaaaatggaagaaaaag ctgacaacaaaaccgaaaaagacatcaaaatcaacgaaaacaccgacgaaaaaaactcttctgaaaccatgaacaaca aacagaaacaggacaaatcttctatcgactctaaaatggaagaaaaagctgacaacaaaaccgaaaaagacatcaaaat caacgaaaacaccgacgaaaaaaactcttctgaaaccatgaacaacaaacagaaacaggacaaatcttctatcgaatcta aaatgaaagaaaaaaccgaaaaacaggactctaaaaccaactctgaaaaacaggactctgaaaccgacgactcttctaa cgaactgaccatcccgtctgaatctaccccgaaagacatgccgaccgaaaactctgaaatcaacgactacctggacaaa gttaaagaatacggtaaagaagcttctgaattctacgaactgctgtctaaactgttcaaaaccaaatacaaagacaaaatca tccagaaaatcggtaaattcgaaaaaatcatcaaagaattctctaaactgtacgaaggtaccaaaaacaacctggaccag atcatcgaaggtttcaaagaaccggacttcaaaaaagctctgctggaactgctgaactcttacaaagaatctcgtgaagaa atcaaaaacgctatcaaagaactgaaagaaatcgaaaacgaatctcgtttctaactcgagaatcgtcgaacggcaggcgt gcaaacttSEQ ID N0.6: tagaactcggtacgcgcggatcttccagagattggatccatgttcaaacgtaacccgaaattcatgaaacacaaa ctgctgctgtctctgggtaccgttctgaccgctaccttctctttcccgctgatcgctgctaaatgcgacggtaacgacaaaaa agaagaaaagaaaaaagttgaagaaccggctaaacaggctgaaggtgctggtaccggtgacaaaaccacctctgcttct ggtaccgctaactctaacggtgcttcttctaactctaccaacgctcagaaaaccgacgaaaaagaaatcaaagaaacctct gactctccgaaaaaagacggtgaaaaagtttctgacaaacacaaagttgcttacaaagacatcgacttcgacttctctaaa atcaaaatcgttatctctaaaaaagacatcaaagacgaagacctgatcccgccgaaaaccggtaacaacaaacaggtttt cttcgacacccgtgacggtgacaccaaactgtctggtaaattcaaaggtaaactgccgtggaaaggtgttgaaatcggta ccgttaccggtctgccggacggttactctatcgcttctgttgaaaacccgatccacaaaaaccgtaaaggtaaaatcaaag cttctggtttcgttaacgttgaaaaagaaggtgacaaactgaaaatcaaattccgtttcttcaaatacaacaaaggtgcttctc cgaccgtttctaccaaagtttacgaagctatcatctcttaactcgagaatcgtcgaacggcaggcgtgcaaactt2P33和P30基因蛋白的原核表達(dá)利用限制性內(nèi)切酶BamH I和Xho I酶切pMD18_T_P33獲得目的片段(見圖4)，利用限制性內(nèi)切酶BamH I和Xho I酶切pMD18-T_P33獲得目的片段pMD18-T_P30獲得目的片段(見圖5)，分別連接pET-28a質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)Transl-Tl感受態(tài)細(xì)胞；挑陽性單克隆對其進(jìn)行LB培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)挑菌提取陽性質(zhì)粒；取I μ I質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Transetta (DE3)感受態(tài)細(xì)胞。挑若干個(gè)菌落至5ml LB (Kan+)培養(yǎng)基，培養(yǎng)至OD600 = 0.5 1，加入5 μ 10.5Μ IPTG，37°C誘導(dǎo)5h ;收集菌體,加入200μ I PBS垂懸,取50垂懸液加入10 μ 16 X protein loadingBuffer混勻，煮5minl4600rpm離心5min ;制備質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為12.5%的SDS PAGE膠，點(diǎn)樣品(上清5 μ I)跑電泳檢測，檢測結(jié)果見圖6、圖7。