專利名稱：Sars冠狀病毒刺突糖蛋白的可溶性片段的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總的來(lái)說(shuō)涉及到與嚴(yán)重急性呼吸道綜合征(SARS)病原學(xué)相關(guān)聯(lián)的冠狀病毒(這里為SARS-CoV)所編碼的刺突糖蛋白。本發(fā)明進(jìn)一步涉及到具有與SARS-CoV的刺突糖蛋白片段一致的氨基酸序列的多肽、核酸和它們的保守性變異體。本發(fā)明也涉及到用這些核酸、多肽、變異體和片段產(chǎn)生識(shí)別SARS-CoV刺突糖蛋白的抗體，并用其生產(chǎn)抗SARS-CoV的疫苗。發(fā)明的另一個(gè)方面涉及到抑致SARS-CoV與動(dòng)物細(xì)胞融合的刺突蛋白片段。
背景技術(shù)：
嚴(yán)重急性呼吸道綜合征(SARS)是一種最近在32個(gè)國(guó)家和地區(qū)的病人中確認(rèn)的感染性非典型性肺炎。病原不明的非典型性肺炎最早在中國(guó)的廣東省發(fā)現(xiàn)。隨后，香港、越南、新家坡、加拿大和北京相繼報(bào)告了這種在家庭成員和醫(yī)務(wù)工作者中傳播的嚴(yán)重的發(fā)熱性呼吸道疾病。該疾病后來(lái)被世界衛(wèi)生組織(WHO)命名為“嚴(yán)重急性呼吸道綜合征(SARS)”。到2003年5月19日，29個(gè)國(guó)家共向WHO報(bào)告了7864例SARS病例。總死亡報(bào)告為643例(病死率為8.2％)。
世界各地的研究者們對(duì)來(lái)自全球不同地區(qū)的SARS病原病毒的基因組進(jìn)行了序列測(cè)定，該病毒被歸類到冠狀病毒。冠狀病毒根據(jù)其抗體的交叉反應(yīng)和基因數(shù)據(jù)被分為3類。兩種先前已知的人類病毒與SARS-CoV在不同的組中。引起SARS的冠狀病毒不同于已知的任何族群。而是自身形成一個(gè)新族群。對(duì)預(yù)測(cè)的病毒蛋白的系統(tǒng)發(fā)生學(xué)分析提示，該病毒與任何已知的三類冠狀病毒都不密切相似。大多數(shù)冠狀病毒或引起呼吸道疾病或引起糞-口途徑傳播的腸道疾病。
SARS的潛伏期為2到7天。感染特征為發(fā)熱、干咳、氣短和輕微的聽診異常和胸片實(shí)化。淋巴細(xì)胞減少、白細(xì)胞減少、血小板減少、肝酶增高和肌酐激酶增高在大多數(shù)病例中也存在。與胃腸道相關(guān)的癥狀在SARS病人中也可看到。
對(duì)廣東、香港、北京、新加坡的死于SARS病人的病理學(xué)研究顯示，肺部的浸潤(rùn)性肺泡損壞是最明顯特征。在那些因病情嚴(yán)重而死亡的個(gè)體中，散在的II型肺泡細(xì)胞顯示出明顯的細(xì)胞學(xué)變化，包括多核化、巨細(xì)胞化、巨核化、核染色質(zhì)澄清(clearing)和突出的核仁。雖然這些變化很嚴(yán)重，但仍在其他浸潤(rùn)性肺泡損壞的上皮細(xì)胞變化的范圍內(nèi)。鑒別的形態(tài)學(xué)變化包括支氣管上皮細(xì)胞剝蝕、纖毛喪失和鱗狀上皮化生。其他發(fā)現(xiàn)包括病灶肺泡內(nèi)出血、吞噬血細(xì)胞作用、小氣道壞死性炎性碎片、機(jī)化性肺炎或繼發(fā)性細(xì)菌性肺炎。
該病的病理機(jī)制還有待確定，然而，急性肺損傷的機(jī)理可能涉及到病毒攻擊內(nèi)皮或上皮細(xì)胞而對(duì)肺泡壁產(chǎn)生的直接損害。選擇性地，病毒可感染炎性細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞因子、白介素或腫瘤壞死因子α介導(dǎo)引起損傷。也有可能SARS造成的組織損傷與病毒對(duì)組織的感染無(wú)直接關(guān)系，而是病毒在肺組織以外的鄰近組織誘導(dǎo)的細(xì)胞因子和其他因子的繼發(fā)效應(yīng)。
對(duì)死亡病例的病理學(xué)評(píng)價(jià)顯示肝細(xì)胞脂肪變性、肝濁腫、凋亡和點(diǎn)狀壞死，伴有Kupffer增生和門脈淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。在病人的胃腸道壁有局部出血、血管充血和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。
由于SARS-CoV能夠經(jīng)空氣途徑傳播，所以它對(duì)整個(gè)世界的廣大人群造成了特殊威脅，因此，迫切需要有感染前免疫、診斷感染、感染過(guò)程中免疫和治療SARS-CoV感染者的方法問(wèn)世。
發(fā)明概述這些需要及其他需要在這里描述的發(fā)明中得到了解決。本發(fā)明提供多肽、肽片段、病毒融合抑制劑、偶聯(lián)蛋白、免疫肽、免疫組合物、仿多肽類藥物、核酸片段、表達(dá)盒、核酸構(gòu)建體、重組病毒、病毒性疫苗、肽疫苗、微生物疫苗、DNA疫苗、抗體、適體、藥用組合物、免疫動(dòng)物的方法、治療嚴(yán)重急性呼吸道綜合征(SARS)的方法、診斷SARS的方法和試劑盒。
本發(fā)明提供具有的氨基酸序列與SARS病原學(xué)相關(guān)的多肽一致的多肽。優(yōu)選多肽來(lái)自SARS-CoV的刺突蛋白，能夠抑制SARS與動(dòng)物細(xì)胞的融合和/或在動(dòng)物體內(nèi)引發(fā)免疫反應(yīng)。在一些實(shí)施方案中，多肽是來(lái)自SARS-CoV的刺突蛋白的可溶性多肽。在另一些實(shí)施方案中，多肽包括來(lái)自SARS-CoV的刺突蛋白的17-757位氨基酸。在一些實(shí)施方案中，多肽包括來(lái)自SARS-CoV的刺突蛋白的762-1189位氨基酸。在其他實(shí)施方案中，多肽包括來(lái)自SARS-CoV的刺突蛋白的17-757位氨基酸。在一些實(shí)施方案中，多肽包括來(lái)自SARS-CoV的刺突蛋白的17-276位氨基酸。在其他實(shí)施方案中，多肽包括來(lái)自SARS-CoV的刺突蛋白的303-537位氨基酸。在一些實(shí)施方案中，多肽包括來(lái)自SARS-CoV的刺突蛋白的317-517位氨基酸。在其他實(shí)施方案中，多肽包括來(lái)自SARS-CoV的刺突蛋白的272-537位氨基酸。在一些實(shí)施方案中，多肽包括來(lái)自SARS-CoV的刺突蛋白的17-537位氨基酸。在其他實(shí)施方案中，多肽包括來(lái)自SARS-CoV的刺突蛋白的17-1189位氨基酸(與SEQ ID NO1有關(guān))。本發(fā)明的多肽能抑制SARS-CoV與動(dòng)物細(xì)胞的融合。本發(fā)明的核酸和多肽接種動(dòng)物能引發(fā)免疫反應(yīng)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸和多肽接種動(dòng)物后引發(fā)細(xì)胞免疫反應(yīng)。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸和多肽接種動(dòng)物后引發(fā)體液免疫反應(yīng)。動(dòng)物可以是爬行動(dòng)物。在某些實(shí)施方案中，動(dòng)物可以是禽類。在某些實(shí)施方案中，動(dòng)物是哺乳動(dòng)物，有時(shí)是人。
本發(fā)明提供來(lái)自SARS-CoV刺突蛋白的肽片段，優(yōu)選肽片段在水溶液中可溶。本發(fā)明的肽片段可以是SARS-CoV完整刺突蛋白的氨基酸序列但有一個(gè)氨基酸殘基缺失。在一些實(shí)施方案中，肽片段長(zhǎng)度至少為3個(gè)氨基酸。在其他實(shí)施方案中，肽片段長(zhǎng)度至少為10個(gè)氨基酸。在一些實(shí)施方案中，肽片段長(zhǎng)度至少為20個(gè)氨基酸。在其他實(shí)施方案中，肽片段長(zhǎng)度至少為30個(gè)氨基酸。在一些實(shí)施方案中，肽片段長(zhǎng)度至少為40個(gè)氨基酸。在其他實(shí)施方案中，肽片段長(zhǎng)度至少為50個(gè)氨基酸。在一些實(shí)施方案中，肽片段長(zhǎng)度至少為60個(gè)氨基酸。肽片段也可以是單個(gè)氨基酸單位添加到一個(gè)一定長(zhǎng)度的片段中，例如，肽片段長(zhǎng)度可以是3、4、10、11、21、22、31或32個(gè)氨基酸。本發(fā)明的肽片段能夠抑制SARS CoV與動(dòng)物細(xì)胞的融合或用于接種動(dòng)物體后可引發(fā)免疫反應(yīng)。接種動(dòng)物后能夠引發(fā)免疫反應(yīng)的例子包括，例如序列為DVQAPNYTQHTSSMRGC(SEQ ID NO58)的D24肽和序列為PSSKRFQPQQFGRDC(SEQ ID NO59)的D540肽。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的肽片段用于接種動(dòng)物后引發(fā)細(xì)胞免疫反應(yīng)，在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的肽片段用于接種動(dòng)物后引發(fā)體液免疫反應(yīng)。動(dòng)物可以是爬行動(dòng)物。在某些實(shí)施方案中，動(dòng)物可以是禽鳥類。在其他實(shí)施方案中，動(dòng)物可以是哺乳動(dòng)物。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，動(dòng)物可以是人。
本發(fā)明提供偶聯(lián)蛋白，該偶聯(lián)蛋白包括一個(gè)連接到第二多肽上的載體蛋白。優(yōu)選地，該載體蛋白是可溶性的。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)用于接種動(dòng)物后，該載體蛋白增強(qiáng)對(duì)偶聯(lián)蛋白的第二多肽的免疫反應(yīng)。在其他實(shí)施方案中，當(dāng)用于接種動(dòng)物后，該載體蛋白誘導(dǎo)對(duì)偶聯(lián)蛋白的第二多肽的細(xì)胞免疫反應(yīng)。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)用于接種動(dòng)物后，該載體蛋白誘導(dǎo)對(duì)偶聯(lián)蛋白的第二多肽的體液免疫反應(yīng)。該第二多肽可以是本發(fā)明的多肽或肽片段，或其保守性變異體。動(dòng)物可以是爬行動(dòng)物。在某些實(shí)施方案中，動(dòng)物可以是禽鳥類。在其他實(shí)施方案中，動(dòng)物可以是哺乳動(dòng)物。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，動(dòng)物可以是人。
本發(fā)明提供包括本發(fā)明的多肽或肽片段或其保守性變異體并被連接到乙?；?、間三硝苯基、對(duì)氨基苯砷酸、對(duì)氨基苯磺酸上的免疫肽。在一些實(shí)施方案中，免疫肽被連接到乙?；蜷g三硝苯基上。在其他實(shí)施方案中，免疫肽被連接到對(duì)氨基苯砷酸或?qū)Π被交撬嵘?。?yōu)選地，免疫肽是可溶性的。優(yōu)選地，免疫肽用于接種病人后引發(fā)免疫反應(yīng)。在其他實(shí)施方案中，用于接種動(dòng)物后，免疫肽能引發(fā)體液免疫反應(yīng)。在一些實(shí)施方案中，用于接種動(dòng)物后，疫肽能引發(fā)細(xì)胞免疫反應(yīng)。動(dòng)物可以是爬行動(dòng)物。在某些實(shí)施方案中，動(dòng)物可以是禽鳥類。在其他實(shí)施方案中，動(dòng)物可以是哺乳動(dòng)物。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，動(dòng)物可以是人。
本發(fā)明提供本發(fā)明中多肽和肽片段和其保守變異體的肽模擬物，其肽鍵被非肽鍵取代。在一些實(shí)施方案中，肽模擬物能抑制SARSCo-V與動(dòng)物細(xì)胞融合。在其他實(shí)施方案中，用于接種動(dòng)物后，肽模擬物能引發(fā)免疫反應(yīng)，例如，用于接種動(dòng)物后，肽模擬物能引發(fā)細(xì)胞免疫反應(yīng)?？蛇x性地，用于接種動(dòng)物后，肽模擬物能引發(fā)體液免疫反應(yīng)。動(dòng)物可以是爬行動(dòng)物。在某些實(shí)施方案中，動(dòng)物可以是禽鳥類。在其他實(shí)施方案中，動(dòng)物可以是哺乳動(dòng)物。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，動(dòng)物可以是人。
本發(fā)明提供含有佐劑和本發(fā)明的核酸、多肽、肽片段或肽模擬物的組合物，在一些實(shí)施方案中，組合物能抑制SARS-CoV與動(dòng)物細(xì)胞的融合。在其他實(shí)施方案中，用于接種動(dòng)物后，組合物引發(fā)免疫反應(yīng)。在一些實(shí)施方案中，用于接種動(dòng)物后，組合物引發(fā)細(xì)胞免疫反應(yīng)。在其他實(shí)施方案中，用于接種動(dòng)物后，組合物引發(fā)體液免疫反應(yīng)。動(dòng)物可以是爬行動(dòng)物。在某些實(shí)施方案中，動(dòng)物可以是禽鳥類。在其他實(shí)施方案中，動(dòng)物可以是哺乳動(dòng)物。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，動(dòng)物可以是人。
本發(fā)明提供編碼本發(fā)明的多肽和肽片段和它們的保守變異體的核酸片段。
本發(fā)明提供啟動(dòng)子被操作性地連接到本發(fā)明的核酸片段的表達(dá)盒。在一些實(shí)施方案中，啟動(dòng)子是組成性的。在其他實(shí)施方案中，啟動(dòng)子是可誘導(dǎo)的。
本發(fā)明提供含有載體和本發(fā)明的核酸片段的核酸構(gòu)建體，核酸構(gòu)建體可包括本發(fā)明的表達(dá)盒。在一些實(shí)施方案中，載體可以是病毒。在其他實(shí)施方案中，載體可以是質(zhì)粒。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，載體可以是表達(dá)載體。
本發(fā)明提供含有病毒載體和本發(fā)明的核酸片段的重組病毒。在一些實(shí)施方案中，病毒載體是皰疹病毒。在其他實(shí)施方案中，病毒載體是金絲雀痘病毒(canary pox virus)。在其他實(shí)施方案中，病毒載體是腺病毒。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，病毒載體是牛痘病毒。
本發(fā)明提供含有病毒載體、本發(fā)明的核酸片段和藥用載體的病毒性抗SARS疫苗。在一些實(shí)施方案中，病毒載體是皰疹病毒。在其他實(shí)施方案中，病毒載體是金絲雀痘病毒。在一些實(shí)施方案中，病毒載體是腺病毒。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，病毒載體是牛痘病毒。優(yōu)選地，藥用載體是用于注射劑的。優(yōu)選地，用于接種動(dòng)物后，該病毒性疫苗引發(fā)免疫反應(yīng)。在一些實(shí)施方案中，用于接種動(dòng)物后，該病毒疫苗引發(fā)細(xì)胞免疫反應(yīng)。在其他實(shí)施方案中，用于接種動(dòng)物后，該病毒疫苗引發(fā)體液免疫反應(yīng)。動(dòng)物可以是爬行動(dòng)物。在某些實(shí)施方案中，動(dòng)物可以是禽鳥類。在其他實(shí)施方案中，動(dòng)物可以是哺乳動(dòng)物。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，動(dòng)物可以是人。
本發(fā)明提供含有本發(fā)明的肽模擬物、多肽和肽片段或其保守性變異體和藥用載體的抗SARS肽類疫苗。優(yōu)選地，藥用載體被配制成注射劑。優(yōu)選地，肽類疫苗被制成單位劑量形式。優(yōu)選地，用于接種動(dòng)物后，肽類疫苗引發(fā)免疫反應(yīng)。在一些實(shí)施方案中，用于接種動(dòng)物后，肽類疫苗引發(fā)細(xì)胞免疫反應(yīng)。在其他實(shí)施方案中，用于接種動(dòng)物后，肽類疫苗引發(fā)體液免疫反應(yīng)。動(dòng)物可以是爬行動(dòng)物。在某些實(shí)施方案中，動(dòng)物可以是禽鳥類。在其他實(shí)施方案中，動(dòng)物可以是哺乳動(dòng)物。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，動(dòng)物可以是人。
本發(fā)明提供含有表達(dá)本發(fā)明的多肽或肽片段、或它們的保守變異體的微生物及藥用載體的抗SARS微生物疫苗。優(yōu)選地，該微生物是減毒的。在一些實(shí)施方案中，微生物是沙門氏菌屬(Salmonella)。在其他實(shí)施方案中，微生物是李斯特氏菌屬(Listeria)。在一些實(shí)施方案中，微生物是單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)。在一些實(shí)施方案中，藥用載體被配制成注射劑。在其它實(shí)施方案中，藥用載體被配制成口服劑型。優(yōu)選地，微生物疫苗被制成單位劑量形式。優(yōu)選地，用于接種動(dòng)物后，微生物疫苗引發(fā)免疫反應(yīng)。在一些實(shí)施方案中，用于接種動(dòng)物后，微生物疫苗引發(fā)細(xì)胞免疫反應(yīng)。在其他實(shí)施方案中，用于接種動(dòng)物后，微生物疫苗引發(fā)體液免疫反應(yīng)。動(dòng)物可以是爬行動(dòng)物。在某些實(shí)施方案中，動(dòng)物可以是禽鳥類。在其他實(shí)施方案中，動(dòng)物可以是哺乳動(dòng)物。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，動(dòng)物可以是人。
本發(fā)明提供含有插入有本發(fā)明的核酸片段的載體和藥用載體的抗SARS DNA疫苗。該DNA疫苗可以含有佐劑。DNA疫苗可以含有肌肉壞死劑。例如，肌肉壞死劑可以是布比卡因。在其他實(shí)施方案中，肌肉壞死劑可以是心臟毒素。載體可以是，例如病毒。在一些實(shí)施方案中，載體是細(xì)菌嗜菌體。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，載體是質(zhì)粒。含有插入片段的載體可以在真核細(xì)胞內(nèi)制備。在一些實(shí)施方案中，含有插入片段的載體可以在原核細(xì)胞內(nèi)制備。例如，含有插入片段的載體可以在細(xì)菌中制備。在一些實(shí)施方案中，藥用載體被用于制備粘膜給藥劑。在其他實(shí)施方案中，藥用載體被用于制備注射劑。優(yōu)選地，DNA疫苗被制成單位劑量形式。優(yōu)選地，用于接種動(dòng)物后，該DNA疫苗引發(fā)免疫反應(yīng)。在一些實(shí)施方案中，用于接種動(dòng)物后，該微生物疫苗引發(fā)體液免疫反應(yīng)。在其他實(shí)施方案中，用于接種動(dòng)物后，該微生物疫苗引發(fā)細(xì)胞免疫反應(yīng)。動(dòng)物可以是爬行動(dòng)物。在某些實(shí)施方案中，動(dòng)物可以是禽鳥類。在其他實(shí)施方案中，動(dòng)物可以是哺乳動(dòng)物。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，動(dòng)物可以是人。
本發(fā)明提供與本發(fā)明的多肽或肽片段，或它們的變異體結(jié)合的抗體。在一些實(shí)施方案中，抗體是一種與抗原結(jié)合的抗體片段。在其他實(shí)施方案中，抗體為多克隆抗體。在進(jìn)一步實(shí)施方案中，抗體是單鏈抗體。在其他實(shí)施方案中，抗體是單克隆抗體。在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，抗體為人源化抗體?？贵w可以與一個(gè)用于檢測(cè)的標(biāo)記物結(jié)合，例如，檢測(cè)標(biāo)記物是同位素標(biāo)記物。在一些實(shí)施方案中，檢測(cè)標(biāo)記物是親和標(biāo)記物。在其它實(shí)施方案中，檢測(cè)標(biāo)記物是酶。在另一些實(shí)施方案中，檢測(cè)標(biāo)記物是熒光標(biāo)記物。抗體也可與毒素相連。
本發(fā)明提供與本發(fā)明的多肽或肽片段，或它們的保守性變異體結(jié)合的適體。該適體可以與檢測(cè)標(biāo)記物結(jié)合。例如，檢測(cè)標(biāo)記物可以是同位素標(biāo)記物。在一些實(shí)施方案中，檢測(cè)標(biāo)記物是親和標(biāo)記物。在其他實(shí)施方案中，檢測(cè)標(biāo)記物是酶。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，檢測(cè)標(biāo)記物為熒光蛋白。在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，檢測(cè)標(biāo)記物是熒光標(biāo)記物。適體也可與毒素結(jié)合。
本發(fā)明提供含有本發(fā)明的抗體、S多肽或適體和藥用載體的藥用組合物或試劑盒。優(yōu)選地，該藥用組合物被配制成注射劑。
附圖簡(jiǎn)述本專利或申請(qǐng)文本含有至少一幅彩圖。本辦公室將根據(jù)要求并在收取必要費(fèi)用的情況下提供帶有彩圖的本專利或?qū)＠暾?qǐng)文本。


圖1A是含有編碼本發(fā)明的刺突蛋白的插入片段的DNA構(gòu)建體的瓊脂糖電泳圖。從左到右的泳道道1為1kb的DNA分子量標(biāo)記(從下到上為0.5、1.0、1.6、2.0、3.0、4.0)；道2顯示被BamHI/XbaI消化后的DNA構(gòu)建體，出現(xiàn)明顯的載體條帶(上帶)和編碼刺突蛋白的DNA片段(下帶)；道3顯示被HindIII消化后的DNA構(gòu)建體，由于載體和編碼刺突蛋白的DNA片段存在有HindIII的酶切位點(diǎn)，產(chǎn)生了預(yù)期的一個(gè)較小的條帶和一個(gè)較大的條帶。
圖1B是全長(zhǎng)的SARS-CoV S糖蛋白單體的示意圖，顯示了去除信號(hào)序列(1-16位殘基，SEQ ID NO60)之后的各種可溶性多肽片段?？扇苄云螢榇掏坏鞍灼危麨椤癝”，繼后是反應(yīng)構(gòu)成該片段末端的刺突蛋白氨基酸位數(shù)。這樣，“S756”指一個(gè)起始于第17位氨基酸(緊跟信號(hào)序列之后)，終止于第756位氨基酸的可溶性刺突蛋白片段。“TM”指跨膜片段，箭頭標(biāo)示了在第758-761(序列RNTR)位氨基酸之間的可能的切割位點(diǎn)?！癛BD”指在第272-537(SEQ IDNO57)位氨基酸之間的潛在的受體結(jié)合區(qū)，很可能位于第303位氨基酸的下游殘基和第537(SEQ ID NO61)位氨基酸的上游殘基之間。
圖2顯示了大腸桿菌中SARS-CoV刺突蛋白的肽片段表達(dá)的變性聚丙烯酰胺電泳圖。該肽片段為SEQ ID NO1的第17-446位氨基酸。編碼17-446位氨基酸的核酸片段被克隆進(jìn)pRSET載體，構(gòu)建成pRSET-S(17-446)，在BL21DE3細(xì)胞中表達(dá)。左邊的數(shù)字和箭頭指示以千道爾頓為單位的分子量標(biāo)示。泳道含有以下多肽M為分子量標(biāo)示；泳道1和2為不含編碼SEQ ID NO1的17-446位氨基酸殘基的核酸序列和未經(jīng)異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)的對(duì)照大腸桿菌的多肽；泳道3為不含編碼SEQ ID NO1的17-446位氨基酸殘基的核酸序列但經(jīng)過(guò)異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)的對(duì)照大腸桿菌的多肽；泳道4為含有編碼SEQ ID NO1的17-446位氨基酸殘基的核酸序列的pRSET載體并經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的大腸桿菌分析。右邊的箭頭指示與大腸桿菌表達(dá)的SEQ ID NO1的17-446位氨基酸殘基相應(yīng)的肽片段的位置。
