一種豬支原體肺炎減毒活疫苗及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種豬支原體肺炎減毒活疫苗及其應(yīng)用，本發(fā)明篩選具有典型豬肺炎支原體感染同時(shí)無明顯其他病原感染的豬肺臟病料，利用乳兔肺繼代傳至100代，然后分離豬肺炎支原體菌株，利用培養(yǎng)基進(jìn)行連續(xù)傳代，同時(shí)通過多個菌株的篩選獲得豬肺炎支原體AN306，其保藏號為CCTCC?M2012431。本發(fā)明還涉及基于該弱毒株制備的豬支原體肺炎活疫苗制劑，包含活的弱毒株、藥學(xué)上可接受的載體或輔料，并可以包含佐劑，同時(shí)可以進(jìn)一步含有其他病原的免疫原。本發(fā)明的豬支原體肺炎活疫苗可通過多種途徑進(jìn)行免疫，該疫苗能使動物獲得抗豬肺炎支原體感染的保護(hù)能力。
【專利說明】一種豬支原體肺炎減毒活疫苗及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種豬支原體肺炎減毒疫苗株，含有該減毒株的活疫苗，及其在保護(hù)豬肺炎支原體感染相關(guān)疾病中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]豬支原體肺炎，俗稱豬氣喘病，是由豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)引起的一種豬的慢性呼吸道傳染性疾病，主要癥狀為咳嗽和氣喘。該病主要引起豬的飼料轉(zhuǎn)化率下降和生長受阻，發(fā)病率高、死亡率低。豬支原體肺炎在世界范圍內(nèi)廣泛流行，給現(xiàn)代養(yǎng)豬業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。
[0003]豬肺炎支原體常常與其他病原形成混合感染。例如與多殺性巴氏桿菌(Pasteurella Multocida)、豬鏈球菌(Streptococcus Suis, SS)、副豬嗜血桿菌(Haemophilus Parasuis of Swine, HPS)或豬胸膜肺炎放線桿菌(ActinobacillusPleuropneumonia of Porcine, APP)等混合感染，引發(fā)豬地方流行性肺炎。當(dāng)豬肺炎支原體與豬繁殖呼吸綜合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV)、豬圓環(huán)病毒 2 型(Porcine Circovirus Type2, PCV2)和 / 或豬流感病毒(SwineInfluenza Virus, SIV)混合感染時(shí)，就會發(fā)生常見的豬呼吸道疾病綜合征(PorcineRespiratory Disease Complex, PRDC),不僅可以引起豬的呼吸系統(tǒng)疾病，同時(shí)也會導(dǎo)致豬的繁殖能力下降。
[0004]豬支原體肺炎是一種頑固性慢性傳染病，藥物治療效果不夠理想，停藥后容易復(fù)發(fā)，該病一旦在豬場流行，就很難根除。因此，預(yù)防、控制和凈化豬支原體肺炎須采取早期診斷、及時(shí)隔離、抗生素治療或淘汰病豬、疫苗預(yù)防、全進(jìn)全出、嚴(yán)格消毒等綜合性措施，其中疫苗預(yù)防在控制豬支原體肺炎中起著關(guān)鍵性的作用。
[0005]盡管目前豬支原體肺炎滅活疫苗已經(jīng)在臨床上進(jìn)行了大規(guī)模的應(yīng)用，但是對該病的控制效果卻并不盡如人意，且通常情況下，滅活疫苗可以一定程度上降低患病豬肺臟的病變指數(shù)，但并不能有效降低患病豬的比例。豬支原體肺炎因此被認(rèn)為是流行范圍最廣、最難凈化的豬傳染病之一。這些疫苗效果不佳的原因可能與其滅活疫苗的本質(zhì)以及豬肺炎支原體感染的特性有關(guān)。