3Ρ33 和 Ρ30 蛋白的 western-blotting選出表達(dá)P33和P30的蛋白質(zhì)樣品，用12.5% SDS-PAGE膠進(jìn)行分離。轉(zhuǎn)膜:200mA轉(zhuǎn)2小時(shí)。封閉I小時(shí)。Ant1-mouse His標(biāo)簽一抗(按體積比1: 10000稀釋后)孵育I小時(shí)。TBST洗3次。Ant1-mouse 二抗(按體積比為1: 10000稀釋后)孵育lh。TBST洗I 次，TBS 洗 3 次。EasySee Western Blot kit 孵育 lmin,壓片，顯色見圖 8、圖 9。二、多表位融合蛋白P39的構(gòu)建1.根據(jù)P33和P30蛋白免疫分析最終確定的多表位融合抗原蛋白P39序列為SEQID N0.2。確定多表位融合抗原蛋白的氨基酸序列基礎(chǔ)上，反向?qū)⑵浞g成核苷酸序列，人工合成所需基因片段，片段克隆后通過雙酶切與表達(dá)載體pET-28a連接，轉(zhuǎn)染至BL21 (DE3)codonplus,通過卡那抗性篩選、發(fā)酵、IPTG誘導(dǎo)表達(dá),獲得目的抗原。重組菌種在自誘導(dǎo)培養(yǎng)基中37°C發(fā)酵并誘導(dǎo)表達(dá)18h后。2.重組牛肺炎支原體蛋白P39的純化超產(chǎn)破菌過濾后的上清用鎳金屬螯合層析柱N1-Sephorse.6F.F上柱，HisBinding buffer (20mmol/L sodium phosphate, 0.5M NaCl, PH7.4)平衡后用 His Elutionbuffer (20mmol/L sodium phosphate,0.5M NaCl，0.5M 咪唑 PH7.4) 15% B、20% B、30% B梯度及線性梯度洗脫，根據(jù)SDS-PAGE電泳結(jié)果收集目的蛋白洗脫峰，結(jié)果見圖10。收集含目的蛋白的洗脫峰，20mM Tris-HCl buffer (pH8.0)透析過夜,進(jìn)一步做陰離子純化，純化結(jié)果(見圖11、圖12)結(jié)果顯示:牛肺炎支原體融合蛋白經(jīng)Q-HP陰離子層析后，其純度到達(dá)95% (見圖13)，分子量約49KD。4°C冰箱放置兩天后意外發(fā)現(xiàn)融合蛋白標(biāo)簽自動(dòng)脫離，其脫離片段分子量大小與目的蛋白片段大小之和正好與融合蛋白大小相符，為39kDa，凝膠層析分離(見圖14)，再用鎳金屬螯合層析，其結(jié)果為標(biāo)簽蛋白與未脫離完全的融合蛋白正好被鎳金屬螯合，目的蛋白穿透鎳金屬螯合層析，結(jié)果見(圖15)。3.重組蛋白P39的定量用Lowry法對純化的重組蛋白P39進(jìn)行蛋白定量測定,獲得其蛋白量為0.4mg/ml。實(shí)施例2多表位融合抗原P39制備用于檢測牛肺炎支原體抗體的試劑盒一間接ELISA檢測試劑盒的組成1抗原包被板:1)包被:多表位融合抗原以50mM的碳酸鹽緩沖液(pH9.3)稀釋至5 μ g/mL,每孔加入100yL，4°C孵育過夜。 碳酸鹽緩沖液(5 X，pH9.3) IL組分用量及終濃度Na2C03 (MW105.99)分 7.949g (75mM)析純NaHC03 (MW84.01)分析 14.702g(175mM)
純超純水溶解，定容至1L，過濾除菌，2_8°C保存。使用前以超純水稀釋5倍。2)封閉:1%酪蛋白，300yL/孔，37°C孵育2h，密封2_8°C保存。2樣本稀釋液:0.5%酪蛋白，以PBS(1 X，pH7.4)配制。PBS的配制方法見《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第3版)下冊第1570頁。3陽性對照:原液來自于牛肺炎支原體攻毒樣本,經(jīng)biovet和bio-X兩個(gè)公司生產(chǎn)的牛肺炎支原體抗體檢測試劑盒檢測確認(rèn)牛肺炎支原體抗體陽性，檢測結(jié)果為“+++”。原液以樣本稀釋液(見上)稀釋至檢測OD在0.6以上。4陰性對照:原液來自于新生健康牛 ，經(jīng)上述兩種商品化抗體檢測產(chǎn)品檢測確認(rèn)為牛肺炎志遠(yuǎn)體抗體陰性。5沖洗緩沖液:PBS(見上)加入Tween-20至終濃度為0.05% -0.1% (體積百分比)，例如在 IL PBS 中加入 Tween-200.5mL_lmL。6酶標(biāo)抗體工作液:HRP標(biāo)記的羊抗牛IgG干粉購自美國KPL公司(貨號14-12-06)，按照附帶的說明書所述的步驟重懸成貯存液后，以沖洗緩沖液稀釋2000-3000倍。