圖3是SARS-CoV的刺突蛋白的所述多肽片段在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的狹線印跡分析圖。編碼肽片段的核酸片段被克隆進(jìn)pSecTag2B載體，以表達(dá)N端含有具分泌功能的小鼠k鏈前導(dǎo)序列、C端含有用于檢測(cè)和親和層析純化的c-Myc決定簇和組氨酸標(biāo)記物的肽片段。該核酸構(gòu)建體被轉(zhuǎn)化進(jìn)入HEK293和VeroE6細(xì)胞。指定肽片段的表達(dá)用抗c-Myc抗體通過(guò)狹線印跡分析來(lái)檢測(cè)。左右兩側(cè)的數(shù)字指示檢測(cè)到的肽片段的氨基酸殘基。左邊的一欄代表肽片段在HEK293細(xì)胞中的表達(dá)，右邊的一欄代表肽片段在VeroE6細(xì)胞中的表達(dá)。上半欄代表獲取自細(xì)胞培養(yǎng)基的樣品(分泌蛋白)，下半欄代表獲取自細(xì)胞裂解物的樣品(細(xì)胞內(nèi)蛋白)。PC為陽(yáng)性對(duì)照，由提供含有C端帶c-Myc標(biāo)記物的PSA的質(zhì)粒的廠家提供。NC為陰性對(duì)照，含來(lái)自SARS-CoV的全長(zhǎng)刺突蛋白但無(wú)c-Myc決定簇或組氨酸標(biāo)記物。
圖4A是刺突蛋白的指定肽片段在人293細(xì)胞或猴VeroE6細(xì)胞中表達(dá)的狹線印跡分析。在有或無(wú)重組牛痘病毒表達(dá)的T7聚合酶存在下轉(zhuǎn)染了編碼S片段(S276，S537和S756)的質(zhì)粒的293和VeroE6細(xì)胞的培養(yǎng)上清被轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上并用抗c-Myc決定簇的抗體進(jìn)行檢測(cè)。左右兩側(cè)的數(shù)字指示被檢出肽片段的氨基酸殘基。PSA PC為含有C端帶c-Myc標(biāo)記物的PSA陽(yáng)性對(duì)照。pCDNA-S NC為含有SARS-CoV全長(zhǎng)刺突蛋白但無(wú)c-Myc決定簇或組氨酸標(biāo)記物的陰性對(duì)照。泳道內(nèi)容如下(1)未用VTF7.3牛痘病毒感染的人293細(xì)胞，(2)用VTF7.3牛痘病毒感染的人293細(xì)胞，(3)未用VTF7.3牛痘病毒感染的猴VeroE6細(xì)胞，(4)用VTF7.3牛痘病毒感染的猴VeroE6細(xì)胞。
圖4B如圖4A所述將轉(zhuǎn)染細(xì)胞的上清與Ni-NTA瓊脂糖珠一起溫育，清洗并用與圖4A中相同的抗-c-Myc抗原表位抗體進(jìn)行Western印跡試驗(yàn)。
圖4C為用兩株分別抗起始于第24位殘基(D24，中間組)和第540位殘基(P540，右邊組)的肽的兔多克隆抗體檢測(cè)S片段的圖示。左邊的一組為用抗c-Myc決定簇抗體檢測(cè)S537和S756的Western印跡對(duì)照。
圖5是用兔多克隆抗體P540通過(guò)流式細(xì)胞儀顯示全長(zhǎng)的膜相關(guān)的S蛋白表達(dá)在細(xì)胞表面的圖示。編碼全長(zhǎng)S糖蛋白的核酸被用于轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，然后再用VTF7.3轉(zhuǎn)染。收集細(xì)胞并與P540多克隆抗體和帶有FITC的第二抗體共孵育后，經(jīng)洗滌，再用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。不含編碼S的核酸的與表達(dá)S的質(zhì)粒一樣的質(zhì)粒在對(duì)照實(shí)驗(yàn)中被用于轉(zhuǎn)染作為陰性對(duì)照(NC)的細(xì)胞，轉(zhuǎn)染有含有編碼全長(zhǎng)S糖蛋白的核酸的細(xì)胞以S標(biāo)示。
圖6A和6B顯示S糖蛋白基本無(wú)自然發(fā)生的切割。表達(dá)S756、Se的轉(zhuǎn)染293細(xì)胞的上清和表達(dá)S糖蛋白的293細(xì)胞的裂解物用P540抗體進(jìn)行Western印跡，觀察發(fā)現(xiàn)S和Se的切割在基線水平。圖6A是樣品在4℃存放3天后用于Western印跡分析切割圖譜以監(jiān)測(cè)非特異性蛋白酶活性效應(yīng)的圖示。作為對(duì)比，圖6B為樣品制備后立即進(jìn)行的印跡分析圖示。
圖7A-C顯示的是S糖蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞融合。一個(gè)無(wú)S插入片段的基于pCDNA3的質(zhì)粒被用作質(zhì)粒對(duì)照，S表達(dá)細(xì)胞與ACE2-ecto表達(dá)細(xì)胞的融合被用作陰性對(duì)照。該pCDNA3-ACE2-ecto構(gòu)建體只表達(dá)ACE2的帶有C9肽標(biāo)記物的可溶性ecto功能區(qū)。圖7A顯示轉(zhuǎn)染有pSecTag2B-S和pCDNA3-ACE2-Ecto的293T細(xì)胞之間無(wú)合體細(xì)胞形成。相比之下，圖7B顯示轉(zhuǎn)染有pSecTag2B-S和pCDNA3-ACE2的293T細(xì)胞之間有合體細(xì)胞形成。圖7C為用一個(gè)基于報(bào)告基因的試驗(yàn)來(lái)測(cè)定的細(xì)胞融合的圖示，如圖所示，pCDNA3和pSecTag2B載體表達(dá)的S糖蛋白均可在基于β-gal報(bào)告基因的細(xì)胞-細(xì)胞融合試驗(yàn)中測(cè)到。
圖8A-C顯示S糖蛋白的受體-結(jié)合區(qū)(RBD)位于第272和537位殘基之間。圖8A為兩個(gè)不同的可溶性S片段(S537和S756)與293細(xì)胞和Vero E6細(xì)胞結(jié)合的圖示。圖8B為各種S片段與Vero E6細(xì)胞結(jié)合的圖示，背景陰性對(duì)照的OD405值從各S片段的OD405值中減除，得到的OD405值以相對(duì)S537的百分比表示。圖8C為用ELISA法測(cè)得的S多肽片段與純化后的可溶性ACE2相互作用的圖示。在所有實(shí)驗(yàn)中，陰性對(duì)照(NC)為除了用于轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒不編碼任何蛋白外，其處理方式與其他樣品完全相同的樣品。這里顯示的數(shù)據(jù)代表至少三個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。所有樣品的OD405以相對(duì)S537的百分比表示。
圖9A-D為SARS-CoV的S糖蛋白的N末端片段之間經(jīng)證實(shí)通過(guò)免疫共沉淀和交叉連接發(fā)生二聚體化的圖示。所有N末端片段，除含有受體結(jié)合區(qū)的最小的片段(S317-517)外，通過(guò)P540抗體與S756免疫共沉淀。P540抗體是抗含S糖蛋白的第540-555位殘基的肽的兔多克隆抗體，它能與S756多肽非N末端片段結(jié)合。
圖9A中，編碼N末端片段的質(zhì)粒(以終止氨基酸殘基的數(shù)字或起始和終止氨基酸殘基的數(shù)字命名)被用于單獨(dú)轉(zhuǎn)染(左邊6條道)或與編碼S756的質(zhì)粒聯(lián)合轉(zhuǎn)染(右邊4條道)293T細(xì)胞，這些細(xì)胞再用VTF7.3牛痘病毒轉(zhuǎn)染，進(jìn)行孵育后，收集細(xì)胞培養(yǎng)基，用能夠識(shí)別所有片段的小鼠抗c-Myc決定簇抗體進(jìn)行Western印跡分析的圖示。
圖9B為所有N末端S片段，除含有受體結(jié)合功能區(qū)的最小片段(S317-517)外，通過(guò)P540抗體與S756免疫共沉淀的圖示。與圖9A中所用培養(yǎng)基一樣的培養(yǎng)基樣品首先被用于與只識(shí)別S756的P540多克隆抗體進(jìn)行免疫沉淀，然后用抗c-Myc決定簇的抗體對(duì)這些沉淀物進(jìn)行Western印跡分析，以確定被免疫共沉淀的N末端片段。
圖9C顯示的是在有或無(wú)DTT存在的情況下，分子量大小與二聚體形式一致的新條帶。為了排除可能引起免疫共沉淀的非特異性二硫鍵形成的可能，DTT被用于其中的一個(gè)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)中。DTT對(duì)分泌的S756(左道)或S756+S276(右道)的免疫沉淀或免疫共沉淀無(wú)作用。含有分泌的S756(左道)或S756+S276(右道)片段的培養(yǎng)基樣品在有或無(wú)2mM DTT存在的情況下用P540抗體進(jìn)行免疫沉淀。
圖9D是S多肽寡聚體大小的示意圖。S537片段與BS3(Pierce，Rockford，IL)如實(shí)施例中所描述的那樣交叉聯(lián)接，經(jīng)過(guò)SDS-PAGE分離后，用抗c-Myc抗體通過(guò)Western印跡來(lái)檢測(cè)S537的單體和它的寡聚體。正如圖9D右邊的泳道所顯示，當(dāng)交叉聯(lián)接劑加入后出現(xiàn)了一個(gè)新條帶。該新條帶的分子量與二聚體一致而與更高級(jí)的寡聚體不同。
圖10A為通過(guò)排阻層析檢測(cè)到的N末端片段S537的二聚體化圖示。S537和S317-517的洗脫譜上用箭頭和數(shù)字指明標(biāo)準(zhǔn)校對(duì)蛋白被洗脫的位置和分子量。
圖10B為用抗c-Myc決定簇抗體對(duì)收集到的S537和S317-517流分進(jìn)行Western印跡的圖示。
圖11A-B顯示最遠(yuǎn)端的N末端功能區(qū)為S糖蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞-細(xì)胞融合所必需。圖11A為S糖蛋白的缺失突變的圖示和細(xì)胞-細(xì)胞融合試驗(yàn)數(shù)據(jù)的總結(jié)，其中RBD代表受體結(jié)合區(qū)的大致位置。因?yàn)槿诤隙霈F(xiàn)的信號(hào)用加號(hào)(+)表示，測(cè)不到高于背景水平的信號(hào)用減號(hào)(-)表示。只有野生型的含第17-1255位氨基酸的多肽具有融合活性。含第103-1255(Del1)和含第311-1255(Del2)氨基酸的缺失突變體均無(wú)融合活性。圖11B顯示用Western分析法測(cè)得的全長(zhǎng)S糖蛋白和其突變體的表達(dá)水平。各樣品用同樣量的細(xì)胞裂解物加樣，兔多克隆抗體P540用于檢測(cè)。圖11C為用流式細(xì)胞儀測(cè)得的全長(zhǎng)S糖蛋白和Del1和Del2缺失突變體在細(xì)胞表面表達(dá)的圖示。雖然表面表達(dá)較低，但只轉(zhuǎn)染了空質(zhì)粒的細(xì)胞的陰性對(duì)照與其他三條曲線有明顯不同。
圖12A-B顯示二聚體S1與含受體結(jié)合域的單價(jià)片段相比能更有效地與受體ACE2結(jié)合。圖12A顯示用轉(zhuǎn)染了S276、S319-518和S537構(gòu)建體的細(xì)胞的200μl培養(yǎng)上清通過(guò)ELISA法檢測(cè)到的不同S片段的相對(duì)表達(dá)水平?？菇M氨酸抗體和抗c-Myc決定簇抗體被用于三明治ELISA來(lái)檢測(cè)分泌的帶標(biāo)記物的S蛋白。圖12B顯示用ELISA法測(cè)得的S片段與ACE2結(jié)合的水平。帶有標(biāo)記的ACE2通過(guò)事先包被于板上的抗C9抗體固定在板上，轉(zhuǎn)染了各種S蛋白的細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)上清被混合后，加入ELISA板，在有(影線)或無(wú)(空白)抗c-Myc抗體存在的條件下孵育。最高的表達(dá)或結(jié)合水平推定為100％。如圖所示，具有N末端二聚體化和受體結(jié)合兩個(gè)功能區(qū)的S537片段比只含有受體結(jié)合區(qū)的S319-518片段與ACE2的結(jié)合更有效。
圖13A-B顯示在排阻層析的條件下可溶性S胞外域?yàn)槿垠w。圖13A中，純化的Se通過(guò)用已知分子量的蛋白校正過(guò)的凝膠過(guò)濾柱層析。同樣量的BSA被用作內(nèi)部對(duì)照。在圖13B中，從凝膠過(guò)濾柱收集到的不同的流分，通過(guò)Western印跡進(jìn)行分析。在一些含有已知分子量的Se片段的流分中檢測(cè)到兩個(gè)S多肽的條帶，代表Se片段自身(下面的條帶)和它的聚合體(上面的條帶)。
圖14A顯示本發(fā)明的DNA疫苗能夠在小鼠體內(nèi)引發(fā)出很高滴度的抗SARS-CoV血清。小鼠1A-5A用編碼含有刺突蛋白受體結(jié)合區(qū)(RBD)的S319-518片段的DNA免疫；小鼠1B-5B用RBD-編碼DNA(S319-518片段)與編碼Fc片段的核酸的融合體免疫；小鼠1C-3C接種空質(zhì)粒(無(wú)S片段DNA)。收集抗血清，用ELISA法檢測(cè)以確定不同分離物的滴度。在圖14A中，第一個(gè)數(shù)字代表單個(gè)小鼠，字母代表各免疫組，最后的數(shù)字代表所用稀釋度?？寡灏?0、250、1250和7250的稀釋系數(shù)稀釋，如該柱圖的X軸所示。這些數(shù)字提示用編碼S蛋白的受體結(jié)合區(qū)的DNA進(jìn)行免疫誘導(dǎo)出很強(qiáng)的針對(duì)SARS-CoV的免疫反應(yīng)。
圖14B顯示從用RBD-編碼DNA免疫的小鼠獲取的抗血清能夠預(yù)防S介導(dǎo)的細(xì)胞融合。細(xì)胞(293T)與獲取自用編碼刺突蛋白受體結(jié)合區(qū)多肽(S319-518)片段的DNA免疫過(guò)的小鼠的抗血清孵育，然后該細(xì)胞懸液與表達(dá)S蛋白的細(xì)胞混合。融合的測(cè)定如實(shí)施例20中所述(也見(jiàn)，Xiao等，BBRC 2003)。各融合反應(yīng)的活性百分比(這里1＝100％)被繪制在Y軸，無(wú)任何抑制的融合的百分比被指定為100％。PC代表未加血清的陽(yáng)性對(duì)照。對(duì)各組中#1到#2鼠血清，所用血清稀釋系數(shù)為10(指定為0.1)、100(指定為0.01)和1000(指定為0.001)。對(duì)A組和B組中#3到#5鼠血清以及對(duì)照組中3#鼠血清，所用血清稀釋系數(shù)為20(指定為0.05)和100(指定為0.01)。這些數(shù)據(jù)提示用編碼S蛋白的受體結(jié)合區(qū)的DNA進(jìn)行免疫可預(yù)防SARS-CoV感染。
圖15顯示可溶性S糖蛋白片段抑制S介導(dǎo)的細(xì)胞融合。10μg/ml的各種S片段與ACE2-表達(dá)細(xì)胞首先在室溫下孵育10分鐘。該ACE2-表達(dá)細(xì)胞再與S表達(dá)細(xì)胞混合，融合試驗(yàn)用實(shí)施例中描述的方法進(jìn)行。Y軸是各樣本減去了背景噪音后的OD595值。各構(gòu)建體的數(shù)字代表各多肽的起始和終止殘基。
發(fā)明詳述SARS是重要的公共健康問(wèn)題。診斷和治療感染了SARS-CoV的病人的方法為預(yù)防或控制SARS-CoV感染的進(jìn)一步傳播提供了機(jī)會(huì)。由于SARS-CoV通過(guò)空氣的途徑感染人體，所以這些方法特別重要。本發(fā)明提供編碼SARS-CoV刺突蛋白的氨基酸序列片段的核酸。本發(fā)明也提供氨基酸序列與SARS-CoV刺突蛋白的氨基酸片段序列一致的多肽。本發(fā)明還提供SARS-CoV刺突蛋白的肽片段和它們的保守性變異體，另外還有氨基酸序列部分與刺突蛋白一致的偶聯(lián)蛋白和肽模擬物。
刺突蛋白是非常重要的蛋白，是由于其位于完整SARS-CoV的表面。因此，它可被用作在病毒有機(jī)會(huì)感染細(xì)胞之前抑制或清除完整病毒的靶目標(biāo)。
本發(fā)明提供的核酸和多肽相對(duì)全長(zhǎng)的刺突蛋白來(lái)說(shuō)有明顯的優(yōu)勢(shì)，因?yàn)楹怂岷苋菀咨a(chǎn)，本發(fā)明的多肽也能以可溶性的形式大量制備。本發(fā)明的多肽相對(duì)天然刺突蛋白來(lái)說(shuō)還有另一個(gè)優(yōu)勢(shì)，它們可以被制備成對(duì)動(dòng)物體內(nèi)的降解有較大抵抗力的形式。本發(fā)明的多肽也能通過(guò)配制增強(qiáng)其抗原性使其成為更有效的抗原在動(dòng)物體，如人體引發(fā)免疫反應(yīng)。
所以，本發(fā)明提供可以被配制成能夠用于免疫和治療SARS-CoV感染者的疫苗和免疫組合物的核酸和多肽抗原。另外，本發(fā)明還提供與SARS-CoV的刺突蛋白結(jié)合的可以用于診斷、免疫和治療SARS-CoV感染者的抗體。
定義“佐劑”一般情況下被定義為非特異性地加強(qiáng)抗原的免疫反應(yīng)的物質(zhì)。各種佐劑可以用于本發(fā)明的免疫肽和免疫fragopeptides。大多數(shù)佐劑在設(shè)計(jì)上含有保護(hù)抗原不被快速代謝的物質(zhì)，如氫氧化鋁或礦物油，和免疫反應(yīng)刺激劑，如脂質(zhì)A、百日咳薄得氏菌(Bortadellapertussis)或結(jié)合分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)來(lái)源蛋白。合適的佐劑市場(chǎng)上有售，例如，F(xiàn)reund′s不完全佐劑和完全佐劑(DifcoLaboratories，Detroit，Mich.)；Merck佐劑65(Merck and Company，Inc.，Rahway，N.J.)；鋁鹽如氫氧化鋁凝膠(alum)或磷酸鋁；鈣鹽、鐵鹽和鋅鹽；不可溶的酰化酪氨酸懸液；?；?；陽(yáng)離子或陰離子衍生化的多糖；聚磷腈；生物降解微球；單磷酰脂A和quil A；細(xì)胞因子，如GM-CSF或白介素-2、-7或-12也可以被用作佐劑。
“動(dòng)物”指能夠針對(duì)抗原的攻擊調(diào)動(dòng)起免疫反應(yīng)的有機(jī)體。例如，爬行動(dòng)物、禽鳥類和哺乳動(dòng)物能夠?qū)乖墓舢a(chǎn)生抗體反應(yīng)。在非人有機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生的抗體被認(rèn)為用于診斷試驗(yàn)有利于降低和排除交叉反應(yīng)。
“適體”為與本發(fā)明的多肽或肽片段結(jié)合的肽、多肽或核酸(RNA或DNA)。
“載體蛋白”指可以連接到本發(fā)明的多肽或肽片段上形成偶聯(lián)蛋白的多肽。載體蛋白可以為了增強(qiáng)多肽或肽片段的可溶性和免疫原性而連接到多肽或肽片段上。例如，生物素可以被用作載體蛋白連接到多肽或肽片段上形成一個(gè)可以通過(guò)與親和素的相互作用而分離出來(lái)，或通過(guò)使用熒光標(biāo)記的親和素來(lái)檢測(cè)的偶聯(lián)蛋白。在另一個(gè)例子中，連接有抗體的載體蛋白可以被連接到多肽或肽片段上形成一個(gè)偶聯(lián)蛋白，該偶聯(lián)蛋白與抗體相連而抗體又與連接蛋白的載體蛋白相連。
本發(fā)明包含分離的或基本純化的核酸、肽、多肽或蛋白。在本發(fā)明的內(nèi)容中，“分離”的核酸、DNA或RNA分子或“分離”的多肽指存在于非天然環(huán)境中的核酸、DNA、RNA分子或多肽，因此不是天然產(chǎn)物。分離的核酸、DNA、RNA分子或多肽可以以純化的形式存在或存在于一個(gè)非天然的環(huán)境中，例如，轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞中?！胺蛛x”的核酸分子、肽、多肽或蛋白、或其片段用重組技術(shù)生產(chǎn)時(shí)應(yīng)基本不含其他細(xì)胞物質(zhì)或培養(yǎng)基，用化學(xué)合成法生產(chǎn)時(shí)應(yīng)基本不含化學(xué)前體或其他化學(xué)物質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，“分離”的核酸為不含該核酸在其來(lái)源有機(jī)體的基因組DNA上的天然側(cè)翼序列(即位于該核酸5′和3′端的序列)。在各種實(shí)施方案中，分離的核酸分子可以含小于約5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的其來(lái)源細(xì)胞基因組DNA上該核苷酸序列的側(cè)翼序列?；静缓?xì)胞物質(zhì)的蛋白、肽或多肽包括含有小于約30％、20％、10％或5％(干重)的污染蛋白的蛋白、肽或多肽制劑。當(dāng)本發(fā)明的蛋白、或它們的生物活性部分是通過(guò)重組的方法生產(chǎn)時(shí)，優(yōu)選培養(yǎng)基含小于30％、20％、10％或5％(干重)的化學(xué)前體或非目的蛋白化學(xué)物質(zhì)。
術(shù)語(yǔ)多肽、肽和蛋白在這里是相互混用的。
肽或多肽“片段”在這里用于指比全長(zhǎng)的肽、多肽或蛋白小的片段。例如，肽或多肽片段在長(zhǎng)度上可以含有至少3個(gè)、至少4個(gè)、至少5個(gè)、至少10個(gè)、至少20個(gè)、至少30個(gè)、至少40個(gè)氨基酸，或它們的單個(gè)單位長(zhǎng)度。例如，片段在長(zhǎng)度上可以是6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或更多氨基酸，肽片段在大小上無(wú)上限。但是，在一些實(shí)施方案中，肽片段在長(zhǎng)度上可以小于500個(gè)氨基酸、小于400個(gè)氨基酸、小于300個(gè)氨基酸、小于250個(gè)氨基酸。優(yōu)選肽片段用于接種動(dòng)物后能夠誘導(dǎo)出免疫反應(yīng)。肽片段用于引發(fā)免疫反應(yīng)可以通過(guò)將肽片段與佐劑聯(lián)和后接種動(dòng)物，即與佐劑結(jié)合的肽片段，或與對(duì)氨基苯砷酸、對(duì)氨基苯磺酸、乙?；鶊F(tuán)或間三硝基苯基偶聯(lián)的肽片段。肽片段中可含有非酰胺鍵，并可以是肽模擬物。
術(shù)語(yǔ)“可溶”用于這里指多肽具有在水溶液中溶解的能力，例如，可溶性多肽可與水性介質(zhì)混合，使水性介質(zhì)中至少有部分可測(cè)到的肽。肽的檢測(cè)可以通過(guò)常規(guī)技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)，如光吸收法、熒光法、與染料的結(jié)合能力、減少銀離子的能力和其他類似方法。
術(shù)語(yǔ)“特異性結(jié)合”指與單一抗原決定簇結(jié)合而不與多于一個(gè)的抗原決定簇結(jié)合的抗體，因此，與一種多肽特異性結(jié)合的抗體將與該多肽上的一個(gè)抗原決定簇結(jié)合，而不與另一個(gè)多肽上的抗原決定簇結(jié)合。
I.本發(fā)明的多肽、肽片段、偶聯(lián)蛋白、免疫肽和肽模擬物本發(fā)明提供含有與嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合征(SARS)病原學(xué)相關(guān)的病毒(SARS-CoV)的刺突蛋白的氨基酸序列一致的氨基酸序列的多肽，其代表性氨基酸序列為SEQ ID NO1，該序列被羅列于下供參考
1 MFIFLLFLTL TSGSDLDRCT TFDDVQAPNY TQHTSSMRGV41 YYPDEIFRSD TLYLTQDLFL PFYSNVTGFH TINHTFGNPV81 IPFKDGIYFA ATEKSNVVRG WVFGSTMNNK SQSVIIINNS121 TNVVIRACNF ELCDNPFFAV SKPMGTQTHT MIFDNAFNCT161 FEYISDAFSL DVSEKSGNFK HLREFVFKNK DGFLYVYKGY201 QPIDVVRDLP SGFNTLKPIF KLPLGINITN FRAILTAFSP241 AQDIWGTSAA AYFVGYLKPT TFMLKYDENG TITDAVDCSQ281 NPLAELKCSV KSFEIDKGIY QTSNFRVVPS GDVVRFPNIT321 NLCPFGEVFN ATKFPSVYAW ERKKISNCVA DYSVLYNSTF361 FSTFKCYGVS ATKLNDLCFS NVYADSFVVK GDDVRQIAPG401 QTGVIADYNY KLPDDFMGCV LAWNTRNIDA TSTGNYNYKY441 RYLRHGKLRP FERDISNVPF SPDGKPCTPP ALNCYWPLND481 YGFYTTTGIG YQPYRVVVLS FELLNAPATV CGPKLSTDLI521 KNQCVNFNFN GLTGTGVLTP SSKRFQPFQQ FGRDVSDFTD561 SVRDPKTSEI LDISPCAFGG VSVITPGTNA SSEVAVLYQD601 VNCTDVSTAI HADQLTPAWR IYSTGNNVFQ TQAGCLIGAE641 HVDTSYECDI PIGAGICASY HTVSLLRSTS QKSIVAYTMS681 LGADSSIAYS NNTIAIPTNF SISITTEVMP VSMAKTSVDC721 NMYICGDSTE CANLLLQYGS FCTQLNRALS GIAAEQDRNT761 REVFAQVKQM YKTPTLKYFG GFNFSQILPD PLKPTKRSFI801 EDLLFNKVTL ADAGFMKQYG ECLGDINARD LICAQKFNGL841 TVLPPLLTDD MIAAYTAALV SGTATAGWTF GAGAALQIPF881 AMQMAYRFNG IGVTQNVLYE NQKQIANQFN KAISQIQESL921 TTTSTALGKL QDVVNQNAQA LNTLVKQLSS NFGAISSVLN961 DILSRLDKVE AEVQIDRLIT GRLQSLQTYV TQQLIRAAEI1001 RASANLAATK MSECVLGQSK RVDFCGKGYH LMSFPQAAPH1041 GVVFLHVTYV PSQERNFTTA PAICHEGKAY FPREGVFVFN1081 GTSWFITQRN FFSPQIITTD NTFVSGNCDV VIGIINNTVY1121 DPLQPELDSF KEELDKYFKN HTSPDVDLGD ISGINASVVN1161 IQKEIDRLNE VAKNLNESLI DLQELGKYEQ YIKWPWYVWL1201 GFIAGLIAIV MVTILLCCMT SCCSCLKGAC SCGSCCKFDE1241 DDSEPVLKGV KLHYT本發(fā)明也提供含有與嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合征(SARS)病原學(xué)相關(guān)的病毒(SARS-CoV)的刺突蛋白的氨基酸序列一致的氨基酸序列的肽片段，這些氨基酸序列包括SEQ ID NO13、14、15、20-59和61-63所代表的序列。SEQ ID NO1的肽片段在長(zhǎng)度上也可以是三個(gè)或三個(gè)以上的氨基酸，并且當(dāng)用于接種動(dòng)物時(shí)能夠產(chǎn)生免疫反應(yīng)。這些肽片段以那些長(zhǎng)度為三個(gè)氨基酸，或更長(zhǎng)一些的單個(gè)氨基酸單位，如長(zhǎng)度為4、5、6、7、8、9、10個(gè)氨基酸和與SEQ ID NO1的氨基酸序列一致的序列上缺少一個(gè)氨基酸的氨基酸序列為典型。