[0006]豬肺炎支原體通過呼吸道感染結(jié)合于支氣管纖毛上皮細(xì)胞上形成定殖，從而造成持續(xù)感染。滅活疫苗免疫后激發(fā)全身性免疫應(yīng)答，而誘發(fā)局部免疫應(yīng)答的效力不佳，其產(chǎn)生的循環(huán)抗體必須通過上皮屏障，分泌到氣管支氣管管腔，而該過程異常困難，而且效率低下。為了能夠達(dá)到有效免疫，疫苗必須能夠刺激高水平的系統(tǒng)免疫應(yīng)答。當(dāng)然，這需要相對較高的抗原劑量和較強(qiáng)的佐劑，這樣就使這些疫苗成本增加價(jià)格昂貴。同時(shí)，滅活疫苗產(chǎn)生的免疫應(yīng)答只能抑制野毒感染后的增殖和減輕組織破壞程度，并不能完全阻止野毒的感染，因而難以達(dá)到對該病的理想控制。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0007]本發(fā)明的目的在于提供一種豬支原體肺炎減毒活疫苗，該豬支原體肺炎減毒活疫苗可用于預(yù)防和控制豬肺炎支原體感染導(dǎo)致的疾病，包括其他病原菌與豬肺炎支原體共同感染導(dǎo)致的疾病。
[0008]豬支原體肺炎減毒活疫苗的作用機(jī)制不同于滅活疫苗，其接種后可在體內(nèi)增殖，有效激活機(jī)體免疫系統(tǒng)，同時(shí)活疫苗進(jìn)入呼吸系統(tǒng)后可定殖于支氣管纖毛細(xì)胞上，產(chǎn)生“占位效應(yīng)”，使得野毒無法定殖，從源頭上阻斷野毒的侵染過程，從而起到很好的抗感染作用。同時(shí)，由于活疫苗可以在體內(nèi)增殖，有效激活免疫系統(tǒng)，所需要的劑量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于滅活疫苗，因此在成本控制上較滅活疫苗有明顯優(yōu)勢，有利于節(jié)約社會資源。
[0009]活疫苗研制的關(guān)鍵在于高免疫原性菌株的獲得和致弱過程中使菌株毒力下降同時(shí)保持免疫原性的致弱技術(shù)。
[0010]本發(fā)明根據(jù)毒株的特點(diǎn)，使用前100代乳兔肺繼代，100代以后無細(xì)胞培養(yǎng)基繼代的致弱方法。該方法的優(yōu)點(diǎn)在于在前期傳代過程中采用動物體內(nèi)繼代，可以避免使用培養(yǎng)基體外繼代時(shí)容易導(dǎo)致菌株在早期過快致弱、不利于免疫原性維持的缺陷。后期采用無細(xì)胞培養(yǎng)基繼代，有利于一定程度上減少致弱代次，縮短致弱過程。
[0011]該毒株具體來源為:篩選具有典型豬肺炎支原體感染同時(shí)無明顯其他病原感染的豬肺臟病料，利用乳兔肺繼代傳至100代，然后分離豬肺炎支原體菌株，利用培養(yǎng)基進(jìn)行連續(xù)傳代，同時(shí)通過多個菌株的篩選獲得。篩選得到的毒株命名為豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae, Mhp)弱毒株AN306。該弱毒株經(jīng)過長期多次傳代致弱后，喪失致病力，對動物安全，并保留了良好的免疫原性，能為免疫動物提供免疫保護(hù)，防止豬肺炎支原體感染疾病的發(fā)生。經(jīng)過五代毒力返強(qiáng)試驗(yàn)證實(shí)弱毒株AN306不會回復(fù)突變成為有致病力的強(qiáng)毒株。因此，該弱毒株AN306可在制備豬支原體肺炎疫苗或多聯(lián)疫苗中應(yīng)用。
[0012]該豬肺炎支原體(Mycoplasmahyopneumoniae,Mhp)弱毒株已于 2012 年 10 月 25日，保藏于位于武漢市武昌珞珈山的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC M2012431。
·[0013]本發(fā)明的另一個目的在于公開該豬支原體肺炎減毒活疫苗，該減毒活疫苗可為豬支原體肺炎疫苗或多聯(lián)疫苗。包括上述豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae, Mhp)弱毒株AN306，以及藥學(xué)上可接受的載體或輔料。載體或輔料主要包括三類物質(zhì)，根據(jù)疫苗的具體使用狀態(tài)和免疫途徑而不同。一類為溶劑或緩沖體系，包括無菌生理鹽水、無菌磷酸鹽緩沖液；一類為凍干保護(hù)劑，包括脫脂奶粉、明膠、蔗糖，當(dāng)疫苗制備為凍干形式時(shí)需添加入凍干體系中幫助活疫苗維持活性；一類為噴霧保護(hù)劑，主要為甘油，當(dāng)活疫苗采用氣霧免疫時(shí)需加入幫助活疫苗在噴霧過程中維持活性。