7終止液:2M H2SO4或者是I % SDS0如果用2M H2SO4終止顯色，酶標(biāo)儀以波長420-450nm檢測OD值；如果用I % SDS終止顯色，酶標(biāo)儀以波長620_650nm檢測OD值。二間接ELISA檢測步驟試劑盒采用酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測牛血清或血漿樣本中的牛肺炎支原體抗體(IgG)。其基本原理是將重組多表位融合抗原包被在酶標(biāo)板內(nèi)的固相表面；檢測時(shí)將待測樣本加入酶標(biāo)板孵育，樣本中針對牛肺炎支原體的特異性抗體與包被在固相表面的抗原特異結(jié)合，再通過沖洗步驟去除未結(jié)合在固相表面的其他成分；之后，加入酶標(biāo)抗體(辣根過氧化物酶偶聯(lián)的抗-牛IgG抗體)進(jìn)行孵育，使之與已經(jīng)吸附在固相表面上的?？贵w相結(jié)合，再通過沖洗步驟去除未結(jié)合在固相表面的酶標(biāo)抗體并加入辣根過氧化物酶的底物，底物在辣根過氧化物酶的催化下產(chǎn)生顯色反應(yīng)。顯色程度與待測樣本中抗牛肺炎支原體抗體的量成正比。具體操作步驟如下:所有試劑在使用前必須放置于室溫(18°C -25°C )平衡溫度，并且輕柔搖勻。操作部同樣品時(shí)必須更換槍頭。I抗原包被板、樣本稀釋液、陽性對照、陰性對照、緩沖液(IOX)平衡至室溫:將雙抗包被板、樣本稀釋液、陽性對照、陰性對照、緩沖液(IOX)從試劑盒中取出，于室溫放置30min。沖洗緩沖液(IOX)如出現(xiàn)沉淀，可將其置于37°C并不斷振搖至溶解后再使用。2準(zhǔn)備待測樣本:待測樣本(牛血清、血漿或牛奶)以樣本稀釋液稀釋40倍，以體積稀釋倍數(shù)計(jì)算。陰性對照和陽性對照不作稀釋。3將稀釋好的待測樣品加入至檢測管中，IOOul/管。加樣完畢后封膜封板，室溫孵化30min。吸取樣本，以沖洗液沖洗，300ul/管，重復(fù)5次。4加入酶標(biāo)抗體工作液，IOOul/管。加樣完畢后封膜封板，室溫孵化30min。吸除酶標(biāo)抗體工作液，以沖洗液沖洗，300ul/管，重復(fù)5次。5加入底物液，IOOul/管，室溫孵化lOmin。6加入終止液，50ul/管。
7將酶標(biāo)儀的檢波長設(shè)定在450nm，檢測各種樣本的吸光度，及A (450)值，計(jì)算及
結(jié)果判定。三間接ELISA試劑盒結(jié)果判定每次實(shí)驗(yàn)設(shè)置兩個(gè)陰性對照(NC1、NC2)和兩個(gè)陽性對照(PC1、PC2)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后首先計(jì)算兩個(gè)陰性對照的A(450)均值(NC)和兩個(gè)陽性對照的A(450)均值(PC)，然后計(jì)算待測樣本的IRPC值，初步確定本試驗(yàn)ELISA檢測結(jié)果的判定方法:DELISA檢測過程為用波長450nm檢測，計(jì)算兩個(gè)陰性對照A (450)的平均值:NC=(A (450)ncl+A(450)nc2)/2o2)計(jì)算兩個(gè)陽性對照 A(450)的平均值:PC = (A(450)pcl+A(450)pc2)/2。3)計(jì)算待測樣本的IRPC值:IRPC = (S-NC) / (PC-NC) *100其中S為待測 樣本的A(450)檢測值。陽性對照A(450)均值大于0.5 (即PC >
0.5)，陽性對照A(450)均值與陰性對照A(450)均值的比值大于4 (即PC/NC > 4)，判定實(shí)驗(yàn)有效，反之實(shí)驗(yàn)無效，需重復(fù)。在實(shí)驗(yàn)有效的前提下，待測樣本的IRPC > 20為陽性樣本，反之為陰性樣本。四試劑盒田間試驗(yàn)結(jié)果利用試劑盒對豐都某養(yǎng)殖場采集的臨床樣本進(jìn)行的田間試驗(yàn)，該結(jié)果與國外Biovet公司同類產(chǎn)品的比較，我們研制的產(chǎn)品臨床靈敏度達(dá)到90.98%，臨床特異性達(dá)到87.59%，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果見下表:
B"nttAi+
陽性陰性
所述檢測牛陽性12117J38
肺炎支原體
抗體的試劑12120132
舎
τπ合計(jì)133137270最后說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的宗旨和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。
權(quán)利要求
1.多表位融合抗原，其特征在于:所述多表位融合抗原的氨基酸序列含有如SEQIDNO:1所示,或所述多表位融合抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