本發(fā)明也提供含有載體蛋白連接到本發(fā)明的多肽和肽片段上的偶聯(lián)蛋白。載體蛋白可以用于增強(qiáng)偶聯(lián)蛋白的可溶性。載體蛋白也可用于增強(qiáng)偶聯(lián)蛋白的免疫原性以增加與本發(fā)明的多肽或肽片段結(jié)合的抗體的產(chǎn)量。載體蛋白還可用于分離和檢測(cè)偶聯(lián)蛋白，因此，偶聯(lián)蛋白可以通過(guò)與偶聯(lián)蛋白的載體蛋白部分相結(jié)合的其他成分的相互作用而被檢測(cè)或分離出來(lái)。例如，偶聯(lián)蛋白含有親和素的載體蛋白，可通過(guò)已知的方法用生物素進(jìn)行檢測(cè)和分離。許多載體蛋白可被用來(lái)制備本發(fā)明的偶聯(lián)蛋白。這些載體蛋白的例子包括匙孔血藍(lán)蛋白、牛血清白蛋白、卵白蛋白、小鼠血清白蛋白、兔血清白蛋白和其類似物。載體蛋白可以通過(guò)重組的方法以融合蛋白的形式與本發(fā)明的多肽或肽片段偶聯(lián)。載體蛋白也可以通過(guò)化學(xué)的方法與本發(fā)明的多肽或肽片段偶聯(lián)，或通過(guò)使用化學(xué)連接物偶聯(lián)。這些偶聯(lián)方法為本領(lǐng)域所知并且已有描述，見(jiàn)Harlow等，AntibodiesALaboratory Manual，page 319(Cold Spring Harbor Pub.1988)；Taylor，Protein Immobilization，Marcel Dekker，Inc.，New York，(1991)。
本發(fā)明提供本發(fā)明的多肽或肽片段連接到對(duì)氨基苯砷酸、對(duì)氨基苯磺酸、乙酰基團(tuán)，或間三硝基苯基的免疫肽，與這些基團(tuán)連接的方法為已知的并且已有報(bào)道，見(jiàn)Weigle，J.Exp.Med.，116913-928(1962)；Weigle，J.Exp.Med.，1221049-1062(1965)；Weigle，J.Exp.Med.，121289-308(1965)。
本發(fā)明的多肽和肽片段可以是糖基化和非糖基化形式。本發(fā)明的多肽和肽片段可以是在水溶液中可溶的或不可溶的。本發(fā)明的多肽和肽片段可以是保守性變異體，保守性變異體指來(lái)源于全長(zhǎng)多肽，如示例序列SEQ ID NO1的多肽和肽片段，通過(guò)刪除(所謂截?cái)?、添加或在全長(zhǎng)多肽的N末端和/或C末端減去一個(gè)或多個(gè)氨基酸；或刪除、添加或在全長(zhǎng)多肽的N末端和/或C末端一處或多處減去一個(gè)或多個(gè)氨基酸。這些變異體可由，例如，基因多態(tài)性引起或人為操縱所致，這樣的操縱方法為本領(lǐng)域所廣泛知曉。例如，SEQ ID NO1的氨基酸序列變異體可以通過(guò)突變編碼多肽的DNA來(lái)制備。突變及改變核苷酸序列的方法為本領(lǐng)域所廣泛知曉。見(jiàn)，例如，Kunkel，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，488(1985)；Kunkel等，Methods in Enzymol.，154367(1987)；美國(guó)專利號(hào)4,873,192；Walker and Gaastra，eds.，Techniques in Molecular Biology.MacMillan Publishing Company，NewYork(1983)和這里引用的參考。合適的氨基酸取代的指南可以在Dayhoff等的Atlas of Protein Sequence and Structure，Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，C.D.(1978)模型中找到，這里通過(guò)引用結(jié)合于此。保守性取代，如用一個(gè)性質(zhì)相似的氨基酸取代另一個(gè)氨基酸為優(yōu)選。例如，用一個(gè)疏水氨基酸取代另一個(gè)，或用一個(gè)親水氨基酸取代另一個(gè)。常規(guī)的篩選試驗(yàn)可用來(lái)確定取代后的來(lái)自SEQ ID NO1的多肽或肽片段用于動(dòng)物后是否能產(chǎn)生免疫反應(yīng)。這種篩選試驗(yàn)的例子為本領(lǐng)域所熟知，包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、放射免疫試驗(yàn)、鉻釋放試驗(yàn)和類似試驗(yàn)，這些試驗(yàn)在Harlow et al.，AntibodiesALaboratory Manual，page 319(Cold Spring Harbor Pub.1988)上已有描述。
本發(fā)明提供本發(fā)明的多肽或肽片段的肽模擬物，肽模擬物為肽類似物，正如那些制藥業(yè)常用的、特性類似于其模板肽的非肽類藥物(Fauchere，J.，Adv.Drug Res.，1529(1986)和Evans等，J.Med.Chem.，301229(1987))。肽模擬物在結(jié)構(gòu)上與多肽或肽片段類似，含有肽鍵、但有一個(gè)或多個(gè)肽聯(lián)鍵通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法被--CH2NH--、--CH2S--、--CH2--CH2--、--CH＝CH--(順和反式)、--COCH2--、--CH(OH)CH2--和--CH2SO--這樣的聯(lián)鍵任選取代。肽模擬物相對(duì)自然多肽的優(yōu)勢(shì)包括更經(jīng)濟(jì)地生產(chǎn)、更大的穩(wěn)定性、改變了的特異性和加強(qiáng)了的藥學(xué)特性，如半衰期、吸收性、強(qiáng)度和效果。
本發(fā)明的多肽、肽片段、偶聯(lián)蛋白和肽模擬物可以通過(guò)在其氨基和/或羧基端添加封閉劑進(jìn)行修飾以降低在體內(nèi)的降解而用于體內(nèi)。這種做法在多肽進(jìn)入細(xì)胞前其末端傾向于被蛋白酶降解的情況下會(huì)有用。這樣的封閉劑包括但不限于可以被連接到將要使用的多肽、肽片段、偶聯(lián)蛋白和肽模擬物的外加的相關(guān)或非相關(guān)的肽序列，這可以通過(guò)普通技術(shù)人員所熟悉的方法，用化學(xué)方法在多肽、肽片段或偶聯(lián)蛋白的合成過(guò)程中完成，或用重組DNA技術(shù)來(lái)完成?？蛇x性的，封閉劑如焦谷氨酸和其他本領(lǐng)域所知的分子可以被連接到氨基端和/或羧基端殘基上，或氨基端和/或羧基端殘基的氨基基團(tuán)可以被不同的分子取代，因此，本發(fā)明提供氨基端和羧基端殘基被封閉的多肽或肽片段。
本發(fā)明的多肽或肽片段引發(fā)免疫反應(yīng)的能力可以通過(guò)許多本領(lǐng)域認(rèn)可的方法來(lái)測(cè)試，例如，它們誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生的能力和刺激細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞反應(yīng)的能力。
本發(fā)明的多肽和肽片段可以被用于篩選試驗(yàn)以鑒別或分離與本發(fā)明的多肽或肽片段、或SARS-CoV的刺突蛋白結(jié)合的抗體。例如，多肽或肽片段可以用于噬菌體表面展示技術(shù)試驗(yàn)來(lái)分離與多肽或肽片段結(jié)合的抗體。在另一個(gè)例子中，本發(fā)明的多肽和肽片段被結(jié)合到一個(gè)抗體可以接觸到的固體支持體上，這樣，能夠與多肽和肽片段結(jié)合的抗體就被固定到了固體支持體上，這些抗體過(guò)后可以從固體支持體上洗脫下來(lái)。本發(fā)明的多肽和肽片段可以通過(guò)本領(lǐng)域所知的其他許多方法用于分離抗體。
可以用于本發(fā)明的偶聯(lián)蛋白、多肽或肽片段的小規(guī)?；虼笠?guī)模生產(chǎn)的表達(dá)系統(tǒng)包括但不限于被含有本發(fā)明的核酸片段的重組核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化了的細(xì)胞或微生物。重組核酸構(gòu)建體的例子包括細(xì)菌噬菌體DNA、質(zhì)粒DNA、黏粒DNA或病毒表達(dá)載體?？梢员晦D(zhuǎn)化的細(xì)胞和微生物的實(shí)例包括細(xì)菌(例如，大腸桿菌或枯草芽孢桿菌)；酵母(例如，酵母屬和畢赤酵母)；昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)(例如，桿狀病毒)；植物細(xì)胞系統(tǒng)；哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)(例如，COS，CHO，BHK，293，VERO，HeLa，MDCK，W138，和NIH 3T3細(xì)胞)?？捎米魉拗骷?xì)胞的還有轉(zhuǎn)染有質(zhì)粒載體或感染有病毒載體的直接從哺乳動(dòng)物來(lái)源的原代或次代細(xì)胞。合適的表達(dá)載體的例子其中包括但不限于質(zhì)粒和病毒載體，如皰疹病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、牛痘病毒、減毒牛痘病毒、金絲雀痘病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒、慢病毒和皰疹病毒。合成的方法也可用來(lái)生產(chǎn)本發(fā)明的多肽和肽片段，已知這些方法并已有報(bào)道，見(jiàn)Merrifield，Science，852149(1963)。
II.本發(fā)明的核酸片段、表達(dá)盒和核酸構(gòu)建體本發(fā)明提供編碼本發(fā)明的多肽、肽片段和偶聯(lián)蛋白的分離的核酸片段。本發(fā)明的核酸片段也包括由于基因密碼子的簡(jiǎn)并性而編碼同樣氨基酸的片段，例如，氨基酸蘇氨酸由ACU，ACC，ACA和ACG編碼，因此是簡(jiǎn)并性的。本發(fā)明有意包括編碼同樣氨基酸的多核苷酸片段的所有變異體。這樣的突變?yōu)楸绢I(lǐng)域所知(Watson等，Molecular Biology of the Gene，Benjamin Cummings 1987)，突變也包括改變后的核酸片段轉(zhuǎn)而編碼保守性氨基酸，例如，異亮氨酸被亮氨酸取代和類似取代，這樣的突變?yōu)楸绢I(lǐng)域所知。如此，本發(fā)明的基因和核苷酸序列包括自然發(fā)生的序列和突變序列二者。
本發(fā)明的核酸片段可以含于載體上，載體可以包括但不限于任何質(zhì)粒、噬粒、F-因子、病毒、黏?；螂p鏈或單鏈線狀和環(huán)狀的可以或不可以自我滲透或移動(dòng)的噬菌體。載體也可通過(guò)整合入細(xì)胞基因組或以染色體外存在的形式(即含有復(fù)制區(qū)的自主復(fù)制質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化原核或真核宿主。
優(yōu)選地，載體上的核酸片段在合適的啟動(dòng)子或其他調(diào)節(jié)元件的控制之下或被操作性的連接到啟動(dòng)子或其他調(diào)節(jié)元件以在體外或宿主細(xì)胞如真核細(xì)胞或微生物，如細(xì)菌內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。載體可以是能在多種宿主內(nèi)行使功能的穿梭載體，載體還可以是典型地含有一個(gè)或幾個(gè)限制性酶切位點(diǎn)、外源DNA能以確定的方式插入的克隆載體，這樣的插入不會(huì)造成克隆載體的基本生物學(xué)功能的喪失?？寺≥d體也可以含有適用于對(duì)該載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞進(jìn)行鑒別和篩選的標(biāo)記基因，標(biāo)記基因的例子有四環(huán)素和氨芐青霉素抗性基因。許多克隆載體從市場(chǎng)上可以買到(Stratagene，New England Biolabs，Clonetech)。
本發(fā)明的核酸片段也可被插入表達(dá)載體。典型的表達(dá)載體含有編碼細(xì)菌復(fù)制區(qū)域的原核細(xì)胞DNA元件和用于擴(kuò)增和篩選細(xì)菌宿主內(nèi)的表達(dá)載體的抗生素抗性基因；含有控制啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)元件如啟動(dòng)子；含有控制轉(zhuǎn)錄子的加工的DNA元件如內(nèi)含子或轉(zhuǎn)錄終止/多聚腺苷酸化序列。
本領(lǐng)域有現(xiàn)成的將核酸片段裝入載體的方法(Sambrook等，Molecular CloningA Laboratory Manual，3rd edition，Cold SpringHarbor Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(2001))，簡(jiǎn)單地講，將待插入核酸片段的載體用一種或多種限制性酶(限制性內(nèi)切酶)處理，產(chǎn)生含有平末端、帶5′或3′懸余“粘”末端或它們的任何組合的線性載體。載體可以用限制性酶處理后，再用修飾酶，如聚合酶、內(nèi)切酶、去磷酸化酶或激酶處理，以得到一個(gè)具有有利于將核酸片段連接入載體的特征的線性載體。待插入載體的核酸片段用一種或多種限制性酶(限制性內(nèi)切酶)處理，產(chǎn)生含有平末端、帶5′或3′懸余的“粘”末端或它們的任何組合的線性片段。核酸片段也可以用限制性酶處理后，繼而用其他DNA修飾酶處理，這些DNA修飾酶包括、但不限于聚合酶、內(nèi)切酶、去磷酸化酶或激酶，以得到一個(gè)具有有利于將核酸片段連接入載體的特征的核酸片段。
然后，用本領(lǐng)域可用的方法(Sambrook等，Molecular CloningALaboratory Manual，3rd edition，Cold Spring Harbor Press，Cold SpringHarbor，N.Y.(2001))，將經(jīng)過(guò)處理的載體和核酸片段連接到一起形成含有核酸片段的構(gòu)建體。簡(jiǎn)單地講，被處理過(guò)的核酸片段和被處理過(guò)的載體在有合適的緩沖液和連接酶存在的條件被混合在一起，然后在適宜的條件下進(jìn)行孵育，以允許連接酶將核酸片段連接到載體上。
本發(fā)明也提供含有能夠在體外或宿主細(xì)胞內(nèi)指導(dǎo)本發(fā)明的特殊核酸片段表達(dá)的核酸序列的表達(dá)盒，如SEQ ID NO2。同時(shí)，本發(fā)明的核酸片段也可被插入表達(dá)盒以產(chǎn)生一個(gè)反義信息。表達(dá)盒為一個(gè)獨(dú)立的單元，可以為線狀并能用于體外轉(zhuǎn)錄和翻譯試驗(yàn)。進(jìn)行這些試驗(yàn)的材料和方法從Promega Corp.(Madison，Wisconsin)公司購(gòu)得。例如，體外轉(zhuǎn)錄可以將核酸序列置于T7啟動(dòng)子的控制之下，然后用T7聚合酶開始體外轉(zhuǎn)錄。這些轉(zhuǎn)錄子可以通過(guò)加入兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物進(jìn)行翻譯。任選性地，表達(dá)盒可被裝入載體而在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制和括增，或在體外轉(zhuǎn)錄和翻譯核酸片段。
這樣的表達(dá)盒可以含有一個(gè)或多個(gè)限制性位點(diǎn)，允許核酸片段被置于調(diào)節(jié)序列的調(diào)節(jié)之下。表達(dá)盒也可含有操作性地連接到核酸片段的終止信號(hào)和核酸片段正常翻譯所需的調(diào)節(jié)序列。表達(dá)盒所含核酸片段可以是嵌合型的，即它的一個(gè)組分相對(duì)于它的至少其他一個(gè)組分來(lái)說(shuō)是外源性的。表達(dá)盒可以是天然的但以重組的形式獲得以方便外源基因的表達(dá)。核酸片段在表達(dá)盒中的表達(dá)可以受組成型啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制，誘導(dǎo)型啟動(dòng)子只有在宿主細(xì)胞暴露于特殊的外源刺激物時(shí)才啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄。
表達(dá)盒可以包括5′-3′方向的轉(zhuǎn)錄，一個(gè)轉(zhuǎn)錄和翻譯啟動(dòng)區(qū)，一個(gè)核酸片段和一個(gè)在體外和/或體內(nèi)發(fā)揮功能的轉(zhuǎn)錄和翻譯終止區(qū)。該終止區(qū)可以是轉(zhuǎn)錄起始區(qū)天然所有，可以是核酸片段天然所有，或是從其他來(lái)源所得。
調(diào)節(jié)序列可以包括、但不限于增強(qiáng)子、啟動(dòng)子、阻遏子結(jié)合位點(diǎn)、翻譯前導(dǎo)序列、內(nèi)含子和多聚腺苷酸信號(hào)序列。它們可以包括天然的和合成的序列以及天然與合成序列的聯(lián)合序列。調(diào)節(jié)序列不限于啟動(dòng)子，一些調(diào)節(jié)序列包括組成型啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、調(diào)節(jié)型啟動(dòng)子、組織特異型啟動(dòng)子、病毒啟動(dòng)子和合成啟動(dòng)子。
啟動(dòng)子是一段核酸序列，通過(guò)提供RNA聚合酶和其他轉(zhuǎn)錄所必須的識(shí)別位點(diǎn)控制編碼序列的表達(dá)。啟動(dòng)子包括一個(gè)最小啟動(dòng)子，含所有最基本的起始轉(zhuǎn)錄所必須的元件，如TATA盒和/或起始子，起始子為一段短DNA序列，含TATA盒和標(biāo)示轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的其他序列，調(diào)節(jié)元件與其結(jié)合以控制表達(dá)。啟動(dòng)子可以完全來(lái)源于一個(gè)天然基因，或由來(lái)自不同的天然啟動(dòng)子的不同元件組成，甚至由合成的DNA片段組成。啟動(dòng)子可以含與蛋白因子結(jié)合的序列，該類蛋白因子能對(duì)物理或發(fā)育條件作出反應(yīng)而控制轉(zhuǎn)錄起始的有效性。
本發(fā)明提供含有載體和表達(dá)盒的構(gòu)建體。載體可以選自、但不限于任何前面已描述過(guò)的載體?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域所知的方法和前面描述過(guò)的方法(Sambrook等，Molecular CloningA Laboratory Manual，3rd edition，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(2001))將表達(dá)盒插入載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)盒的調(diào)節(jié)序列可以來(lái)源于該表達(dá)盒插入的載體以外。在另一個(gè)實(shí)施方案中，含有載體和表達(dá)盒的構(gòu)建體的形成是將本發(fā)明的核酸片段插入自身帶有調(diào)節(jié)序列的載體，于是，當(dāng)核酸片段插入載體時(shí)表達(dá)盒得以形成。帶有調(diào)節(jié)序列的載體可以在市場(chǎng)上購(gòu)得，其使用方法為本領(lǐng)域所知。
III.本發(fā)明的免疫組合物和疫苗本發(fā)明提供用于動(dòng)物體后能夠產(chǎn)生抗病原學(xué)上與嚴(yán)重急性呼吸道綜合征有關(guān)的病毒的免疫反應(yīng)的免疫組合物和疫苗。免疫反應(yīng)可以是體液免疫反應(yīng)或細(xì)胞免疫反應(yīng)。
本發(fā)明的免疫組合物可以包括佐劑和核酸、多肽、肽片段、肽模擬物、偶聯(lián)蛋白和免疫肽或它們的任何聯(lián)合。免疫組合物可以含有與本發(fā)明的多肽、肽片段、肽模擬物、偶聯(lián)蛋白和免疫肽以非化學(xué)方法連接的佐劑。免疫組合物可以含有與本發(fā)明的多肽、肽片段、肽模擬物、偶聯(lián)蛋白和免疫肽以化學(xué)方法連接的佐劑。本發(fā)明的免疫組合物也可含有藥學(xué)上可接受的稀釋液或載體。
免疫組合物可以通過(guò)常規(guī)的方法制備，特別是，組合物中的核酸、多肽、肽片段、肽模擬物、偶聯(lián)蛋白和免疫肽或它們的任何聯(lián)合可以與藥學(xué)上可接受的稀釋液或載體結(jié)合。藥學(xué)上可接受的稀釋液或載體的例子包括水或鹽溶液，如磷酸鹽緩沖液(PBS)。通常，根據(jù)給藥的方式和途徑以及標(biāo)準(zhǔn)的藥學(xué)實(shí)踐來(lái)選擇藥學(xué)上可接受的稀釋液。藥學(xué)上可接受的稀釋液和載體以及所有那些藥學(xué)組合物必需用到的東西在本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)參考書Remington′s PharmaceuticalSciences中有描述。
免疫組合物可以含有這里描述的和本領(lǐng)域所知的佐劑。鋁化合物可以被用作佐劑，這些鋁化合物包括氫氧化鋁、磷酸鋁、氫氧化磷酸鋁及其類似物。核酸、多肽、肽片段、肽模擬物、偶聯(lián)蛋白和免疫肽或它們的任何聯(lián)合可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的方法吸附或沉淀于鋁化合物。其他佐劑包括聚磷腈(WO 95/2415)，DC-chol(3-β-[N-(N′，N′-二甲基氨基甲烷)氨基甲?；鵠膽固醇)(美國(guó)專利號(hào)5,283,185和WO96/14831)，QS-21(WO 88/9336)和來(lái)自ImmunoChem(Hamilton，Montana)的RIBI。含非甲基化的CpG二核苷酸(″CpG″)的免疫刺激性寡核苷酸在本領(lǐng)域已知被用作系統(tǒng)或粘膜給藥的佐劑(WO 96/02555，EP 468520，等，J.Immunol.，160870(1998)；McCluskie和Davis，J.Immunol.，1614463(1998)。當(dāng)CpG被配制進(jìn)免疫組合物或疫苗時(shí)，通常在自由溶液中與自由抗原一起給藥。Immunol.，1614463(1998))或與抗原共價(jià)連接(PCT Publication No.WO 98/16247)，或與載體如氫氧化鋁配制后給藥。(Brazolot-Millan et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，9515553(1998)).