[0014]同時(shí)本發(fā)明的豬支原體肺炎活疫苗制劑可進(jìn)一步含有一種免疫佐劑。
[0015]佐劑是疫苗制劑中的常見成分，用于增強(qiáng)疫苗本身的免疫刺激能力。本發(fā)明中使用的佐劑是適合于豬支原體肺炎活疫苗的佐劑，即對該活疫苗的活力不造成明顯損傷，同時(shí)適合豬支原體肺炎的免疫需求。
[0016]本發(fā)明所公開的免疫佐劑，可為單一佐劑成份或由多種佐劑成分復(fù)合而成，所含佐劑成份可包括中草藥多糖、卡波姆、殼聚糖、免疫刺激復(fù)合物基質(zhì)、左旋咪唑、葡聚糖、CpG、囊素中的一種或多種。各種免疫佐劑成分、配比和使用劑量因活疫苗具體使用的劑量及給藥途徑的不同而不同。
[0017]本發(fā)明的豬支原體肺炎活疫苗制劑中可進(jìn)一步含有至少一種其他病原的免疫原，形成聯(lián)苗進(jìn)行使用。其他的病原包括病毒、細(xì)菌、真菌、寄生蟲中的至少一種，例如豬圓環(huán)病毒、副豬嗜血桿菌、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬鼻支原體、豬滑液支原體、豬流感病毒等。這些病原在臨床上常與豬肺炎支原體在呼吸道中形成混合感染或繼發(fā)感染，相互促進(jìn)，導(dǎo)致病情加重，給豬群健康帶來重大威脅。因此將這些病原的疫苗與豬支原體肺炎活疫苗聯(lián)用，可用于預(yù)防豬肺炎支原體及其他病原的混合感染。所述其他病原的免疫原既可以為活菌或活毒形式，也可以為滅活形式、蛋白亞單位形式等。值得注意的是，其他病原疫苗所使用載體、輔料和佐劑必須與本豬支原體肺炎活疫苗使用的體系兼容，同時(shí)必須要能夠?yàn)楸净钜呙缢褪堋?br> [0018]本發(fā)明的豬支原體肺炎減毒活疫苗可通過多種途徑進(jìn)行免疫，包括肺內(nèi)注射、肌肉注射、氣霧免疫、口服免疫和滴鼻免疫。所述減毒活疫苗采用的制劑可為肺內(nèi)注射劑、肌肉注射劑、氣霧劑、口服劑或滴鼻劑。免疫途經(jīng)的選擇取決于將進(jìn)行免疫接種的動物、免疫接種史、豬場環(huán)境，以及給動物進(jìn)行疫苗接種人員的操作方便性。豬肺炎支原體感染機(jī)體后首先結(jié)合在肺部支氣管上皮纖毛細(xì)胞上，導(dǎo)致纖毛脫落，繼而進(jìn)一步侵染組織、誘發(fā)炎癥，同時(shí)為其他病原菌的感染打開門戶。豬支原體肺炎活疫苗采用肺內(nèi)注射途徑免疫時(shí)活疫苗能夠直接注射入靶組織，結(jié)合到纖毛細(xì)胞上，從而占據(jù)結(jié)合位點(diǎn)，阻止野毒的感染；當(dāng)豬支原體肺炎活疫苗采用氣霧途徑免疫時(shí)通過控制霧滴粒徑能夠使得活疫苗到達(dá)動物的下呼吸道內(nèi)，有效結(jié)合在支氣管纖毛細(xì)胞上，同時(shí)在封閉的畜棚或空間內(nèi)使用氣霧劑疫苗可以減少進(jìn)行免疫接種所需的人員；肌肉注射為動物免疫最常用的接種方式，操作簡便，可接受度高，當(dāng)豬支原體肺炎活疫苗采用肌肉注射途徑免疫時(shí)，能夠誘發(fā)動物產(chǎn)生全身性的細(xì)胞及體液免疫應(yīng)答，該應(yīng)答反應(yīng)到肺部靶組織局部，可抑制豬肺炎支原體野毒的侵染；當(dāng)豬支原體肺炎活疫苗采用口服或滴鼻方式接種時(shí)，可誘導(dǎo)腸道或鼻腔局部黏膜免疫應(yīng)答，通過共同黏膜免疫系統(tǒng)，淋巴細(xì)胞可歸巢到不同的黏膜部位，從而實(shí)現(xiàn)下呼吸道支氣管肺部組織的免疫應(yīng)答，實(shí)現(xiàn)對豬肺炎支原體野毒感染的保護(hù)。根據(jù)所使用的接種途徑，其所選用的免疫佐劑亦隨之發(fā)生變化。因此，本發(fā)明所述豬支原體肺炎減毒活疫苗可在防治豬肺炎支原體感染疾病中應(yīng)用。本發(fā)明豬支原體肺炎減毒活疫苗的制備方法是將豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumo niae,Mhp)弱毒株AN306與藥學(xué)上可接受的載體或輔料，以及至少一種免疫佐劑，至少一種其他病原的免疫原組合在一起。