2.權(quán)利要求1所述的多表位融合抗原在制備牛肺炎支原體診斷試劑中的應(yīng)用。
3.牛肺炎支原體診斷試劑，其特征在于:所述牛肺炎支原體診斷試劑為牛肺炎支原體抗體的特異性抗原，所述特異性抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO:1-2任一所示。
4.含有權(quán)利要求3所述的牛肺炎支原體診斷試劑的試劑盒，所述試劑盒為ELISA試劑盒，包括包被有包被抗原的固相載體，酶標(biāo)二抗和顯色底物，其特征在于:所述包被抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的牛肺炎支原體診斷試劑的試劑盒，其特征在于:所述酶標(biāo)二抗為辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、葡萄糖氧化物酶或β -半乳糖苷酶標(biāo)記的標(biāo)記的抗牛IgG0
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的牛肺炎支原體診斷試劑的試劑盒，其特征在于:所述酶標(biāo)二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗牛的IgG。
7.權(quán)利要求1所述的多表位融合抗原和辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗牛的IgG聯(lián)合在檢測牛肺炎支原體抗體中的應(yīng)用。
8.運(yùn)用權(quán)利要求4所述的試劑盒檢測牛肺炎支原體抗體的方法，其特征在于，具體包括以下步驟: A固相載體的包被 將所述包被抗原用包被抗原稀釋液稀釋后，包被于固定載體上，在固相載體上添加待測樣品孵育，再加入所述酶標(biāo)二抗孵育，加入顯色底物反應(yīng)充分后，用所述終止液終止反應(yīng)； B讀取數(shù)據(jù) 用儀器分別讀取待測樣品組和標(biāo)準(zhǔn)樣品組的數(shù)值，通過與已知含量的標(biāo)準(zhǔn)樣品或陰性對照品比較，求得待測樣品的牛肺炎支原體抗體含量，或判定待測樣品是否為陽性。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于:所述步驟A中，所述包被抗原純度為95%時(shí)，所述包被抗原被稀釋成濃度為1-10 μ g/ml，酶標(biāo)二抗為稀釋濃度以體積計(jì)為I: 2000-3000的 辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗牛的IgG，所述顯色底物為辣根過氧化物酶的顯色底物。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于:待測樣品為牛奶，用酶標(biāo)儀在450nm波長下讀取待測樣品數(shù)據(jù)，在實(shí)驗(yàn)有效的前提下，IRPC ^ 20為陽性樣本，反之為陰性樣本。
全文摘要
本發(fā)明涉及動(dòng)物診斷醫(yī)學(xué)，特別涉及牛肺炎支原體的診斷技術(shù)，具體為多表位融合抗原，含有如SEQ ID NO1所示，或氨基酸序列如SEQ ID NO2所示；其在制備牛肺炎支原體診斷試劑中的應(yīng)用；該診斷試劑可作為間接ELISA試劑盒的固相載體包被抗原，與之特異性抗體結(jié)合后，并加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)的抗-牛IgG抗體進(jìn)行孵育，產(chǎn)生顯色反應(yīng)，顯色程度與待測樣本中抗牛肺炎支原體抗體的量成正比；本方法操作簡便，無需依靠復(fù)雜的儀器設(shè)備，對實(shí)驗(yàn)室條件、以及實(shí)驗(yàn)人員的技術(shù)要求不高，檢測成本相對較低，適合于基層和養(yǎng)殖場大規(guī)模開展；本多表位融合抗原制作成本低，適合大規(guī)模應(yīng)用；靈敏度和特異性高，批間差異小，采用多表位作為標(biāo)靶，其檢測結(jié)果一致性高。
文檔編號G01N33/569GK103172752SQ20131007153
公開日2013年6月26日 申請日期2013年3月6日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月6日
發(fā)明者熊仲良, 曾政, 賀德華, 嚴(yán)俊, 藺露, 謝建華, 凌洪權(quán), 歐武海, 丁平 申請人:重慶市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心, 重慶業(yè)為基生物科技有限公司