本發(fā)明也提供包括本發(fā)明的核酸、多肽、肽片段、肽模擬物、偶聯(lián)蛋白和免疫肽或它們的任何聯(lián)合的疫苗。這些疫苗可以用這里所描述的方法或疫苗領(lǐng)域所知的方法配制。例如，可以根據(jù)本領(lǐng)域所知的方法構(gòu)建出表達(dá)本發(fā)明的多肽、肽片段或偶聯(lián)蛋白的病毒疫苗，用作病毒載體的例子可以包括腺病毒、皰疹病毒、牛痘病毒、金絲雀皰疹病毒和類似病毒。疫苗也可被制成脂質(zhì)體，其配制方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知。見(jiàn)，LiposomesA Practical Approach.RRCNew Ed，IRL press(1990)。
本發(fā)明也提供表達(dá)本發(fā)明的多肽、肽片段或偶聯(lián)蛋白的基于核酸的疫苗。例如核酸疫苗可表達(dá)SEQ ID NO1、13、14、15、20-59、61-63多肽或SEQ ID NO1的片段。用編碼本發(fā)明的多肽、肽片段或偶聯(lián)蛋白的核酸構(gòu)建體接種動(dòng)物可以誘導(dǎo)出對(duì)被編碼抗原的體液或細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，它被認(rèn)為是骨髓來(lái)源的專業(yè)抗原遞呈細(xì)胞被核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)染，被編碼抗原經(jīng)轉(zhuǎn)錄和翻譯生成誘導(dǎo)特異性反應(yīng)的免疫源性多肽所致。核酸疫苗的一個(gè)特征是它能誘導(dǎo)出很強(qiáng)的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)反應(yīng)。這種反應(yīng)是由于核酸編碼的多肽在被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞內(nèi)合成的緣故。此外，在細(xì)菌內(nèi)生產(chǎn)的核酸構(gòu)建體富含能被巨噬細(xì)胞認(rèn)作外來(lái)物質(zhì)的非甲基化的CpG核苷酸，因此，巨噬細(xì)胞誘發(fā)能夠強(qiáng)化繼發(fā)免疫的天然免疫，所以，核酸疫苗即使在無(wú)佐劑的情況下也很有效。
將表達(dá)盒直接注射入活宿主細(xì)胞，使許多細(xì)胞得以轉(zhuǎn)化從而表達(dá)被導(dǎo)入的核酸和表達(dá)基因產(chǎn)物。被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可以將表達(dá)的抗原片段傳呈到細(xì)胞表面與I類和II類主要組織相容抗原結(jié)合成復(fù)合物。
在將核酸構(gòu)建體注射動(dòng)物、包括人前，通過(guò)誘導(dǎo)肌肉降解可以更有效地將核酸構(gòu)建體導(dǎo)入細(xì)胞(Vitadello等，Hum.Gene.Ther.，511(1994)；Danko and Wolff，Vaccine，121499(1994)；Davis等，Hum.Gene.Ther.，4733(1993))。例如，這樣的處理被認(rèn)為可以提高轉(zhuǎn)染效率到40倍。兩種最常用的肌肉壞死劑(myonecrotic)是局部麻醉藥布比卡因和心臟毒素(Danko and Wolff，Vaccine，121499(1994)；Davis等，Hum.Gene.Ther，4733(1993))。其他許多技術(shù)也被用于將核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)導(dǎo)入肌肉中，這些技術(shù)包括逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體和脂質(zhì)體。但是，對(duì)于外源核酸的轉(zhuǎn)導(dǎo)和核酸在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)來(lái)說(shuō)，直接注射裸核酸是乎是這些導(dǎo)入機(jī)理中最有效的。
核酸構(gòu)建體可以與藥學(xué)上可接受的載體一起用藥。藥學(xué)上可接受的載體為生物學(xué)上相容的適合于用于人或其他哺乳動(dòng)物的介質(zhì)，如生理鹽水。治療有效量為核酸構(gòu)建體能夠在被給藥的動(dòng)物中引起免疫反應(yīng)的量(如，加強(qiáng)T細(xì)胞反應(yīng)或抗體產(chǎn)生)，正如醫(yī)療領(lǐng)域所熟知，對(duì)任何一個(gè)病人的劑量取決于許多因素，包括病人的身高、體表面積、年齡、所要使用的特殊化合物、性別、給藥時(shí)間和途徑、一般健康狀況和其他同時(shí)使用的藥物。劑量是可以變化的，但是核酸構(gòu)建體的優(yōu)選劑量約為106到1012拷貝的核酸構(gòu)建體。如果需要，該劑量可以重復(fù)給藥。
核酸構(gòu)建體的給藥可以有許多途徑，其例子包括肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、腸外、皮內(nèi)、鼻內(nèi)和皮下注射，這些途徑都曾在雞體內(nèi)引起抗流感病毒血凝素(HA)的免疫反應(yīng)(見(jiàn)Pardoll and Beckerkleg的綜述，Immunity 3(1995)，165-169)。基于核酸的疫苗也可通過(guò)聚合體、生物降解微粒或微囊導(dǎo)入載體，將其大小優(yōu)化到吞噬細(xì)胞、如巨噬細(xì)胞吞噬的最佳大小。例如，可以使用直徑為1-10μm的PLGA(poly-lacto-co-glycolide)微粒。核酸構(gòu)建體包裹在這些微粒中，被巨噬細(xì)胞吞噬并在細(xì)胞內(nèi)逐漸發(fā)生生物降解，于是釋放出核酸構(gòu)建體。一旦釋放出來(lái)，核酸構(gòu)建體會(huì)在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá)。另一個(gè)使核酸構(gòu)建體進(jìn)入細(xì)胞的途徑是通過(guò)使用脂質(zhì)體，脂質(zhì)體可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法制備。核酸構(gòu)建體可單獨(dú)、也可與組織特異性抗體一道結(jié)合于這些導(dǎo)入載體。可選性地，也可制備核酸構(gòu)建體通過(guò)靜電或共價(jià)力附著于多聚-L賴氨酸的偶聯(lián)分子，多聚-L-賴氨酸能夠與靶細(xì)胞上的受體的配體結(jié)合(Cristano等(1995)，J.Mol.Med.73，479)?？蛇x性地，淋巴組織特異靶向性可以通過(guò)使用淋巴組織特異的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件(TRE)來(lái)實(shí)現(xiàn)，如B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞或樹突狀細(xì)胞特異性TRE，淋巴細(xì)胞特異性TRE為已知(見(jiàn)Thompson等，Mol.Cell.Biol.，121043(1992)；Toll等J.Exp.Med.，1771663(1993)；Penix等，J.Exp.Med.，1781483(1993))。
本發(fā)明也提供基于微生物的疫苗。一般來(lái)講，這些疫苗涉及到被表達(dá)本發(fā)明的多肽、肽片段或偶聯(lián)蛋白的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化了的微生物。例如，單核細(xì)胞增生李斯特氏菌被用作載體誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫，因?yàn)樗芨腥究乖f呈細(xì)胞，而且因?yàn)槠涓腥緸檎衬じ腥?，?jiàn)Lieberman和Frankel，Vaccine，202007-10(2002)。所以，可以用多肽、肽片段或偶聯(lián)蛋白的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)染李斯特菌，去誘導(dǎo)針對(duì)引起嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合征的冠狀病毒的體液免疫反應(yīng)?？梢愿鶕?jù)本領(lǐng)域報(bào)道的方法制備高度減毒的李斯特菌，見(jiàn)Lieberman和Frankel，Vaccine，202007-10(2002)。沙門氏菌也可被用作載體誘導(dǎo)針對(duì)引起嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合征的冠狀病毒的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞反應(yīng)。見(jiàn)Pasetti等，Infect Immun.，704009(2002)。
免疫組合物或疫苗可以通過(guò)疫苗領(lǐng)域的常規(guī)途徑給藥。例如，免疫組合物或疫苗可以通過(guò)口服或靜脈滴注，或皮下、肌內(nèi)、腸道外、肛內(nèi)、陰道內(nèi)、鼻內(nèi)、胃腸道內(nèi)、氣管內(nèi)或心血管內(nèi)給藥。給藥途徑的選擇取決于諸多因素，如活性原理的性質(zhì)；多肽、肽片段、肽模擬物、偶聯(lián)蛋白、免疫肽、DNA疫苗的成分；或與以上提到的分子結(jié)合的佐劑。免疫組合物的給藥可以是單劑量的或一個(gè)劑量在一定時(shí)間內(nèi)一次或幾次給藥。合適的劑量根據(jù)因素的不同而變化，這些因素包括被處理的個(gè)體(成人或小孩)、免疫組合物或抗原本身、給藥的方式和頻率、有否佐劑、如有，佐劑的類型和預(yù)期的作用(如保護(hù)或治療)，將由本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)決定。
IV.本發(fā)明的抗體和適體本發(fā)明提供與SEQ ID NO1、13、14、15、20-59、60、61、62、63所示的氨基酸序列或SEQ ID NO1的片段、或其保守性變異體結(jié)合的抗體。這些抗體可以用于診斷、免疫預(yù)防和治療嚴(yán)重急性呼吸道綜合征(SARS)。在某些實(shí)施方案中，抗體與具SEQ ID NO58或59序列的肽結(jié)合。與肽P540(SEQ ID NO59)結(jié)合的抗體高度有效，即使在高倍稀釋后仍能檢測(cè)出刺突多肽。例如，P540抗體稀釋1∶10000倍后仍能檢測(cè)出刺突多肽。
抗體可以通過(guò)用完整的目的多肽或肽片段作為免疫抗原來(lái)制備。用于免疫的多肽或肽片段可以經(jīng)cDNA翻譯或經(jīng)合成而來(lái)。如有必要，多肽或肽片段可以結(jié)合到載體蛋白上，這些通常使用的以化學(xué)方式連接到肽上的載體蛋白包括匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)、甲狀腺球蛋白、牛血清白蛋白和破傷風(fēng)毒素。偶聯(lián)蛋白可以用于免疫動(dòng)物(如小鼠、大鼠或兔子)。
如有必要，多克隆或單克隆抗體可以進(jìn)一步被純化，例如，與結(jié)合有用于產(chǎn)生抗體的多肽或肽片段的基質(zhì)相結(jié)合，并從該基質(zhì)上洗脫下來(lái)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員懂得免疫領(lǐng)域常用的純化和/或濃縮多克隆抗體和單克隆抗體的技術(shù)(見(jiàn)Coligan等，Unit9，Current protocolin Immunology，Wiley Interscience，1991，通過(guò)引用結(jié)合)。
通過(guò)抗獨(dú)特型技術(shù)產(chǎn)生一個(gè)模擬抗原決定簇的單克隆抗體也是可能的。例如，抗第一單克隆抗體的抗獨(dú)特型將含有高變區(qū)的結(jié)合功能區(qū)，該功能區(qū)是第一單克隆抗體所結(jié)合的決定簇的“鏡影”。
適合與多肽或肽片段結(jié)合的抗體至少對(duì)多肽的某區(qū)域的一部分是特異的。例如，本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠用肽片段去產(chǎn)生本發(fā)明中合適的抗體。本發(fā)明的抗體包括多克隆抗體、單克隆抗體和多克隆和單克隆抗體的片段。
制備多克隆抗體為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知(見(jiàn)Green等，Production of Polyclonal Antisera，in Immunochemical Protocols(Manson，ed.)，pages 1-5(Humana Press 1992)；Coligan等，Productionof Polyclonal Antisera in Rabbits，Rats，Mice and Hamsters，in CurrentProtocols in Immunology，section 2.4.1(1992)，通過(guò)引用結(jié)合于此)。例如，多肽或肽片段被注射入宿主動(dòng)物，優(yōu)選地，根據(jù)預(yù)先決定的實(shí)施方案，再進(jìn)行一次或多次加強(qiáng)免疫，階段性對(duì)動(dòng)物進(jìn)行采血。抗多肽或肽片段的特異性抗體可以用結(jié)合有多肽或肽片段的合適的固體支持體進(jìn)行親和層析，從而將抗體從這些抗血清中純化出來(lái)。
單克隆抗體的制備同樣是常規(guī)性的(見(jiàn)Kohler & Milstein，Nature，256495(1975)；Coligan等，sections 2.5.1-2.6.7；和Harlow等，AntibodiesA Laboratory Manual，page 726(Cold Spring Harbor Pub.1988))，通過(guò)引用結(jié)合與此。簡(jiǎn)單地講，單克隆抗體可以通過(guò)用含有抗原的組合物注射小鼠，從采集的血清標(biāo)本中確認(rèn)抗體存在后，取其脾獲取B淋巴細(xì)胞，將B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合形成雜交瘤細(xì)胞，克隆雜交瘤細(xì)胞，篩選產(chǎn)生針對(duì)抗原的抗體的陽(yáng)性克隆，從雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)基中分離抗體。可以通過(guò)多種已知的方法從雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)基中分離純化抗體。這些分離技術(shù)包括用蛋白A瓊脂糖進(jìn)行親和層析、分子排阻層析和離子交換層析。(見(jiàn)Coligan等，sections 2.7.1-2.7.12和sections 2.9.1-2.9.3；Barnes等，Purification ofImmunoglobulin G(IgG)，in Methods in Molecular Biology，Vol.10，pages 79-104(Humana Press 1992))在體外和體內(nèi)擴(kuò)增單克隆抗體的方法為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知，體外擴(kuò)增可以在合適的培養(yǎng)基中，如Dulbecco’s Modified Eagle Medium和PRMI 1640培養(yǎng)基，適量加入哺乳動(dòng)物血清如胎牛血清和微量元素，并且加入維持生長(zhǎng)的補(bǔ)充物質(zhì)如正常小鼠的腹腔滲出細(xì)胞，脾細(xì)胞和骨髓巨噬細(xì)胞。體外生產(chǎn)提供相對(duì)純的抗體制劑，并可以加大規(guī)模以大量生產(chǎn)需要的抗體。大規(guī)模雜交瘤培養(yǎng)可以通過(guò)在氣升式反應(yīng)器、連續(xù)攪拌反應(yīng)器、或固定化或截留細(xì)胞培養(yǎng)來(lái)實(shí)現(xiàn)。體內(nèi)擴(kuò)增可以通過(guò)將細(xì)胞克隆注射入與父代細(xì)胞組織相容的哺乳動(dòng)物體內(nèi)，例如，osyngeneic小鼠體內(nèi)，使產(chǎn)生抗體的腫瘤得以生長(zhǎng)。任選注射前先用碳?xì)浠衔铮貏e是油類如四甲基十五烷激活動(dòng)物，一至三周后從動(dòng)物的體液中回收單克隆抗體。
抗體也可通過(guò)噬菌體表面展示技術(shù)來(lái)制備，在一個(gè)例子中，用抗原，如本發(fā)明的多肽或肽片段免疫一個(gè)生物體，從被免疫的生物體的脾內(nèi)分離淋巴細(xì)胞，從淋巴細(xì)胞中提取總RNA，含于總RNA中的mRNA被逆轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)的脫氧核糖核苷酸(cDNA)。編碼免疫球蛋白的輕鏈和重鏈可變區(qū)的cDNA用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)進(jìn)行括增，產(chǎn)生單鏈的抗體可變區(qū)片段(scFV)，輕鏈和重鏈的擴(kuò)增產(chǎn)物可以通過(guò)剪切重疊延伸PCR產(chǎn)生完整的序列然后連接入合適的載體中，用編碼scFV的載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，然后再用一個(gè)輔助噬菌體對(duì)其進(jìn)行轉(zhuǎn)染，產(chǎn)生表面上帶有抗體的噬菌體?？蛇x性地，為了產(chǎn)生一個(gè)完整的抗原結(jié)合片段(Fab)，重鏈擴(kuò)增產(chǎn)物可以與編碼噬菌體外膜蛋白的核酸序列融合，輕鏈括增產(chǎn)物可以克隆進(jìn)一個(gè)合適的載體中，用表達(dá)輕鏈括增產(chǎn)物的載體轉(zhuǎn)化表達(dá)與噬菌體外膜蛋白融合的重鏈的大腸桿菌，輕鏈和重鏈間的二硫鍵連接在大腸桿菌的外周胞質(zhì)中形成。該方法的結(jié)果是產(chǎn)生一個(gè)大至109克隆的抗體庫(kù)，抗體庫(kù)的大小還可以通過(guò)增加對(duì)來(lái)自相同或不同的生物體附加免疫的免疫反應(yīng)來(lái)括增到1018個(gè)噬菌體。識(shí)別特異性抗原的抗體可以通過(guò)淘選的方法來(lái)篩選，簡(jiǎn)單地說(shuō)，將完整的抗體庫(kù)暴露于期望能與抗體結(jié)合的固化的抗原，不產(chǎn)生與抗原結(jié)合的抗體的噬菌體將被洗去，表達(dá)與抗原結(jié)合的抗體的噬菌體將結(jié)合到固化的抗原上，這些噬菌體將被洗脫下來(lái)并在大腸桿菌內(nèi)括增?？梢灾貜?fù)該過(guò)程以富集表達(dá)與抗原特異性結(jié)合的抗體的噬菌體群。在分離出表達(dá)與抗原特異性結(jié)合的抗體的噬菌體后，含有編碼抗體的序列的載體可以從噬菌體顆粒中提取出來(lái)，再次被克隆進(jìn)一個(gè)合適載體以產(chǎn)生可溶性抗體。在另一個(gè)例子中，人噬菌體文庫(kù)可被用于篩選抗體，如與SARS-CoV的刺突蛋白結(jié)合的單克隆抗體。簡(jiǎn)單地講，從感染或未感染SARS-CoV的人體分離脾細(xì)胞，用以上描述和本領(lǐng)域所知的方法創(chuàng)建人噬菌體文庫(kù)，這些方法可以用來(lái)獲取與SARS-CoV的刺突蛋白結(jié)合的人單克隆抗體。噬菌體表面展示技術(shù)用于分離抗原和抗體的方法為本領(lǐng)域所知并已有描述(見(jiàn)Gram等，Proc.Natl.Acad.Sci.，893576(1992)；Kay等，Phage display of peptides and proteinsAlaboratory manual.San DiegoAcademic Press(1996)；Kermani等，Hybrid，14323(1995)；Schmitz等，Placenta，21Suppl.AS106(2000)；Sanna等，Proc.Natl.Acad.Sci.，926439(1995))。
本發(fā)明的抗體可以來(lái)自于“人源化”的單克隆抗體，人源化單克隆抗體通過(guò)將鼠免疫球蛋白的重鏈和輕鏈的互補(bǔ)決定區(qū)轉(zhuǎn)移到人的可變區(qū)，然后用人的殘基取代鼠框架區(qū)的殘基而得。來(lái)自人源化單克隆抗體的抗體成分的使用，避免了鼠恒定區(qū)的免疫源性引起的潛在問(wèn)題。有關(guān)克隆鼠免疫球蛋白可變區(qū)的一般技術(shù)已有描述(見(jiàn)Orlandi等，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA，863833(1989)通過(guò)引用整體結(jié)合于此)。產(chǎn)生人源化單克隆抗體的技術(shù)的描述見(jiàn)Jones等.，Nature，321522(1986)；Riechmann等，Nature，332323(1988)；Verhoeyen等，Science，2391534(1988)；Carter等，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA，894285(1992)；Sandhu，Crit.Rev.Biotech.，12437(1992)；和Singer等，J.Immunol.，1502844(1993)，它們通過(guò)引用結(jié)合于此。
另外，本發(fā)明的抗體可以來(lái)自人單克隆抗體，這些抗體從被基因工程技術(shù)改造過(guò)的能針對(duì)抗原刺激產(chǎn)生特異性的人抗體的轉(zhuǎn)基因鼠獲得。在這一技術(shù)中，人重鏈和輕鏈基因座被導(dǎo)入其內(nèi)源性重鏈和輕鏈的基因座被定向破壞了的胚胎干細(xì)胞來(lái)源的小鼠中，該轉(zhuǎn)基因鼠能合成人抗原特異的人抗體，該小鼠可以被用于生產(chǎn)分泌人抗體的雜交瘤細(xì)胞。從轉(zhuǎn)基因鼠獲取人抗體的方法被描述在Green等.，Nature Genet.，713(1994)；Lonberg等，Nature，368856(1994)；和Taylor等，Int.ImmunoL.6579(1994)，它們通過(guò)引用結(jié)合于此。