[0019]本發(fā)明的豬支原體肺炎活疫苗可以采用單次免疫，亦可采用2次或多次重復(fù)接種來增強(qiáng)免疫應(yīng)答。根據(jù)免疫接種的途徑及動物狀況不同而具體選擇。單次免疫接種時(shí)間通常為3-10日齡,優(yōu)選為5-7日齡。2次或多次重復(fù)接種的首次免疫接種時(shí)間通常為3-10日齡，優(yōu)選為5-7日齡。兩次免疫接種之間的時(shí)間間隔一般為2-3周。
[0020]生物樣品保藏信息:
[0021]上述豬肺炎支原體弱毒株AN306，分類命名為:豬肺炎支原體AN306 (Mycoplasmahyopneumoniae AN306)已于2012年10月25日，保藏位于武漢市武昌珞珈山的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC NO:M2012431。
【具體實(shí)施方式】:
[0022]結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述和論證，但是本發(fā)明所包括的內(nèi)容并不局限于此。[0023]為了說明本發(fā)明的豬支原體肺炎活疫苗菌株的篩選、傳代、鑒定過程以及活疫苗菌株的免疫原性和安全性，同時(shí)驗(yàn)證本發(fā)明的豬支原體肺炎活疫苗制劑，包括采用多種不同免疫途徑、多種不同佐劑、添加其他不同病原免疫原的情況，能夠有效防止豬肺炎支原體的感染，控制豬支原體肺炎的發(fā)生，特做以下實(shí)驗(yàn)和制備。
[0024]實(shí)施例1:豬肺炎支原體AN306的獲得
[0025]強(qiáng)毒株的獲得:
[0026]1975年江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院根據(jù)農(nóng)業(yè)部要求集中了全國20多個省的農(nóng)業(yè)大學(xué)和國家、省級農(nóng)業(yè)科學(xué)院的豬支原體肺炎典型病料進(jìn)行豬肺炎支原體強(qiáng)毒致病株的篩選工作。共搜集全國各地的疑似豬支原體肺炎肺臟病料二百余份，從中篩選出具有典型豬肺炎支原體感染并無明顯其他病原感染的病料10份，作為豬支原體肺炎的強(qiáng)毒組織毒凍干保存。同時(shí)進(jìn)行本動物攻毒發(fā)病試驗(yàn)和連續(xù)傳代致弱試驗(yàn)。
[0027]將所選的10個強(qiáng)毒組織毒以滴鼻方式接種地方品種健康易感豬，攻毒后均可觀察到試驗(yàn)動物出現(xiàn)咳嗽、氣喘、消瘦、犬坐等豬支原體肺炎臨床癥狀，剖檢時(shí)其肺部尖葉、心葉可見典型蝦肉樣實(shí)變。根據(jù)動物攻毒發(fā)病潛伏期、臨床癥狀、發(fā)病比例、肺臟病變程度、血清凝集抗體效價(jià)，從10個強(qiáng)毒組織毒中挑選毒力最強(qiáng)、免疫原性最好的3個進(jìn)行傳代。
[0028]傳代致弱:
[0029]將強(qiáng)毒組織毒肺內(nèi)注射接種健康乳兔，采集攻毒兔肺臟，勻漿后再接種健康乳兔，如此繼代。上述3個強(qiáng)毒僅I株成功用兔體進(jìn)行傳代。該毒株在傳代時(shí)分別于20代、40代、60代、80代時(shí)各多分設(shè)一平行傳代組，連續(xù)傳代至100代。
[0030]采用“病肺塊浸泡法”從100代乳兔肺臟中分離豬肺炎支原體。具體方法為:動物放血致死，無菌操作采·集肺組織，剪下1/2芝麻大小的小塊，用Hank’s液洗滌浸泡于KM2培養(yǎng)液中，加入抗生素，置于37°C培養(yǎng)，每天觀察培養(yǎng)液的pH變化和混濁度。當(dāng)pH呈現(xiàn)明顯變化(降至7.0-6.8)且有均勻混濁(約48h)產(chǎn)生時(shí)，上述培養(yǎng)物以1:5接種量連續(xù)傳代4-5代后，再以1:10接種量繼代。按Gurr改良的姬姆薩染色法染色，油鏡鏡檢，所分離的微生物菌體呈多形態(tài)，具有豬肺炎支原體的典型形態(tài)特征。利用豬肺炎支原體標(biāo)準(zhǔn)陽性血清進(jìn)行微粒凝集反應(yīng)和代謝抑制試驗(yàn)，鑒定為豬肺炎支原體。將所分離獲得的豬肺炎支原體通過三次固體克隆純化并再次鑒定后凍干保存。