本發(fā)明的抗體片段可以通過(guò)蛋白酶水解抗體或通過(guò)編碼片段的DNA在大腸桿菌中的表達(dá)來(lái)制備?？梢酝ㄟ^(guò)常規(guī)的方法用胃蛋白酶或木瓜酶對(duì)完整抗體進(jìn)行消化來(lái)獲得抗體片段。例如，通過(guò)用胃蛋白酶切割抗體可以得到一個(gè)5S的F(ab)2片段，該片段用硫代還原因子進(jìn)一步切割，并可選性地用封閉基團(tuán)封閉由于二硫鍵被切割產(chǎn)生的巰基基團(tuán)，會(huì)產(chǎn)生3.5S的Fab單價(jià)片段?？蛇x性地，通過(guò)用胃蛋白酶切割也可直接產(chǎn)生兩個(gè)單價(jià)Fab和一個(gè)Fc片段。這些方法已有描述(見(jiàn)，美國(guó)專利號(hào)4,036,945；4,331,647；和6,342,221，和含于此的參考；Porter，Biochem.J.，73119(1959)；Edelman等，Methods in Enzymology，Vol.1，page 422(Academic Press 1967)和Coligan等at sections 2.8.1-2.8.10and 2.10.1-2.10.4)。
其他切割抗體的方法，如分離重鏈而形成單價(jià)輕鏈片段的方法，進(jìn)一步切割片段的方法，或其他酶學(xué)的、化學(xué)的或基因技術(shù)的方法也可使用，只要形成的片段能夠與完整抗體所識(shí)別的抗原結(jié)合。
例如，F(xiàn)v片段含連接在一起的VH和VL鏈，這種連接可以是非共價(jià)連接的(Inbar等，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA，692659(1972))，可變鏈可以可選性地通過(guò)分子內(nèi)二硫鍵連接或通過(guò)化學(xué)物質(zhì)如戊二醛交叉連接(Sandhu，Crit.Rev.Biotech.，12437(1992))。優(yōu)選Fv片段的VH和VL鏈通過(guò)肽鍵連接。這些單鏈抗原偶聯(lián)蛋白(sFv)可以通過(guò)構(gòu)建一個(gè)含編碼VH和VL鏈、中間以寡核苷酸相連的結(jié)構(gòu)基因，將該結(jié)構(gòu)基因插入表達(dá)載體，再將該載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，如大腸桿菌，該重組的宿主細(xì)胞即合成含有中間以連接肽相連的兩個(gè)V功能區(qū)的單一多肽鏈。有關(guān)產(chǎn)生sFvs的方法見(jiàn)描述(Whitlow等，MethodsACompanion to Methods in Enzymology，Vol.2，page 97(1991)；Bird等，Science，242423(1988)，Ladner等，U.S.patent No.4,946，778；Pack等，Bio/Technologv，111271(1993)和Sandhu，Crit.Rev.Biotech.，12437(1992)).抗體片段的另一種形式是形成單一互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的肽，CDR肽(“最小識(shí)別單位”)可以通過(guò)構(gòu)建編碼目標(biāo)抗體的基因來(lái)獲得。制備這樣的基因可以通過(guò)，例如，用聚合酶鏈反應(yīng)從抗體產(chǎn)生細(xì)胞的RNA中合成可變區(qū)(Larrick等，MethodsACompanion to Methods in Enzymology，Vol.2，page 106(1991))。
本發(fā)明的抗體可以與某種毒素結(jié)合，這樣的抗體可以用于治療感染了在病原學(xué)上與嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合征相關(guān)的病毒的動(dòng)物，包括人。例如，與在病原學(xué)上與嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合征相關(guān)聯(lián)的冠狀病毒的刺突蛋白結(jié)合的抗體被連接上破傷風(fēng)毒素，用于感染有上述病毒的動(dòng)物，結(jié)合有毒素的抗體與被感染細(xì)胞表面的刺突蛋白結(jié)合，然后將被感染細(xì)胞殺滅。
本發(fā)明的抗體可以與某種檢測(cè)標(biāo)記物結(jié)合，這樣的抗體可以用于診斷試驗(yàn)以確定動(dòng)物，如人，是否感染了SARS-CoV。檢測(cè)標(biāo)記物的例子有熒光蛋白(即綠色熒光蛋白、紅色熒光蛋白、黃色熒光蛋白)。熒光標(biāo)記(即熒光素異硫氰酸、羅丹明、德克薩斯紅)、放射標(biāo)記(即3H、32P、125I)、酶(β-半乳糖苷酶、辣根過(guò)氧化物酶、β-葡萄醛酸糖苷酶堿性磷酸酶)，或親和標(biāo)記(即親和素、生物素、鏈霉親和素)。抗體與檢測(cè)標(biāo)記物連接的方法為本領(lǐng)域所知。見(jiàn)Harlow等，AntibodiesA Laboratory Manual，page 319(Cold Spring HarborPub.1988)。
本發(fā)明也提供本發(fā)明多肽或肽片段的適體。本發(fā)明的適體可以是肽適體或核酸適體。肽適體為與本發(fā)明的多肽或肽片段結(jié)合的肽，其結(jié)合力常與單克隆抗體-抗原復(fù)合物相當(dāng)。類似，核酸適體為與本發(fā)明的多肽或肽片段有很強(qiáng)結(jié)合力的核酸，其結(jié)合力常與單克隆抗體-抗原復(fù)合物相當(dāng)。
在一個(gè)例子中，核酸適體可以通過(guò)使用隨機(jī)寡核苷酸序列文庫(kù)而分離得到。篩選該文庫(kù)以確定某一個(gè)寡核苷酸序列與本發(fā)明的S多肽和肽片段結(jié)合。結(jié)合的寡核苷酸從固化的多肽或肽片段上洗脫下來(lái)，然后用PCR進(jìn)行擴(kuò)增。該過(guò)程可以重復(fù)多次以篩選出對(duì)本發(fā)明的多肽和肽片段具有高結(jié)合力的適體。然后確定編碼該適體的核酸序列，并將其克隆進(jìn)入一個(gè)合適的載體中以有利于該適體的生產(chǎn)和保存。
肽適體可以通過(guò)mRNA展示篩選含有啟動(dòng)子、起始密碼子和編碼隨機(jī)肽的核酸序列的文庫(kù)來(lái)獲得。在某些實(shí)施方案中，該DNA文庫(kù)還含有編碼組氨酸標(biāo)記物的核酸片段。該文庫(kù)用合適的聚合酶，如T7RNA聚合酶進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄完成后一個(gè)含嘌呤霉素的多聚A接頭被加到新合成的mRNA的3’端。當(dāng)這些mRNA在體外翻譯后，新生成的肽與嘌呤霉素接頭共價(jià)連接形成mRNA-肽的融合分子。用Ni-NTA瓊脂糖和oligo-dT纖維素對(duì)mRNA-肽的融合分子進(jìn)行純化。再對(duì)融合分子的mRNA部分進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。然后，用雙鏈的DNA/RNA-肽融合分子與本發(fā)明的肽或肽片段共孵育，未結(jié)合的融合分子將被洗去，結(jié)合的融合分子從固化的肽或肽片段上洗脫下來(lái)，再用PCR進(jìn)行擴(kuò)增，該過(guò)程可以重復(fù)進(jìn)行以篩選出與本發(fā)明的肽或肽片段有高度結(jié)合力的適體。然后可確定編碼該適體的核酸序列，并將其克隆進(jìn)合適的載體。制備肽適體的方法已有描述(見(jiàn)(Wilson等，Proc.Natl.Acad.Sci.，983750(2001))。所以，本發(fā)明提供能夠識(shí)別本發(fā)明的肽和肽片段的適體。
V.本發(fā)明的藥用組合物本發(fā)明提供含有與SEQ ID NO1、13、14、15、20-59、60、61、62、63中所示的氨基酸序列或SEQ ID NO1的片段或它們的保守變異體結(jié)合的抗體以及藥學(xué)上可接受的載體的藥用組合物。在某些實(shí)施方案中，抗體與具有SEQ ID NO58或59序列的肽結(jié)合。與肽P540(SEQ ID NO59)結(jié)合的抗體高度有效，即使在高倍稀釋的條件下也能檢測(cè)出刺突多肽。例如，P540抗體在1∶10000倍稀釋的條件下仍然可以檢出刺突多肽。
本發(fā)明的藥用組合物可被制備成多種形式，包括片劑、硬或軟的明膠膠囊、水溶液劑、混懸液、脂質(zhì)體和其他緩釋制劑，如有形高分子膠。也可做成一種口服劑量制劑形式，使抗體在從胃內(nèi)排入腸道后釋放出來(lái)。這樣的制劑在美國(guó)專利號(hào)6,306,434上和含于本文的參考文獻(xiàn)中有描述。
口服的液體藥用組合物可以是這些形式，例如，水性或油性的混懸液、溶液、乳劑、糖漿或酏劑，或使用前用水或其他合適介質(zhì)調(diào)和后使用的干燥產(chǎn)品。這些液體藥用組合物可以含有常規(guī)添加劑，如懸浮劑、乳化劑、非水性介質(zhì)(它們可包括食用油)或防腐劑。
抗體可被做成腸外給藥的制劑(例如，通過(guò)注射，如一次性注射或連續(xù)滴注)，以單位劑量的形式裝于安瓿、預(yù)灌裝的注射器、小容量的滴注容器或多劑量的容器中，并加入保存劑。該藥用組合物可以是懸液、溶液、或油性或水性乳劑，并可以含有懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑這樣的成型劑。適合于肛內(nèi)用藥的制劑可被制備成單位劑量的栓劑。合適的載體包括本領(lǐng)域常用的鹽水和其他物質(zhì)。
對(duì)于吸入給藥，抗體可以用吹入器、霧化器、壓力包裝或方便的導(dǎo)入氣體噴霧的方式很容易地導(dǎo)入。壓力包裝可以帶有合適的推進(jìn)劑如二氯二氟甲烷、三氯一氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳和其他合適氣體。在用加壓氣霧劑的情況下，可以通過(guò)提供氣閥來(lái)導(dǎo)入計(jì)量量來(lái)確定劑量單位。
可選性地，對(duì)于吸入或吹入給藥，抗體可以是干粉形式的組合物，例如，調(diào)節(jié)劑和合適的干粉基質(zhì)如乳糖或淀粉的粉狀混合物。粉狀混合物可以以單位劑量的形式裝于膠囊和藥筒中，或例如明膠或泡罩包裝中，藥粉可以借助吸入器或吹入器從這些容器中給藥。對(duì)于鼻腔給藥，抗體可以通過(guò)液體噴霧，例如通過(guò)一個(gè)塑料噴霧器。
本發(fā)明的藥用組合物也可含有其他成份，如調(diào)味劑、著色劑、抗微生物劑或防腐劑。用于治療的抗體的量不僅將因?yàn)樗x載體不同而不同，而且會(huì)因用藥途徑、被治療的病情、病人的年齡和病人的狀況不同而不同，這是可以理解的。最終可能由醫(yī)療提供者決定合適劑量。另外，藥用組合物可以被制成單一單位劑量形式。
VI.針對(duì)嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合征的動(dòng)物的免疫、治療和診斷的方法本發(fā)明提供了免疫動(dòng)物以抵抗嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合征的方法。該方法涉及到給予動(dòng)物有效治療劑量的與SEQ ID NO1、13、14、15、20-59、60、61、62、63中所示的氨基酸序列或SEQ ID NO1的片段或它們的變異體結(jié)合的抗體；給予動(dòng)物有效治療劑量的免疫組合物；給予動(dòng)物有效治療劑量的病毒疫苗；給予動(dòng)物有效治療劑量的核酸疫苗。動(dòng)物可以是哺乳動(dòng)物，如人。給予疫苗和免疫組合物的方法在這里已有描述并且為本領(lǐng)域所知。
根據(jù)本發(fā)明，也可通過(guò)被動(dòng)免疫治療的方法治療感染了SARS-CoV的動(dòng)物。例如，將與SEQ ID NO1、13、14、15、20-59、60、61、62、63中所示的氨基酸序列或SEQ ID NO1的片段或它們的保守性變異體結(jié)合的抗體給予感染了SARS-CoV的動(dòng)物，如人。這樣的用藥方法可能適合于病人免疫受到抑制，不能調(diào)動(dòng)起有效的抗SARS-CoV免疫，或?qū)σ呙缁蛎庖呓M合物不反應(yīng)的情況。
本發(fā)明提供診斷動(dòng)物是否患有嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合征的方法，該方法涉及到用與SEQ ID NO1、13、14、15、20-59、60、61、62、63中所示的氨基酸序列或SEQ ID NO1的片段或它們的保守性變異體結(jié)合的抗體與來(lái)自該動(dòng)物的生物標(biāo)本接觸，如組織樣品、血、粘液或唾液，確定該抗體是否與生物樣品結(jié)合。利用抗體來(lái)檢測(cè)生物標(biāo)本中是否有抗原存在為本領(lǐng)域所熟知。簡(jiǎn)單地講，本發(fā)明的抗體可以被固定在一個(gè)表面，然后生物標(biāo)本與固化的抗體接觸以使標(biāo)本中的抗原與抗體結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物，可選性地洗滌標(biāo)本除去未結(jié)合的物質(zhì)，本發(fā)明的第二抗體結(jié)合有一個(gè)檢測(cè)標(biāo)記物，如酶或放射性標(biāo)記物，能與抗原抗體復(fù)合物結(jié)合使酶或放射性標(biāo)記物固定到表面。然后可檢測(cè)該檢測(cè)標(biāo)記物來(lái)決定生物標(biāo)本中是否含有抗原。在另一個(gè)例子中，生物標(biāo)本可以被固定于一個(gè)表面，然后，連接有檢測(cè)標(biāo)記物的本發(fā)明的抗體與固化的生物標(biāo)本接觸，并洗去未結(jié)合物質(zhì)，通過(guò)檢測(cè)檢測(cè)標(biāo)記物的存在以決定是否生物標(biāo)本中是否含有抗原。這些試驗(yàn)的例子為本領(lǐng)域所熟知，包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，放射性免疫試驗(yàn)和類似試驗(yàn)。
基于核酸的方法也可用于診斷嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合征。在一個(gè)例子中，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)可以被用于診斷SARS-CoV感染。簡(jiǎn)單地講，從動(dòng)物體內(nèi)獲得生物標(biāo)本如組織標(biāo)本、血液、粘液或唾液，用常規(guī)方法，如有機(jī)提取法提取標(biāo)本中的核酸，提取的核酸與能夠退火連接到編碼SARS蛋白的核酸序列的正向和反向引物、聚合酶、核苷酸和含有允許聚合酶以SARS核酸為模板延伸正向和反向引物的成份的典型緩沖液混合，然后檢測(cè)擴(kuò)增出的正向和反向引物之間的DNA的存在以確定標(biāo)本中是否含有SARS來(lái)源的核酸。核酸雜交技術(shù)，如Northern和Southern印跡也可用于檢測(cè)生物標(biāo)本中SARS核酸的存在。
VII.試劑盒本發(fā)明提供含有包裝材料和與SEQ ID NO1、13、14、15、45、46、或47、58、59、61、62、63中所示的氨基酸序列或SEQ ID NO1的片段或它們的保守性變異體結(jié)合的抗體的試劑盒。試劑盒可以含有注射器以將試劑盒內(nèi)的抗體注射給動(dòng)物，如人。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供含有包裝材料和與SEQ ID NO1、13、14、15、20-59、60、61、62、63中所示的氨基酸序列或SEQ ID NO1的片段或它們的保守性變異體結(jié)合的抗體的試劑盒，并被做成用于動(dòng)物，如人的制劑。在某些實(shí)施方案中，抗體與SEQ ID NO59的氨基酸序列結(jié)合。在其他實(shí)施方案中，抗體與SEQ ID NO58的氨基酸序列結(jié)合。這樣的試劑盒可以含有注射器以方便將試劑盒所含的抗體注射給動(dòng)物，如人。
本發(fā)明提供含有包裝物質(zhì)和含有編碼SEQ ID NO1、13、14、15、45、46、或47、58、59、61、62、63中所示的氨基酸序列或SEQID NO1的片段或它們的保守性變異體的DNA分子或表達(dá)載體的DNA疫苗。該試劑盒也可含有使用DNA疫苗的裝置(如注射器和基因槍)以方便將試劑盒內(nèi)含有的疫苗用于動(dòng)物，如人。
本發(fā)明也提供含有包裝物質(zhì)和包括具有SEQ ID NO1、13、14、15、45、46、或47、58、59、61、62、63中所示的氨基酸序列或SEQID NO1的片段或它們的保守性變異體的多肽的疫苗組合物。該試劑盒也可含有疫苗使用裝置(如注射器)以方便將試劑盒內(nèi)含有的疫苗用于動(dòng)物，如人。
本發(fā)明提供一個(gè)含有包裝物質(zhì)和具有SEQ ID NO1、13、14、15、45、46、或47、58、59、61、62、63中所示的氨基酸序列或SEQID NO1的片段或它們的保守性變異體的多肽、用于檢測(cè)SARS-CoV感染的試劑盒。多肽可以被固定在一個(gè)固體支持體上。這樣的試劑盒可以被用于檢測(cè)感染動(dòng)物或人的血清中直接抗SARS-CoV的抗體。該試劑盒也包含有檢測(cè)這些抗體與S多肽結(jié)合的方法。VIII.Tor2SARS-CoV病毒分離株的全長(zhǎng)的刺突(S)蛋白(氨基酸1-1255)的氨基酸序列MFIFLLFLTLTSGSDLDRCTTFDDVQAPNYTQHTSSMRGVYYPDEIFRSDTLYLTQDLFLPFYSNVTGFHTINHTFGNPVIPFKDGIYFAATEKSNVVRGWVFGSTMNNKSQSVIIINNSTNVVIRACNFELCDNPFFAVSKPMGTQTHTMIFDNAFNCTFEYISDAFSLDVSEKSGNFKHLREFVFKNKDGFLYVYKGYQPIDVVRDLPSGFNTLKPIFKLPLGINITFRAILTAFSPAQDIWGTSAAAYFVGYLKPTTFMLKYDENGTTTDAVDCSQNPLAELKCSVKSFEIDKGIYQTSNFRVVPSGDVVRFPNITNLCPFGEVFNATKFPSVYAWERKKISNCVADYSVLYNSTFFSTFKCYGVSATKLNDLCFSNVYADSFVVKGDDVRQIAPGQTGVIADYNYKLPDDFMGCVLAWNTRNIDATSTGNYNYKYRYLRHGKLRPFERDISNVPFSPDGKPCTPPALNCYWPLNDYGFYTTTGIGYQPYRVVVLSFELLNAPATVCGPKLSTDLIKNQCVNFNFNGLTGTGVLTPSSKRFQPFQQFGRDVSDFTDSVRDPKTSEILDISPCAFGGVSVITPGTNASSEVAVLYQDVNCTDVSTAIHADQLTPAWRIYSTGNNVFQTQAGCLIGAEHVDTSYECDIPIGAGICASYHTVSLLRSTSQKSIVAYTMSLGADSSIAYSNNTIAIPTNFSISITTEVMPVSMAKTSVDCNMYICGDSTECANLLLQYGSFCTQLNRALSGIAAEQDRNTREVFAQVKQMYKTPTLKYFGGFNFSQILPDPLKPTKRSF
IEDLLFNKVTLADAGFMKQYGECLGDINARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDDMIAAYTAALVSGTATAGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKQIANQFNKAISQIQESLTTTSTALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQAAPHGVVFLHVTYVPSQERNFTTAPAICHEGKAYFPREGVFVFNGTSWFITQRNFFSPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIINNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYVWLGFIAGLIAIVMVTILLCCMTSCCSCLKGACSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT(SEQ ID NO1)IX.全長(zhǎng)的刺突(S)蛋白(氨基酸1-3768)的核酸序列ATGTTTATTTTCTTATTATTTCTTACTCTCACTAGTGGTAGTGACCTTGACCGGTGCACCACTTTTGATGATGTTCAAGCTCCTAATTACACTCAACATACTTCATCTATGAGGGGGGTTTACTATCCTGATGAAATTTTTAGATCAGACACTCTTTATTTAACTCAGGATTTATTTCTTCCATTTTATTCTAATGTTACAGGGTTTCATACTATTAATCATACGTTTGGCAACCCTGTCATACCTTTTAAGGATGGTATTTATTTTGCTGCCACAGAGAAATCAAATGTTGTCCGTGGTTGGGTTTTTGGTTCTACCATGAACAACAAGTCACAGTCGGTGATTATTATTAACAATTCTACTAATGTTGTTATACGAGCATGTAACTTTGAATTGTGTGACAACCCTTTCTTTGCTGTTTCTAAACCCATGGGTACACAGACACATACTATGATATTCGATAATGCATTTAATTGCACTTTCGAGTACATATCTGATGCCTTTTCGCTTGATGTTTCAGAAAAGTCAGGTAATTTTAAACACTTACGAGAGTTTGTGTTTAAAAATAAAGATGGGTTTCTCTATGTTTATAAGGGCTATCAACCTATAGATGTAGTTCGTGATCTACCTTCTGGTTTTAACACTTTGAAACCTATTTTTAAGTTGCCTCTTGGTATTAACATTACAAATTTTAGAGCCATTCTTACAGCCTTTTCACCTGCTCAAGACATTTGGGGCACGTCAGCTGCAGCCTATTTTGTTGGCTATTTAAAGCCAACTACATTTATGCTCAAGTATGATGAAAATGGTACAATCACAGATGCTGTTGATTGTTCTCAAAATCCACTTGCTGAACTCAAATGCTCTGTTAAGAGCTTTGAGATTGACAAAGGAATTTACCAGACCTCTAATTTCAGGGTTGTTCCCTCAGGAGATGTTGTGAGATTCCCTAATATTACAAACTTGTGTCCTTTTGGAGAGGTTTTTAATGCTACTAAATTCCCTTCTGTC
TATGCATGGGAGAGAAAAAAAATTTCTAATTGTGTTGCTGATTACTCTGTGCTCTACAACTCAACATTTTTTTCAACCTTTAAGTGCTATGGCGTTTCTGCCACTAAGTTGAATGATCTTTGCTTCTCCAATGTCTATGCAGATTCTTTTGTAGTCAAGGGAGATGATGTAAGACAAATAGCGCCAGGACAAACTGGTGTTATTGCTGATTATAATTATAAATTGCCAGATGATTTCATGGGTTGTGTCCTTGCTTGGAATACTAGGAACATTGATGCTACTTCAACTGGTAATTATAATTATAAATATAGGTATCTTAGACATGGCAAGCTTAGGCCCTTTGAGAGAGACATATCTAATGTGCCTTTCTCCCCTGATGGCAAACCTTGCACCCCACCTGCTCTTAATTGTTATTGGCCATTAAATGATTATGGTTTTTACACCACTACTGGCATTGGCTACCAACCTTACAGAGTTGTAGTACTTTCTTTTGAACTTTTAAATGCACCGGCCACGGTTTGTGGACCAAAATTATCCACTGACCTTATTAAGAACCAGTGTGTCAATTTTAATTTTAATGGACTCACTGGTACTGGTGTGTTAACTCCTTCTTCAAAGAGATTTCAACCATTTCAACAATTTGGCCGTGATGTTTCTGATTTCACTGATTCCGTTCGAGATCCTAAAACATCTGAAATATTAGACATTTCACCTTGCGCTTTTGGGGGTGTAAGTGTAATTACACCTGGAACAAATGCTTCATCTGAAGTTGCTGTTCTATATCAAGATGTTAACTGCACTGATGTTTCTACAGCAATTCATGCAGATCAACTCACACCAGCTTGGCGCATATATTCTACTGGAAACAATGTATTCCAGACTCAAGCAGGCTGTCTTATAGGAGCTGAGCATGTCGACACTTCTTATGAGTGCGACATTCCTATTGGAGCTGGCATTTGTGCTAGTTACCATACAGTTTCTTTATTACGTAGTACTAGCCAAAAATCTATTGTGGCTTATACTATGTCTTTAGGTGCTGATAGTTCAATTGCTTACTCTAATAACACCATTGCTATACCTACTAACTTTTCAATTAGCATTACTACAGAAGTAATGCCTGTTTCTATGGCTAAAACCTCCGTAGATTGTAATATGTACATCTGCGGAGATTCTACTGAATGTGCTAATTTGCTTCTCCAATATGGTAGCTTTTGCACACAACTAAATCGTGCACTCTCAGGTATTGCTGCTGAACAGGATCGCAACACACGTGAAGTGTTCGCTCAAGTCAAACAAATGTACAAAACCCCAACTTTGAAATATTTTGGTGGTTTTAATTTTTCACAAATATTACCTGACCCTCTAAAGCCAACTAAGAGGTCTTTTATTGAGGACTTGCTCTTTAATAAGGTGACACTCGCTGATGCTGGCTTCATGAAGCAATATGGCGAATGCCTAGGTGATATTAATGCTAGAGATCTCATTTGTGCGCAGAAGTTCAATGGACTTACAGTGTTGCCACCTCTGCTCACTGATGATATGATTGCTGCCTACACTGCTGCTCTAGTTAGTGGTACTGCCACTGCTGGATGGACATTTGGTGCTGGCGCTGCTCTTCAAATACCTTT
TGCTATGCAAATGGCATATAGGTTCAATGGCATTGGAGTTACCCAAAATGTTCTCTATGAGAACCAAAAACAAATCGCCAACCAATTTAACAAGGCGATTAGTCAAATTCAAGAATCACTTACAACAACATCAACTGCATTGGGCAAGCTGCAAGACGTTGTTAACCAGAATGCTCAAGCATTAAACACACTTGTTAAACAACTTAGCTCTAATTTTGGTGCAATTTCAAGTGTGCTAAATGATATCCTTTCGCGACTTGATAAAGTCGAGGCGGAGGTACAAATTGACAGGTTAATTACAGGCAGACTTCAAAGCCTTCAAACCTATGTAACACAACAACTAATCAGGGCTGCTGAAATCAGGGCTTCTGCTAATCTTGCTGCTACTAAAATGTCTGAGTGTGTTCTTGGACAATCAAAAAGAGTTGACTTTTGTGGAAAGGGCTACCACCTTATGTCCTTCCCACAAGCAGCCCCGCATGGTGTTGTCTTCCTACATGTCACGTATGTGCCATCCCAGGAGAGGAACTTCACCACAGCGCCAGCAATTTGTCATGAAGGCAAAGCATACTTCCCTCGTGAAGGTGTTTTTGTGTTTAATGGCACTTCTTGGTTTATTACACAGAGGAACTTCTTTTCTCCACAAATAATTACTACAGACAATACATTTGTCTCAGGAAATTGTGATGTCGTTATTGGCATCATTAACAACACAGTTTATGATCCTCTGCAACCTGAGCTCGACTCATTCAAAGAAGAGCTGGACAAGTACTTCAAAAATCATACATCACCAGATGTTGATCTTGGCGACATTTCAGGCATTAACGCTTCTGTCGTCAACATTCAAAAAGAAATTGACCGCCTCAATGAGGTCGCTAAAAATTTAAATGAATCACTCATTGACCTTCAAGAATTGGGAAAATATGAGCAATATATTAAATGGCCTTGGTATGTTTGGCTCGGCTTCATTGCTGGACTAATTGCCATCGTCATGGTTACAATCTTGCTTTGTTGCATGACTAGTTGTTGCAGTTGCCTCAAGGGTGCATGCTCTTGTGGTTCTTGCTGCAAGTTTGATGAGGATGACTCTGAGCCAGTTCTCAAGGGTGTCAAATTACATTACACATAA(SEQ ID NO2)實(shí)施例1刺突蛋白的克隆編碼全長(zhǎng)刺突蛋白的核酸序列用重疊聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的方法獲得。含有刺突蛋白的重疊克隆從British Columbia Cancer Agency(Vancouver，British Columbia)獲得。以下引物在PCR反應(yīng)中被用于擴(kuò)增編碼全長(zhǎng)SARS-CoV刺突蛋白的核酸序列克隆1正向引物5′-AGTCGGA TCCGGT AGG CTT ATC ATT AGA G-3′(SEQ ID NO3)；反向引物5′-CCA TCA GGG GAG AAA GGC AC-3(SEQ ID NO4)。克隆2正向引物5′-GTG CCT TTC TCC CCT GAT GG-3′(SEQ ID NO5)；反向引物5′-GAA GAG CAG CGC CAG CAC C-3′(SEQ ID NO6)?？寺?正向引物5′-GGT GCT GGC GCT GCT CTT C-3′(SEQ IDNO7)；反向引物5′-A CTGTCT AGAGTT CGT TTA TGT GTAATG-3(SEQ ID NO8)。
通過(guò)重疊PCR擴(kuò)增以上引物對(duì)之間的核酸片段所產(chǎn)生的核酸片段含有與嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合征病原學(xué)相關(guān)的病毒(SARS-CoV)的刺突蛋白的1到1255個(gè)氨基酸殘基。帶有下劃線的引物序列代表用于將擴(kuò)增片段克隆到pCDN3(+)質(zhì)粒中的限制性酶BamH1和XbaI的酶切位點(diǎn)。
該全長(zhǎng)刺突蛋白基因的克隆如圖1所顯示，圖1顯示的是插入了編碼刺突蛋白全長(zhǎng)的核酸片段的pCDN3.1(+)載體被限制性酶酶切后的膠圖(道2BamH1和XbaI酶切；道3HindIII酶切)。
實(shí)施例2全長(zhǎng)刺突蛋白的氨基端片段(S1)和羧基端(S2)片段的產(chǎn)生用計(jì)算機(jī)分析確定刺突蛋白的氨基端(S1)和羧基端(S2)的潛在功能性分割點(diǎn)，S1和S2之間的分割點(diǎn)在SEQ ID NO1的758和761(758RNTR761)之間。PCR的方法被用于制備編碼刺突蛋白的氨基端片段(S1)和羧基端(S2)片段。
以下引物對(duì)，S1正向引物5′-AGTCGGA TCCGAC CGG TGCACC ACT TTT G-3′(SEQ ID NO9)，和S1反向引物5′-AGTCGGGCCCCTG TTC AGC AGC AAT ACC-3′(SEQ ID NO10)被用于制備編碼刺突蛋白的第17到757位氨基酸殘基的核酸片段。兩個(gè)限制性切點(diǎn)，BamHI和ApaI(兩個(gè)引物序列帶下劃線的部分)被用于克隆該編碼刺突蛋白基因的氨基端片段的核酸片段(S1)到pSecTaG2B質(zhì)粒中進(jìn)行表達(dá)。
以下引物對(duì)，S2正向引物5′-ACTG GGATCC GAA GTG TTCGCT CAA GTC-3′(SEQ ID NO11)，和S2反向引物5′-ACTGTCTAGA TTG CTC ATA TTT TCC C-3′(SEQ ID NO12)被用于PCR反應(yīng)以制備編碼刺突蛋白第762到1189位氨基酸殘基的核酸片段。兩個(gè)限制性切點(diǎn)，BamHI和XbaI(兩個(gè)引物序列帶下劃線的部分)被用于克隆該編碼刺突蛋白基因的羧基端片段的核酸片段(S2)到pCDN3.1(+)質(zhì)粒中進(jìn)行表達(dá)。
為了獲得含有第272到537位殘基的片段，以下引物對(duì)被用于PCR擴(kuò)增引物5′GATCGGATCCGGTACAATCACAG 3′(SEQ IDNO64)和引物5′GATCGGGCCCGACACACTGGTTC 3′(SEQ IDNO65)。該擴(kuò)增片段用BamHI和ApaI消化，并與用同樣的酶消化的pSecTag2B連接。全長(zhǎng)刺突蛋白的許多可溶性刺突蛋白片段的位置見(jiàn)圖1B中的圖解。
在某些情況下，編碼S的片段和全長(zhǎng)的S多肽的核酸的天然前導(dǎo)序列(刺突蛋白的第1到16位氨基酸，MFIFLLFLTLTSGSDL(SEQID NO60)被小鼠k鏈前導(dǎo)序列取代(METDTLLLWVLLLWVPGSTGD)(SEQ ID NO16)以促成分泌，正如以下所描述。
實(shí)施例3缺乏胞質(zhì)尾和跨膜區(qū)的完整可溶性刺突蛋白(sS)的獲得以下引物對(duì)被用于獲取編碼缺乏胞質(zhì)尾的含SEQ ID NO1的第17到1189位氨基酸的核酸片段S1正向引物5′-AGTC GGATCCGAC CGG TGC ACC ACT TTT G-3′(SEQ ID NO9)，和反向引物5′ACTGTCTAGATTG CTC ATA TTT TCC C-3′(SEQ ID NO12)。
實(shí)施例4刺突蛋白的氨基端和羧基端片段的表達(dá)通過(guò)用含有pSecTag2或pCDN3.1(+)質(zhì)粒和編碼氨基端(S1)、羧基端(S2)片段，或缺乏胞質(zhì)尾和跨膜區(qū)的SARS-CoV刺突蛋白片段的表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)染293或E6Vero細(xì)胞來(lái)進(jìn)行表達(dá)?？缒^(qū)的去除被認(rèn)為可導(dǎo)致多肽和肽片段在水溶液中可溶。然后將測(cè)試被編碼片段的表達(dá)效率。一旦用電泳分析得到陽(yáng)性信號(hào)，將建立一個(gè)穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。全長(zhǎng)的刺突蛋白和它的片段將根據(jù)常規(guī)的用于純化高度糖基化的蛋白的方法進(jìn)行純化，如晶狀體凝集素柱用于大量生產(chǎn)。得到的蛋白質(zhì)可溶性的S1(sS1)、可溶性的S2(sS2)和完整S(sS)將含有以下氨基酸序列。黑體字代表可以被切去的信號(hào)肽，分泌出的蛋白將不含有它。
刺突蛋白的可溶性氨基端片段的氨基酸序列(17-757位氨基酸)DRCTTFDDVQAPNYTQHTSSMRGVYYPDEIFRSDTLYLTQDLFLPFYSNVTGFHTINHTFGNPVIPFKDGIYFAATEKSNVVRGWVFGSTMNNKSQSVIIINNSTNVVIRACNFELCDNPFFAVSKPMGTQTHTMIFDNAFNCTFEYISDAFSLDVSEKSGNFKHLREFVFKNKDGFLYVYKGYQPIDVVRDLPSGFNTLKPIFKLPLGINITNFRAILTAFSPAQDIWGTSAAAYFVGYLKPTTFMLKYDENGTITDAVDCSQNPLAELKCSVKSFEIDKGIYQTSNFRVVPSGDVVRFPNITNLCPFGEVFNATKFPSVYAWERKKISNCVADYSVLYNSTFFSTFKCYGVSATKLNDLCFSNVYADSFVVKGDDVRQIAPGQTGVIADYNYKLPDDFMGCVLAWNTRNIDATSTGNYNYKYRYLRHGKLRPFERDISNVPFSPDGKPCTPPALNCYWPLNDYGFYTTTGIGYQPYRVVVLSFELLNAPATVCGPKLSTDLIKNQCVNFNFNGLTGTGVLTPSSKRFQPFQQFGRDVSDFTDSVRDPKTSEILDISPCAFGGVSVITPGTNASSEVAVLYQDVNCTDVSTAIHADQLTPAWRIYSTGNNVFQTQAGCLIGAEHVDTSYECDIPIGAGICASYHTVSLLRSTSQKSIVAYTMSLGADSSIAYSNNTIAIPTNFSISITTEVMPVSMAKTSVDCNMYICGDSTECANLLLQYGSFCTQLNRALSGIAAEQ(SEQ IDNO13)刺突蛋白的可溶性羧基端片段的氨基酸序列(762-1189位氨基酸)
EVFAQVKQMYKTPTLKYFGGFNFSQILPDPLKPTKRSFIEDLLFNKVTLADAGFMKQYGECLGDINARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDDMIAAYTAALVSGTATAGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKQIANQFNKAISQIQESLTTTSTALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQAAPHGVVFLHVTYVPSQERNFTTAPAICHEGKAYFPREGVFVFNGTSWFITQRNFFSPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIINNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQ(SEQ ID NO14)含有SEQ ID NO1的17-757位氨基酸和762-1189位氨基酸可溶性刺突蛋白的氨基酸序列(缺乏信號(hào)肽和潛在切割位點(diǎn))DRCTTFDDVQAPNYTQHTSSMRGVYYPDEIFRSDTLYLTQDLFLPFYSNVTGFHTINHTFGNPVIPFKDGIYFAATEKSNVVRGWVFGSTMNNKSQSVIIINNSTNVVIRACNFELCDNPFFAVSKPMGTQTHTMIFDNAFNCTFEYISDAFSLDVSEKSGNFKHLREFVFKNKDGFLYVYKGYQPIDVVRDLPSGFNTLKPIFKLPLGINITNFRAILTAFSPAQDIWGTSAAAYFVGYLKPTTFMLKYDENGTITDAVDCSQNPLAELKCSVKSFEIDKGIYQTSNFRVVPSGDVVRFPNITNLCPFGEVFNATKFPSVYAWERKKISNCVADYSVLYNSTFFSTFKCYGVSATKLNDLCFSNVYADSFVVKGDDVRQIAPGQTGVIADYNYKLPDDFMGCVLAWNTRNIDATSTGNYNYKYRYLRHGKLRPFERDISNVPFSPDGKPCTPPALNCYWPLNDYGFYTTTGIGYQPYRVVVLSFELLNAPATVCGPKLSTDLIKNQCVNFNFNGLTGTGVLTPSSKRFQPFQQFGRDVSDFTDSVRDPKTSEILDISPCAFGGVSVITPGTNASSEVAVLYQDVNCTDVSTAIHADQLTPAWRIYSTGNNVFQTQAGCLIGAEHVDTSYECDIPIGAGICASYHTVSLLRSTSQKSIVAYTMSLGADSSIAYSNNTIAIPTNFSISITTEVMPVSMAKTSVDCNMYICGDSTECANLLLQYGSFCTQLNRALSGIAAEQDEVFAQVK
QMYKTPTLKYFGGFNFSQILPDPLKPTKRSFIEDLLFNKVTLADAGFMKQYGECLGDINARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDDMIAAYTAALVSGTATAGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKQIANQFNKAISQIQESLTTTSTALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQAAPHGVVFLHVTYVPSQERNFTTAPAICHEGKAYFPREGVFVFNGTSWFTTQRNFFSPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIINNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQ(SEQ ID NO15)實(shí)施例5刺突蛋白的附加可溶性片段的產(chǎn)生通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)獲得含有編碼SEQ ID NO1的第17-757位氨基酸的多肽的核酸序列。以下引物用于在PCR中擴(kuò)增該核酸序列正向引物5′AGCTGGA TCCGAC CGG TGC ACC ACTTTT G 3′(SEQ TD NO9)；和反向引物5′AGCTGGG CCCCTGTTC AGC AGC AAT ACC 3′(SEQ ID NO10)。該P(yáng)CR產(chǎn)物用BamHI和ApaI酶切，編碼與SEQ ID NO43氨基酸序列一致的多肽。被消化后的PCR產(chǎn)物與用同樣酶消化的pSecTag2B連接(Invitrogen，Carlsbad，California)。含有插入的PCR產(chǎn)物的pSecTag2B構(gòu)建體編碼多肽SEQ ID NO46，該多肽的氨基端含有鼠k鏈前導(dǎo)序列(METDTLLLWVLLLWVPGSTGD)(SEQ ID NO16)，羧基端含有用于親和層析純化的myc決定簇(EQKLISEEDL)(SEQ ID NO17)加組氨酸標(biāo)記物(HHHHHH)(SEQ ID NO18)。
通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)獲得含有編碼SEQ ID NO1的第17-276位氨基酸的多肽的核酸序列。以下引物用于在PCR中擴(kuò)增該核酸序列正向引物5′AGCTGGA TCCGAC CGG TGC ACC ACTTTT G3′(SEQ ID NO9)；反向引物5′CTAGCTC GAGCAA CAGCAT CTG TG 3′(SEQ ID NO19)。該P(yáng)CR產(chǎn)物用BamHI和XhoI酶切，編碼含有SEQ ID NO44氨基酸序列的多肽。被消化后的PCR產(chǎn)物與用同樣酶消化的pSecTag2B連接(Invitrogen，Carlsbad，California)。含有插入的PCR產(chǎn)物的pSecTag2B構(gòu)建體編碼多肽SEQID NO47，該多肽的氨基端含有鼠k鏈前導(dǎo)序列(METDTLLLWVLLLWVPGSTGD)(SEQ ID NO16)，羧基端含有用于親和層析純化的myc決定簇(EQKLISEEDL)(SEQ ID NO17)加組氨酸標(biāo)記物(HHHHHH)(SEQ ID NO18)。
編碼含有SEQ ID NO1第17-537位氨基酸的多肽的核酸序列通過(guò)消化編碼SEQ ID NO43(如以上所描述)的核酸序列而獲得，該核酸片段編碼含SEQ ID NO45的多肽。該核酸片段與用BamHI和EcoRV消化的pSecTag2B連接。含有插入的PCR產(chǎn)物的pSecTag2B構(gòu)建體編碼多肽SEQ ID NO48，該多肽的氨基端含有鼠k鏈前導(dǎo)序列(METDTLLLWVLLLWVPGSTGD)(SEQ ID NO16)，羧基端含有用于親和層析純化的myc決定簇(EQKLISEEDL)(SEQ ID NO17)加組氨酸標(biāo)記物(HHHHHH)(SEQ ID NO18)。
圖3顯示了這些多肽片段在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)，數(shù)據(jù)顯示這些肽片段可以被分泌到表達(dá)這些肽片段的細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中。圖3還顯示了肽片段在水溶液中可溶。
表1本發(fā)明的附加肽片段的實(shí)施例
實(shí)施例6刺突蛋白的結(jié)構(gòu)為了弄清SARS-CoVS蛋白的特性和功能，編碼全長(zhǎng)Tor2分離株的核酸被克隆進(jìn)以上描述的表達(dá)載體，該Tor2分離株在Marra等發(fā)表的The genome sequence of the SARS-associated coronavirus，Scienee 3001399-1404(2003)上有更多描述。得到的克隆包括含全長(zhǎng)S蛋白(1255個(gè)殘基)、去除了公認(rèn)的刺突蛋白的跨膜區(qū)和胞質(zhì)內(nèi)尾的僅含S蛋白的胞外區(qū)的氨基端胞外區(qū)Se(殘基17-1189)、含氨基端276(SEQ ID NO50)、537(SEQ ID NO52)和756(SEQ ID NO56)位氨基酸殘基(分別為S276，S537，和S756)并帶有16個(gè)殘基的信號(hào)序列或鼠k鏈前導(dǎo)序列的片段及含有第272-537位殘基(SEQ IDNO57)的內(nèi)部片段(S272-537)的克隆(見(jiàn)圖1B)。