[0031]將凍干保存的FlOO代豬肺炎支原體菌株復(fù)蘇，利用KM2培養(yǎng)基按1:10繼續(xù)進(jìn)行連續(xù)傳代致弱。每五代采用PCR鑒定，每20代凍干保存。分別從FlOO、F140、F180、F220、F240、F280、F320代中另分一株同樣進(jìn)行傳代，傳至不同代次。
[0032]表1:致弱菌株的初步篩選
[0033]
【權(quán)利要求】
1.一種豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)弱毒株AN306,其保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC M2012431。
2.權(quán)利要求1所述豬肺炎支原體(Mycoplasmahyopneumoniae,Mhp)弱毒株AN306在防治豬肺炎支原體感染疾病中的應(yīng)用。
3.權(quán)利要求1所述豬肺炎支原體(Mycoplasmahyopneumoniae,Mhp)弱毒株AN306在制備豬支原體肺炎疫苗或多聯(lián)疫苗中的應(yīng)用。
4.一種豬支原體肺炎減毒活疫苗，其特征在于所述疫苗包括權(quán)利要求1所述豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae, Mhp)弱毒株 AN306。
5.如權(quán)利要求4所述豬支原體肺炎減毒活疫苗，其特征在于所述疫苗含有藥學(xué)上可接受的載體或輔料。
6.如權(quán)利要求4或5所述豬支原體肺炎減毒活疫苗，其特征在于所述疫苗含有至少一種免疫佐劑。
7.如權(quán)利要求4或5所述豬支原體肺炎減毒活疫苗，其特征在于所述疫苗含有至少一種其他病原的免疫原。
8.如權(quán)利要求7所述豬支原體肺炎減毒活疫苗，其特征在于所述其他病原包括病毒、細(xì)菌、真菌、寄生蟲中的至少一種。
9.如權(quán)利要求8所述豬支原體肺炎減毒活疫苗，其特征在于所述其他病原為豬圓環(huán)病毒、副豬嗜血桿菌、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬鼻支原體、豬滑液支原體、豬流感病毒。
10.如權(quán)利要求4-9中的任一權(quán)利要求所述豬支原體肺炎減毒活疫苗，其特征在于所述疫苗采用的制劑為肺內(nèi)注射劑、肌肉注射劑、氣霧劑、口服劑或滴鼻劑。
11.一種制備豬支原體肺炎減毒活疫苗的方法，其特征在于，將權(quán)利要求1所述的豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)弱毒株AN306與藥學(xué)上可接受的載體或輔料，以及至少一種免疫佐劑，至少一種其他病原的免疫原組合在一起。
12.權(quán)利要求4-9中的任一權(quán)利要求所述疫苗在防治豬肺炎支原體感染疾病的中的應(yīng)用。
13.如權(quán)利要求12所述的應(yīng)用，所述豬肺炎支原體感染相關(guān)疾病包括豬肺炎支原體單獨(dú)感染及與其他病原混合感染所導(dǎo)致的豬支原體肺炎疾病。
【文檔編號】C12R1/35GK103740625SQ201410038836
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2014年1月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月26日
【發(fā)明者】邵國青, 熊祺琰, 劉茂軍, 馮志新, 韋艷娜, 王海燕, 白方方, 甘源, 王麗, 張道華, 劉冬霞, 華利忠, 武昱孜, 白昀, 王占偉 申請人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院