氨基酸殘基758-761(RNTR)形成以下前體轉(zhuǎn)化酶切割的基序K/R-Xn-K/R其中X是任何氨基酸殘基，n＝0，2，4或6。
S1亞單位幾乎包含在S756片段中，大小與鼠冠狀病毒S1亞單位大小相符，如JHM株，其S1為769個(gè)殘基，人冠狀病毒OC43為778個(gè)殘基，見(jiàn)Gallagher &.Buchmeier，Coronavirns spike proteins inviral entry andpathogenesis，Virology 279371-374(2001)；Kunkel &Herrler，Structural and functional analysis of the surface protein of humancoronavirus OC43，Virology 195417195-202(1993)。但是，人冠狀病毒229E的S1被認(rèn)為由一個(gè)較短的含547個(gè)殘基的片段組成，與S537相對(duì)應(yīng)，見(jiàn)Bonavia等，Identification of a receptor-binding domain of thespike glycoprotein of human coronavirus HCoV-229E，J.Virol.772530-2538(2003)。
所有S糖蛋白片段和全長(zhǎng)S糖蛋白用SDS-PAGE膠電泳時(shí)其位置都明顯高于它們估計(jì)的分子量，提示這些多肽很可能進(jìn)行了翻譯后修飾。S276多肽的表觀分子量約為75kDa，S537的表觀分子量約為100-110kDa，S756的表觀分子量約為130-140kDa，Se和S的表觀分子量約為200kDa或更高(圖4和6)。這些多肽對(duì)應(yīng)的條帶在低曝光的情況下也較寬(圖6；一些數(shù)據(jù)未出示)。這些數(shù)據(jù)提示有明顯的糖基化發(fā)生，正如在S糖蛋白和其片段上觀察到的那樣?；趯?duì)分子量的大致估計(jì)，似乎S2亞單位不如S756(構(gòu)成S1亞單位)糖基化的程度高。值得注意的是，如果糖基化是唯一增加分子重量的因素的話，S276糖基化程度非常高。
從細(xì)胞培養(yǎng)上清中獲得的大多數(shù)SARS-CoV的S糖蛋白是未被切割的，雖然小蛋白形成的弱條帶在SDS-PAGE膠上能看到。其中一個(gè)弱條帶與S756在同一位置，提示非有效切割(圖4和6)。蛋白酶的隨機(jī)切割可能發(fā)生，需要進(jìn)一步的研究來(lái)確定S糖蛋白的切割是否為其功能所必需。
實(shí)施例7大腸桿菌中肽片段的表達(dá)編碼SEQ ID NO51肽片段的含SEQ ID NO1的第17-446位氨基酸殘基的核酸片段被克隆進(jìn)pRSET載體(Invitrogen，San Diego，CA)構(gòu)建成質(zhì)粒pRSET-S(17-446)，用pRSET-S(17-446)轉(zhuǎn)染大腸桿菌BL21DE3，用IPTG誘導(dǎo)，圖2顯示了誘導(dǎo)的結(jié)果。
實(shí)施例8用T7啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)被克隆的本發(fā)明的肽片段的表達(dá)轉(zhuǎn)染前一天，人293細(xì)胞和猴Vero E6細(xì)胞在5ml DMEM+10％FBS培養(yǎng)基中生長(zhǎng)到1.2×106細(xì)胞/T25培養(yǎng)瓶(60mm皿)，然后根據(jù)廠家提供的方法用Polyfect(Qiagen)轉(zhuǎn)染試劑盒，將含有編碼各種刺突蛋白肽片段的插入片段的pSecTag2B構(gòu)建體(各6μg)轉(zhuǎn)染入細(xì)胞，這些構(gòu)建體的制備如以上所描述。
轉(zhuǎn)染4小時(shí)后，以MOI(感染量)20的量用一個(gè)帶有T7聚合酶的牛痘病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞(見(jiàn)Fuerst等，Proc.Natl.Acad.Sci.，9311371(1986))，這一步驟是為pSecTag2B載體上的T7啟動(dòng)子提供用途而不是為弱很多的CMV啟動(dòng)子(Nussbaum等，J.Virol.，685411(1994))。感染后3小時(shí)，1.5ml新鮮培養(yǎng)基被加入細(xì)胞，并將細(xì)胞轉(zhuǎn)到31℃孵箱中培養(yǎng)。細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后，收集培養(yǎng)基。
在用任何一種S核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中均未觀察到(數(shù)據(jù)未出示)可測(cè)得的病理變化，提示全長(zhǎng)的和可溶性S糖蛋白片段可能沒(méi)有明顯的細(xì)胞毒性作用，然而，高水平表達(dá)時(shí)這種作用是可能的，并且以下描述的合胞體的形成有可能導(dǎo)致細(xì)胞死亡。
實(shí)施例9刺突特異性抗體用0.1mg的由計(jì)算機(jī)程序?qū)ζ涿庖咴赃M(jìn)行了篩選的各種多肽免疫新西蘭兔。從新西蘭兔獲得的血清用ELISA和Western印跡檢測(cè)其反應(yīng)性。由兩種肽免疫的兔的血清顯示出很高而且特異的抗刺突糖蛋白活性，它們被用于進(jìn)一步研究。名為D24和D540的抗體分別由肽DVQAPNYTQH TSSMRGC(SEQ ID NO58)和PSSKRFQPFQQFGRDC(SEQ ID NO59)誘導(dǎo)產(chǎn)生。另一個(gè)抗SARS-CoVS糖蛋白的多克隆抗體IMG-542，識(shí)別S糖蛋白的288-303氨基酸，從IMGENEX(San Diego，CA)購(gòu)得。
實(shí)施例10刺突蛋白的免疫沉淀和純化可溶性刺突多肽片段從Vero E6或293cell的培養(yǎng)基中獲得，但全長(zhǎng)的刺突糖蛋白只在細(xì)胞裂解物中發(fā)現(xiàn)。
收集轉(zhuǎn)染了編碼各種可溶性S片段的核酸的細(xì)胞的培養(yǎng)基，1000轉(zhuǎn)離心10分鐘去除細(xì)胞殘片，澄清的培養(yǎng)基與Ni-NTA瓊脂糖珠(Qiagen，Valencia，CA)或免疫沉淀抗體加糖蛋白G-瓊脂糖珠(Sigma，St.Louis，MO)4℃孵育2小時(shí)。然后珠子與同量的SDS膠樣品緩沖液混合，煮沸3分鐘，并進(jìn)行電泳分析。對(duì)于全長(zhǎng)的S糖蛋白，細(xì)胞首先用加有1％NP-40和0.5mM PMSF的PBS在4℃裂解1小時(shí)。然后14000轉(zhuǎn)/分在臺(tái)式Eppendorf離心機(jī)上離心20分鐘。澄清的裂解液首先用于免疫沉淀或直接用于Western印跡。
實(shí)施例11Western印跡和狹線印跡如上所述表達(dá)S糖蛋白的細(xì)胞首先用基于PBS的NP40裂解緩沖液裂解，殘片用離心方法澄清。對(duì)于可溶性S片段，收集培養(yǎng)基用上述方法澄清。對(duì)狹線印跡，澄清的裂解液和取自上清的培養(yǎng)基根據(jù)廠家(Bio-Rad，Hercules，CA)提供的方法直接用于在硝酸纖微素膜上印跡，然后如常規(guī)Western印跡的方法用抗體對(duì)膜進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)于Western印跡，抗c-Myc表位的單克隆抗體(Invitrogen，Carlsbad，C(A)或獲取自用刺突肽免疫的兔的抗刺突蛋白兔多可隆抗體用TBST緩沖液稀釋，抗體與膜孵育2小時(shí)，洗膜，然后膜再與結(jié)合有HRP的第二抗體孵育1小時(shí)，洗膜4次(每次15分鐘)，最后用ECL試劑(Pierce，Rockford，IL)顯色。
實(shí)施例12細(xì)胞結(jié)合試驗(yàn)和ELISA收集含有可溶性S片段的培養(yǎng)基，離心使其澄清。Vero E6細(xì)胞或其他細(xì)胞(5×106)與0.5ml含有可溶性S片段的澄清的培養(yǎng)基和2μg綴合有HRP的抗c-Myc表位的抗體4℃孵育2小時(shí)。然后用冰冷的PBS洗細(xì)胞三次并離心收集細(xì)胞。細(xì)胞沉淀物與購(gòu)自Roche(Indianapolis，IN)的ABTS底物室溫下孵育10分鐘，離心澄清底物并在405nm波長(zhǎng)測(cè)定其光密度值。
對(duì)于ELISA，純化的ACE2(R&D，Minneapolis，MN以100ng/孔的濃度用pH9.6的緩沖液吸附到Maxisorp ELISA板上。含有各種可溶性S片段的培養(yǎng)基154(150μl)和0.6μg結(jié)合有HRP的抗c-155Myc表位抗體加入各孔中37℃孵育2小時(shí)。洗孔并向各孔中加入60μlABTS底物，20分鐘后測(cè)定其光密度值(OD405)。
實(shí)施例13熒光染料再分布細(xì)胞融合試驗(yàn)轉(zhuǎn)染了編碼S糖蛋白的質(zhì)粒的Hela或293細(xì)胞，用Calcein AM(分子探針)負(fù)載，Calcein AM在細(xì)胞內(nèi)可轉(zhuǎn)變成Calcein綠，細(xì)胞與含有1μg/mlCalcein AM的培養(yǎng)基在37℃和5％CO2的條件下孵育1小時(shí)后，經(jīng)過(guò)洗滌后重懸于新鮮培養(yǎng)基中。接種靶細(xì)胞于板中，Vero E6用CMAC浸染，Vero E6與含有1μg/ml的CMAC(分子探針)的培養(yǎng)基在37℃和5％CO2的條件下孵育1小時(shí)后，用培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞兩次，在新鮮培養(yǎng)基中孵育20分鐘后，再次洗滌細(xì)胞，然后每孔中加入0.5ml培養(yǎng)基。負(fù)載有Calcein的S表達(dá)細(xì)胞被加入靶細(xì)胞中，在37℃和5％CO2的條件下孵育1、2或4小時(shí)。以雙重染色細(xì)胞與接觸S表達(dá)細(xì)胞的靶細(xì)胞總數(shù)之間的比值來(lái)衡量細(xì)胞融合。用來(lái)自Universal Imaging的MethaMorph 4.0軟件進(jìn)行拍照。
實(shí)施例14基于β半乳糖酶報(bào)告基因的細(xì)胞-細(xì)胞融合試驗(yàn)293T細(xì)胞(1.5×106)被接種于T25培養(yǎng)瓶，次日，用Polyfect轉(zhuǎn)染試劑盒(Qiagen，Valencia，CA)根據(jù)廠家提供的方法，分別將pCDNA3-S、pSectag2B-S、pCDNA3-ACE2和pCDNA3-ACE2-Ecto轉(zhuǎn)入這些細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染后4小時(shí)，轉(zhuǎn)染了S構(gòu)建體的細(xì)胞用表達(dá)T7聚合酶的牛痘病毒轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染了ACE-2的細(xì)胞用編碼β-gal的牛痘病毒(VCB21R)轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后2小時(shí)，細(xì)胞用新鮮培養(yǎng)基孵育并轉(zhuǎn)入31℃孵育過(guò)夜。第二天，S糖蛋白表達(dá)細(xì)胞和ACE2表達(dá)細(xì)胞以1∶1的比例混合并在37℃孵育。3小時(shí)后，加入NP-40至終濃度為0.5％裂解細(xì)胞，細(xì)胞裂解液與等量的CPRG底物混合，1小時(shí)后測(cè)定其OD595。
實(shí)施例15哺乳動(dòng)物細(xì)胞刺突多肽的表達(dá)對(duì)某些試驗(yàn)，除全長(zhǎng)S糖蛋白的所有蛋白都用c-Myc抗原表位和組氨酸標(biāo)記物標(biāo)記。用相應(yīng)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293和Vero E6細(xì)胞后表達(dá)這些蛋白，之后用牛痘病毒表達(dá)T7聚合酶感染。
用抗c-Myc單克隆抗體(圖4)檢測(cè)標(biāo)記蛋白。如圖4所示，T7啟動(dòng)子是表達(dá)S糖蛋白的高度有效啟動(dòng)子。在這些試驗(yàn)中，T7啟動(dòng)子產(chǎn)生的表達(dá)水平高于CMV啟動(dòng)子，在大多數(shù)情況下其為強(qiáng)啟動(dòng)子(圖4A)。如圖4所示，S片段是可溶性片段，它們?cè)谂囵B(yǎng)基上清中的濃度與它們的大小成反比。
實(shí)施例16抗刺突抗體為了能夠檢測(cè)未標(biāo)記的蛋白，證實(shí)通過(guò)抗-c-myc抗體得到的數(shù)據(jù)和定位可能的抗原位點(diǎn)，制備了兔多克隆抗體。這些抗體中的兩個(gè)，D24和P540，分別為抗起始于第24和第540位殘基的肽的抗體。D24和P540抗體制劑特異性地識(shí)別特定的可溶性片段，(圖4C)。正如期待的那樣，D24識(shí)別所有的片段；P540識(shí)別S756、Se和S，但不識(shí)別更小的片段(圖4C，某些數(shù)據(jù)未出示)。D24抗體制劑相對(duì)較弱，而P540制劑即使稀釋1∶10000倍也相當(dāng)敏感，被廣泛應(yīng)用于這里所描述的實(shí)驗(yàn)中。
P540被用于檢測(cè)S糖蛋白是否在細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞外和細(xì)胞表面表達(dá)。正如圖5所示，當(dāng)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行測(cè)定時(shí)，全長(zhǎng)的S糖蛋白在細(xì)胞表面有表達(dá)，但表達(dá)水平較低。
實(shí)施例17刺突蛋白介導(dǎo)細(xì)胞融合全長(zhǎng)的S糖蛋白在中性pH時(shí)介導(dǎo)與表達(dá)受體分子的細(xì)胞融合，進(jìn)行細(xì)胞-細(xì)胞融合試驗(yàn)來(lái)確證全長(zhǎng)S糖蛋白是功能性的，來(lái)證實(shí)S蛋白的融合活性是否需要其他病毒蛋白和低的pH。
用pCDNA3-S和pSectag2B-S兩種載體表達(dá)的全長(zhǎng)S糖蛋白均能有效地導(dǎo)致ACE2表達(dá)細(xì)胞的融合，通過(guò)各種大小的合胞體的形成和基于β-gal報(bào)告基因的試驗(yàn)(圖7)即可證實(shí)。有趣的是，S糖蛋白的前導(dǎo)序列被鼠k鏈前導(dǎo)序列取代的pSectag2B-S構(gòu)建體誘導(dǎo)合胞體形成較快，而且，形成的合胞體較編碼天然的S糖蛋白的pCDNA3-S誘導(dǎo)的大且數(shù)量更多(數(shù)據(jù)未出示)。通過(guò)基于報(bào)告基因試驗(yàn)檢測(cè)，pSectag2B-S表達(dá)的S蛋白誘導(dǎo)融合的程度也較pCDNA3-S誘導(dǎo)的高(圖7B)。這些數(shù)據(jù)提示天然的S糖蛋白可能不能被有效地轉(zhuǎn)送到細(xì)胞表面。這些研究也提示，這里所描述的β-gal試驗(yàn)可以被用作鑒別抑制SARS-CoV進(jìn)入細(xì)胞的抑制劑的快速并定量的方法，同時(shí)也可被用作研究SARS-CoV進(jìn)入細(xì)胞的機(jī)理的工具。
注意，當(dāng)細(xì)胞沒(méi)有用ACE2表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，只表達(dá)天然濃度的受體時(shí)，用β-gal試驗(yàn)或合胞體形成試驗(yàn)均未能檢出Vero E6細(xì)胞的融合。為了弄清這種結(jié)果是否由于這兩個(gè)試驗(yàn)的敏感性太低所致，又啟用了另一個(gè)試驗(yàn)。這個(gè)新試驗(yàn)是基于熒光染料的再分布試驗(yàn)，能夠檢測(cè)出單個(gè)細(xì)胞融合。即使用基于熒光染料的試驗(yàn)，也未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染了編碼全長(zhǎng)S糖蛋白的細(xì)胞和各種陰性對(duì)照之間有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。一些陰性對(duì)照包括了在低pH條件下轉(zhuǎn)染編碼可溶性S片段(數(shù)據(jù)未出示)。明顯的細(xì)胞-細(xì)胞融合只有當(dāng)細(xì)胞轉(zhuǎn)染了編碼ACE2的質(zhì)粒才能檢測(cè)到，提示通過(guò)重組ACE2而致的受體高水平表達(dá)可能對(duì)于細(xì)胞融合是關(guān)鍵的?？偟膩?lái)講，這些結(jié)果提示重組的S糖蛋白能夠介導(dǎo)細(xì)胞融合，融合可以在中性pH時(shí)發(fā)生，并且融合的效率取決于受體分子的濃度。
更進(jìn)一步，可溶性S糖蛋白片段抑制S介導(dǎo)的細(xì)胞融合。正如圖15所示，加入含有以下描述的受體結(jié)合區(qū)的S片段S272-537和S17-537，抑制S介導(dǎo)的細(xì)胞融合。在本試驗(yàn)中，S272-537(SEQ IDNO57)片段最具抑制力。不含受體結(jié)合區(qū)的S17-276片段只有很小的或無(wú)抑制S介導(dǎo)的細(xì)胞融合作用。這些數(shù)據(jù)提示含有受體結(jié)合區(qū)的S多肽片段可能抑制SARS-CoV與細(xì)胞的融合，進(jìn)而抑制或預(yù)防細(xì)胞感染。
這樣，用抗-RBD抗體、S多肽、S肽或適體阻斷、操縱或抑制刺突蛋白受體結(jié)合區(qū)的活性，可以有效地預(yù)防和治療SARS-CoV感染。
實(shí)施例18刺突蛋白受體結(jié)合區(qū)的鑒別本實(shí)施例闡明了刺突蛋白的受體結(jié)合區(qū)定位于第272-537位殘基(SEQ ID NO57)和可能定位于第303-537位殘基(SEQ ID NO61)。后面的實(shí)驗(yàn)表明含有319-517殘基的片段(SEQ ID NO62)也有受體結(jié)合活性。
一個(gè)基于將各種可溶性片段結(jié)合到表達(dá)受體的Vero E6細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)被建立起來(lái)，以定位S糖蛋白的受體結(jié)合區(qū)(RBD)。該試驗(yàn)涉及到測(cè)定抗S多肽的抗體結(jié)合到Vero E6細(xì)胞有關(guān)的熒光，并在鑒別SARS-CoV的受體之前開展。對(duì)SARS-CoV易感的Vero E6細(xì)胞與全長(zhǎng)的S多肽和各種可溶性S片段孵育，幾種對(duì)SARS-CoV不易感的細(xì)胞同樣也與全長(zhǎng)的S多肽和它的可溶性片段孵育。正如圖8A和8B所示，所有S片段都與Vero E6細(xì)胞結(jié)合，除了最小的一個(gè)S片段(S276)外。當(dāng)幾個(gè)對(duì)SARS-CoV不易感的細(xì)胞系與全長(zhǎng)的S多肽和它的可溶性片段孵育時(shí)沒(méi)有檢出這樣的結(jié)合。與Vero E6細(xì)胞的結(jié)合與片段表達(dá)的水平成正比，與片段的大小成反比。這些發(fā)現(xiàn)提示RBD位于第272和537位殘基之間。
為了進(jìn)一步定位RBD，一個(gè)用含有288-303殘基的肽產(chǎn)生的抗體(IMG542)被使用。該抗體不抑制S537與Vero E6細(xì)胞的結(jié)合，雖然它確實(shí)能與S537片段結(jié)合(圖8B，一些數(shù)據(jù)未出示)，提示RBD位于303和537之間。因?yàn)榭贵w相對(duì)較大和立體阻礙的緣故，很有可能RBD位于303殘基的下游。最近，HCoV-299E的RBD位于一個(gè)含有氨基酸殘基407-547的片段上，見(jiàn)Ksiazek等.A novelcoronavirus associated with severe acute respiratory syndrome，N.Engl.J.Med.3481953-1966(2003)；Rota等Characterization of a novelcoronavirus associated with severe acute respiratory syndrome，Science3001394-1399(2003)。相比之下，鼠肝炎病毒的RBD定位于N端330氨基酸。
含RBD的SARS-CoV S1糖蛋白片段(如，S272-537)和HCoV-229E或肝炎病毒的RBD之間是否存在結(jié)構(gòu)上的相似，并且這種相似是否關(guān)系到用相同宿主進(jìn)行復(fù)制還需進(jìn)一步研究。這兩種病毒使用不同的受體。這里描述的簡(jiǎn)單直接的細(xì)胞結(jié)合方法也可能對(duì)鑒別其他的病毒受體有幫助。
最近，研究人員已經(jīng)對(duì)ACE2作為SARS-CoV功能性受體的鑒定進(jìn)行了報(bào)道，見(jiàn)Li等Angiotensin-converting enzyme 2is a functionalreceptorfor the SARS coronavirns，Nature 426450-54(2003)。ACE2作為受體的鑒定進(jìn)一步證實(shí)了以上提供的結(jié)果是正確的。正如圖8C所示，當(dāng)純化的ACE2被用于ELISA以測(cè)定結(jié)合時(shí)，觀察到與細(xì)胞結(jié)合試驗(yàn)相同的結(jié)合模式，所有的被測(cè)試的S片段都是如此。
這里展示的結(jié)果不僅提供了研究SARS病毒進(jìn)入細(xì)胞的新工具、證實(shí)了ACE2是SARS-CoV S1糖蛋白的受體和定位了RBD，而且為開發(fā)新的疫苗免疫原及預(yù)防和治療SARS的藥物提供了方便。
實(shí)施例19S糖蛋白的N末端和C末端寡聚反應(yīng)本實(shí)施例闡述了S糖蛋白的在RBD上游的極遠(yuǎn)端N末端片段可能在融合中發(fā)揮了作用，并且S胞外區(qū)形成的三聚體可能通過(guò)6-螺旋束中間體介導(dǎo)融合。
材料和方法抗體和質(zhì)粒用于Western和FACS分析的兔抗-S血清P540由發(fā)明者按以上描述的方法制備，也見(jiàn)Xiao等Biochem.Biophys.Res.Comm.3121159-65(2003)?？筂yc表位抗體從Invitrogen(Carlsbad，CA)購(gòu)得。抗ACE2山羊多克隆抗體從R&Dsystem(Minneapolis，MN)購(gòu)得，用于Western印跡檢測(cè)。
定點(diǎn)突變技術(shù)被用于在pCDNA3上的全長(zhǎng)SARS-CoV S糖蛋白上制造一個(gè)與HIV-1胞膜糖蛋白(Env)和某些冠狀病毒一致的共有切割位點(diǎn)，根據(jù)廠家提供的方法用從Straagene(La Jolla，CA)購(gòu)得的Quick Change試劑盒來(lái)進(jìn)行。對(duì)于各種N端S片段的表達(dá)，對(duì)應(yīng)的基因片段用PCR擴(kuò)增后克隆進(jìn)pSecTag2表達(dá)載體(Invitrogen，Carlsbad)。表達(dá)帶有C9肽的ACE2可溶性胞外段的pCDNA3-ACE2-ecto由Michael Farzan(Harvard University，Boston MA)友情贈(zèng)送。
蛋白表達(dá)和純化S糖蛋白的各種N端片段被亞克隆進(jìn)pSecTag2表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞，繼之用VTF7.3感染，正如Xiao等在Biochem.Biophys.Res.Comm.3121159-65(2003)中所描述。表達(dá)并分泌進(jìn)入培養(yǎng)基的蛋白用HiTrap Ni++-Chelating柱在天然條件下純化。純化的蛋白經(jīng)PBS透析后保存，用作進(jìn)一步分析。
通過(guò)免疫共沉淀檢測(cè)S糖蛋白的二聚體化和其與ACE2的相互作用對(duì)于S片段的二聚體化，不同的S糖蛋白構(gòu)建體，單獨(dú)或聯(lián)合轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞，正如Xiao等在Biochem.Biophys.Res.Comm.3121159-65(2003)中所描述。含有S片段的培養(yǎng)基用于與兔抗S多克隆抗血清P540進(jìn)行免疫沉淀試驗(yàn)。對(duì)于一些免疫共沉淀試驗(yàn)，加入DTT創(chuàng)造一個(gè)還原條件，以排除分子間通過(guò)二硫鍵相互作用。免疫沉淀的S片段用抗Myc表位單克隆抗體通過(guò)Western來(lái)檢測(cè)?？扇苄訟CE2-C9的表達(dá)很相似，表達(dá)進(jìn)入培養(yǎng)基的ACE2-C9直接用于與各種S片段在4℃條件下孵育2小時(shí)。繼后，ACE2通過(guò)與抗C9單克隆抗體和蛋白G-瓊脂糖珠在4℃條件下孵育1小時(shí)進(jìn)行免疫沉淀。瓊脂糖珠用PBS洗滌4次，懸于SDS-PAGE樣品緩沖液，煮沸3分鐘后用于膠分離。樣品中存在的ACE2或S用Western來(lái)檢測(cè)，正如Xiao等在Biochem.Biophys.Res.Comm.3121159-65(2003)中所描述的那樣。
流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染了全長(zhǎng)S糖蛋白或各個(gè)N端缺失的S糖蛋白，并用VTF7.3感染了的細(xì)胞與P540兔抗S多克隆抗體和結(jié)合了FITC的山羊抗兔抗體在含有1％BSA的PBS中4℃孵育2小時(shí)，然后用冰冷PBS洗滌細(xì)胞4次，用FacsCalibur(Becton Dickinson，SanJose，California)進(jìn)行分析。
S片段的膠過(guò)濾分析通過(guò)HiTrap Ni-Chelating柱純化、緩沖液被置換成PBS后，將S片段上樣到已用PBS平衡過(guò)的Superose 1210/300GL柱(Pharmacia，Uppsala，Sweden)上，蛋白用PBS在0.5ml/分的流速下洗脫，以0.5ml量收集洗脫組分。該Superose 12柱用蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)669，440，232，158，67，44和25kD進(jìn)行標(biāo)定。從各組分中取10μl用于Western印跡分析。
交聯(lián)純化的S537片段用PBS稀釋至0.2μg/ml的濃度，BS3(Pierce，Rockford，IL)被加入到S537溶液中至終濃度為1mg/ml，并在冰上孵育1分鐘。樣品然后與等量的4XSDS-PAGE上樣緩沖液混合，用Western進(jìn)行分析。
細(xì)胞融合β-gal報(bào)告基因試驗(yàn)轉(zhuǎn)染了pSecTag2B-S或pCDNA3-ACE2并且分別用VTF7.3和VCB21R感染的細(xì)胞用胰酶消化，用PBS洗滌一次，細(xì)胞然后被懸于pH7.4的常規(guī)DMEM培養(yǎng)基中，混合。經(jīng)4小時(shí)孵育后裂解細(xì)胞，用CPRG測(cè)定β-gal活性，正如Xiao等在Biochem.Biophys.Res.Comm.3121159-65(2003)中所描述的那樣。
ELISA兩種ELISA方法被使用。在三明治ELISA中，ELISA板用抗-His標(biāo)記物的抗體包被，然后S片段被加入板中，并用抗c-Myc表位抗體檢測(cè)。這一方法被用于檢測(cè)S片段。在第二種ELISA方法中，通過(guò)抗C9抗體將帶有C9標(biāo)記的ACE2包被在板上，然后加入S片段，經(jīng)洗板后，用抗c-Myc表位抗體進(jìn)行檢測(cè)。所有實(shí)驗(yàn)中與抗c-Myc表位抗體的孵育為室溫2小時(shí)。測(cè)定OD值并正態(tài)化至最大值。
結(jié)果S糖蛋白R(shí)BD上游的N端片段形成二聚體。以前已證明另一個(gè)冠狀病毒(MHV)的可溶性S1(類似SU)片段形成二聚體，N端最遠(yuǎn)端的含有受體結(jié)合區(qū)的330個(gè)氨基酸殘基參與了二聚體化，只有二聚體才能與CEACAM結(jié)合，見(jiàn)Lewicki & Gallagher，J.Biol.Chem.27719727-34(2002)。然而，本發(fā)明者和其他人已將SARS-CoV的受體結(jié)合區(qū)定位在了N端極遠(yuǎn)端的下游，Xiao等Biochem.Biophys.Res.Comm.3121159-65(2003)；Wong等J.Biol.Chem.2793197-3201(2004)；Babcock等J.Virol.784552-4560(2004)。
為了探索含受體結(jié)合區(qū)片段的寡聚化反應(yīng)的可能性和檢測(cè)其在介導(dǎo)膜融合中的功能，對(duì)幾個(gè)S片段的寡聚化反應(yīng)進(jìn)行了檢測(cè)。這些S片段包括了不與受體ACE2結(jié)合的N端極遠(yuǎn)端的片段(殘基17到276，名為S276，SEQ ID NO50)和含有第319到517殘基并保留有受體結(jié)合活性的片段(名為S319-517，SEQ ID NO62)。選擇這些片段部分是因?yàn)樗鼈兡塥?dú)立折疊并分泌到細(xì)胞培養(yǎng)上清中，盡管它們的表達(dá)效率有明顯差異(圖9A，左邊)，且當(dāng)與S756共表達(dá)時(shí)它們的濃度會(huì)降低(圖9A，右邊)。
為了發(fā)現(xiàn)是否這些片段與含有相當(dāng)于包膜糖蛋白的受體結(jié)合亞單位(一般為SU，冠狀病毒為S1)的最大片段(S756)發(fā)生寡聚反應(yīng)，共表達(dá)這些多肽片段，然后將細(xì)胞培養(yǎng)上清中的混合物用P540進(jìn)行免疫沉淀。正如前面例子所述，本兔多克隆抗體制劑是制備來(lái)抗S糖蛋白上含540到555位殘基的肽(SEQ ID NO59)的。P450抗體與S756多肽結(jié)合但不與其他多肽結(jié)合(圖9B，左邊)。所有含受體結(jié)合區(qū)的N端片段除最小的片段(S319-517)外，均能夠與S756通過(guò)P540發(fā)生免疫共沉淀(圖9B，右邊)。為了排除因二硫鍵形成引起免疫共沉淀的非特異性反應(yīng)的可能，DTT被加入了其中的一個(gè)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，DTT對(duì)分泌的S756(左道)或S756+S276(右道)的免疫沉淀或免疫共沉淀無(wú)影響(圖9C，左邊組)。
為了弄清寡聚體的大小，其中一個(gè)片段(S537)與BS3交聯(lián)。圖9C右邊組顯示新出現(xiàn)的條帶的分子量與二聚體一致，而與更高級(jí)別的寡聚體不符。為排除交聯(lián)引起的假相的可能并進(jìn)一步確證二聚體形成，S537片段也用膠過(guò)濾法進(jìn)行了分析，觀察到兩個(gè)膠過(guò)濾的洗脫峰一個(gè)峰由分子量約為230kDa的物質(zhì)引起，另一個(gè)由110kDa的物質(zhì)引起，分別與二聚體和單體的大小一致。形成對(duì)照的是，洗脫下來(lái)的含有受體結(jié)合區(qū)的最小片段(S319-517)只有單體，分子量約為35kDa(圖2A，下組)。總的來(lái)講，這些結(jié)果提示可溶性SU為二聚體，二聚體化的區(qū)域在N端極遠(yuǎn)端317殘基的上游和受體結(jié)合區(qū)之內(nèi)。
二聚體化的N端區(qū)為S介導(dǎo)的細(xì)胞-細(xì)胞融合所必需。因?yàn)橥茰y(cè)的二聚體化區(qū)域在S1的受體結(jié)合區(qū)的上游，而融合機(jī)制在S2內(nèi)，人們會(huì)假設(shè)二聚體化并不是介導(dǎo)融合所需要的。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，制備了兩個(gè)全長(zhǎng)S糖蛋白的缺失突變子，N端103個(gè)殘基從一個(gè)片段上缺失，N端311個(gè)殘基從另一個(gè)片段上缺失(圖9A)，這樣，去除了推測(cè)的二聚體化區(qū)域。兩個(gè)突變子與具有融合活性的野生型全長(zhǎng)S糖蛋白相比無(wú)一顯示出融合活性(圖9A)。為了檢測(cè)是否因表達(dá)水平的差異導(dǎo)致了可觀察到的融合活性的缺失，用流式細(xì)胞儀和Western印跡對(duì)表面及總表達(dá)水平進(jìn)行了測(cè)定，從兩個(gè)實(shí)驗(yàn)獲得的數(shù)據(jù)提示兩個(gè)缺失突變子與野生型的表達(dá)水平無(wú)明顯區(qū)別(圖11B和C)。這些結(jié)果提示N端極遠(yuǎn)端通過(guò)可能涉及或不涉及到二聚體化的機(jī)理為融合所必需。
二聚體化的S1與ACE2的結(jié)合遠(yuǎn)比含受體結(jié)合區(qū)的單體有效。以前對(duì)另一個(gè)冠狀病毒(MHV)的研究提示只有二聚體化的S1與它的受體CEACAM結(jié)合，Lewicki & Gallagher，J.Biol.Chem.27719727-734(2002)。用SARS-CoV片段進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以弄清二聚體狀態(tài)下的S1如何影響融合。具體的說(shuō)，通過(guò)使用抗c-Myc表位抗體來(lái)將單價(jià)S1片段轉(zhuǎn)化成雙價(jià)來(lái)觀察單價(jià)或雙價(jià)形式的S1片段與ACE2的結(jié)合。這些S1片段的其中之一(S319-517，SEQ ID NO62)與固化于表面的ACE2無(wú)任何可測(cè)到的結(jié)合，除非其與抗c-Myc表位抗體結(jié)合后，該抗體在其與受體孵育之前和之中在溶液中將其轉(zhuǎn)化成雙價(jià)分子(圖12)。形成對(duì)比的是，S537在沒(méi)有抗體存在時(shí)與ACE2結(jié)合，雖然抗體的存在增強(qiáng)其結(jié)合力(圖12)。這些結(jié)果提示S1的二聚體狀態(tài)可能通過(guò)增強(qiáng)總的結(jié)合力從而提高融合效率。
可溶性S胞外區(qū)為三聚體。I類融合蛋白的病毒胞膜糖蛋白如流感病毒的血凝素(HA)通過(guò)跨膜區(qū)形成三聚體。因?yàn)镾ARS-CoV S糖蛋白最近被認(rèn)為屬I類融合蛋白，S2亞單位可能主導(dǎo)整個(gè)S糖蛋白的三聚體化。然而，帶有三聚體化的S2的二聚體化S1可能導(dǎo)致更高級(jí)別的寡聚體，它們的形成取決于天然S蛋白上可用的二聚體化結(jié)合位點(diǎn)。為了檢測(cè)這種可能性，去除了跨膜區(qū)和胞質(zhì)內(nèi)段的可溶性胞外區(qū)(Se)的大小用膠過(guò)濾法進(jìn)行了估計(jì)，正如圖13所示，一個(gè)大小接近三聚體(MW 512kDa)的復(fù)合物被檢出，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)有更高級(jí)別的寡聚體。這些結(jié)果不僅提示Se片段及也許全長(zhǎng)的膜相關(guān)S在天然未結(jié)合狀態(tài)為三聚體，而且顯示S1的二聚體化位點(diǎn)不太容易被用于三聚體間的相互作用。
這些結(jié)果有以下提示1)SARS-CoV S糖蛋白(S1)的SU亞單位形成二聚體，2)二聚體化區(qū)不重疊，并且在受體結(jié)合區(qū)的上游，3)去除二聚體化區(qū)即阻斷融合，4)二聚體化的S1結(jié)合受體分子的效率遠(yuǎn)較含有受體結(jié)合區(qū)的單體片段強(qiáng)，5)可溶性的S胞外區(qū)在膠過(guò)濾條件下形成三聚體。
以前已有報(bào)道，某些I類融合蛋白(與受體分子結(jié)合的蛋白)的SU亞單位能夠形成二聚體，包括，例如逆轉(zhuǎn)錄病毒的HIV-1的gp120和S1冠狀病毒MHV的S1。Center等J.Virol.744448-55(2000)；Lewicki等J.Biol.Chem.27719727-34(2002)。直到本研究，S1二聚體化在介導(dǎo)膜融合中的作用是不清楚的，現(xiàn)在，可溶性胞外區(qū)如HIV-1的gp140和SIV的胞膜蛋白(Env)形成三聚體已被普遍接受，雖然也可觀察到二聚體和四聚體。Center et al.Proc.Nat′l Acad.Sci.U.S.A.9814877-82(2001)。類似，至少一個(gè)包括SARS-CoV的S2的冠狀病毒的可能的融合中間體4級(jí)結(jié)構(gòu)為三聚體。Liu et al.Lancet 363938-947(2004)；Bosch et al.Proc.Nat′l Acad.Sci.U.S.A.1018455-60(2004)。形成對(duì)比的是，某些數(shù)據(jù)提示MHV的S2在與S1分離后是單體。Lewicki等J.Biol.Chem.27719727-34(2002)。二聚體到三聚體的轉(zhuǎn)化在II類融合蛋白介導(dǎo)的融合中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。這樣，有人認(rèn)為一些冠狀病毒的四級(jí)結(jié)構(gòu)的改變可能在融合機(jī)理中發(fā)揮了作用。人們應(yīng)該注意到HIV-1的Env和MHV的S糖蛋白均被切割，SU亞單位可從跨膜亞單位分離，然而，這種分離可能對(duì)融合不重要。形成對(duì)照的是，SARS-CoVd的S當(dāng)表達(dá)為膜相關(guān)時(shí)不被切割，或可溶形式和切割不是融合所必需。這樣，雖然SARS-CoV的S糖蛋白為I類融合蛋白，對(duì)于I類融合蛋白的Env推測(cè)被切割后轉(zhuǎn)化為亞穩(wěn)定的高能狀態(tài)以驅(qū)動(dòng)融合反應(yīng)的法則來(lái)說(shuō)，不被切割是一個(gè)例外。
有關(guān)SARS-CoV的S糖蛋白的SU(S1)區(qū)能夠形成二聚體并且與跨膜區(qū)的胞外段(S2)形成三聚體的發(fā)現(xiàn)展示了一個(gè)有趣的拓?fù)鋵W(xué)情形，假如三聚體中的兩個(gè)單體也形成二聚體，那么第三個(gè)單體仍然是自由的可以與另一個(gè)三聚體中的自由單體反應(yīng)形成兩個(gè)三聚體間的二聚體。另外一種狀況是三聚體中的各單體的方向不允許在三聚體中形成二聚體，留出自由結(jié)合位點(diǎn)與其他三聚體中的單體形成二聚體。在這種情況下，人們可以期待一個(gè)網(wǎng)狀的三聚體的形成。最后一種狀況是三聚體的三維結(jié)構(gòu)可能不允許任何單體的二聚體化位點(diǎn)與同一個(gè)或不同的三聚體之間的單體相互反應(yīng)。后一種可能得到這里提供的初步數(shù)據(jù)的支持，即在所述的膠過(guò)濾條件下，未檢出有高級(jí)別的寡聚體。在那些條件下，要么三聚體內(nèi)形成二聚體，但單體的構(gòu)型不允許與其他三聚體的單體相互反應(yīng)，或這樣的反應(yīng)太弱不足以本檢測(cè)出來(lái)，或三聚體的三維結(jié)構(gòu)不允許二聚體化反應(yīng)的發(fā)生。
這里提供的數(shù)據(jù)證明在刪除部分二聚體化區(qū)后融合不能發(fā)生，提示二聚體化區(qū)可能在融合中起作用，雖然其機(jī)理可能不是通過(guò)二聚體化反應(yīng)。另外，在天然條件下，表面S糖蛋白的濃度會(huì)很高，正如在顯微照像中所見(jiàn)，有可能二聚體化反應(yīng)在穩(wěn)定相互作用的分子的“網(wǎng)”中起作用，也許有些類似介導(dǎo)II類融合蛋白進(jìn)入的蛋白網(wǎng)。這樣的網(wǎng)，如果有的話，可能增加與受體分子相互作用的親和力，并且通過(guò)事前集合的胞膜分子網(wǎng)促成融合孔結(jié)構(gòu)的形成，或甚至在缺乏產(chǎn)生高能亞穩(wěn)定狀態(tài)的S切割的情況下提供驅(qū)動(dòng)融合反應(yīng)的能量。
實(shí)施例20用編碼RBD多肽的DNA免疫小鼠獲得的血清抑制S介導(dǎo)的細(xì)胞融合本實(shí)施例表明用編碼受體結(jié)合區(qū)多肽的DNA免疫哺乳動(dòng)物可預(yù)防SARS感染。
材料和方法
小鼠被分為3組A組小鼠從1#到5#用編碼含刺突蛋白的受體結(jié)合區(qū)的S319-518片段的質(zhì)粒pSecTag-SRBD免疫；B組1#到5#小鼠用編碼與Fc融合的RBD(S319-518)片段的融合蛋白的pEAK-10-RBD-Fc免疫；C組1#到3#鼠用對(duì)照質(zhì)粒免疫。各組的5只BALB/C鼠分別在0天、14天和28天免疫。小鼠用基因槍進(jìn)行免疫，每次劑量低于2μgDNA。第56天采集血清。在圖14A-B中，第一個(gè)數(shù)字代表小鼠個(gè)體，字母代表各自的免疫組，最后的數(shù)字代表所用稀釋度。
細(xì)胞(293T)與來(lái)自被免疫的小鼠的抗血清孵育，然后與表達(dá)S蛋白的細(xì)胞混合。融合用前面的例子中描述的方法進(jìn)行測(cè)定(也見(jiàn)，Xiao等BBRC 2003)。PC代表未加血清的陽(yáng)性對(duì)照，對(duì)各組的1#到2#鼠，所用稀釋系數(shù)為10、100和1000，對(duì)A組、B組和對(duì)照組的3#鼠，所用稀釋系數(shù)為20和100。
結(jié)果從小鼠獲得的抗血清的抗體滴度見(jiàn)圖14A。如圖所示，用編碼刺突蛋白受體區(qū)(S319-518，A組和B組)DNA免疫的小鼠的抗體滴度非常高，用于ELISA時(shí)稀釋至1∶7250仍與抗原有很強(qiáng)的反應(yīng)。
正如圖14B所示，從用編碼刺突蛋白受體結(jié)合區(qū)的DNA免疫的小鼠獲得的抗血清抑制表達(dá)有S蛋白的細(xì)胞的融合，并呈劑量依賴關(guān)系。這樣，來(lái)自1A和2A，即用編碼S的受體結(jié)合區(qū)DNA免疫的小鼠的抗血清，當(dāng)用1∶10稀釋時(shí)，明顯抑制S蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞融合。更高稀釋度(1∶100和1∶1000)時(shí)，該抗血清的效果降低。在從來(lái)自小鼠3A(1∶20稀釋)，小鼠4A(1∶20稀釋)，和小鼠5A(1∶20稀釋)的抗血清對(duì)細(xì)胞融合的抑制上也觀察到類似結(jié)果。
這些數(shù)據(jù)提示用編碼S蛋白受體結(jié)合區(qū)的多肽的DNA免疫哺乳動(dòng)物能誘導(dǎo)出很強(qiáng)的抗刺突蛋白的免疫反應(yīng)并可預(yù)防SARS感染。正如以上所述，可溶性的含有受體結(jié)合區(qū)的S糖蛋白片段抑制S介導(dǎo)的細(xì)胞融合(見(jiàn)圖15)。
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這里引用或提到的所有的專利和出版物代表著與本發(fā)明有關(guān)的本領(lǐng)域技術(shù)人員的技術(shù)水平，作為參考的各專利或出版物通過(guò)引用結(jié)合到本文中，其程度與通過(guò)引用以其整體單獨(dú)結(jié)合到本文或以其整體列于本文相同。申請(qǐng)者保留在此說(shuō)明中引述任何這些提到的專利或出版物的任何和所有材料和信息權(quán)利。
這里所述的特殊方法和組合物為代表性優(yōu)選實(shí)施方案，是示例性的，無(wú)意作為對(duì)本發(fā)明范圍的限制。當(dāng)本領(lǐng)域的技術(shù)人員在研究本說(shuō)明時(shí)產(chǎn)生的其他的目的、方向和實(shí)施方案，正如權(quán)利要求的權(quán)限中所定義，被本發(fā)明的精神所涵蓋。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該相當(dāng)清楚地知道，對(duì)這里公開的發(fā)明的各種取代和修改不偏離本發(fā)明的范圍和精神。這里解說(shuō)性地描述的本發(fā)明可能適于在缺乏這里沒(méi)有作為要素公開的任何元素或某些元素、或任何限制或某些限制的情況下實(shí)施。這里解說(shuō)性地描述的方法和過(guò)程可能適于用不同次序的步驟實(shí)施，它們不必拘泥于這里提到的或權(quán)利要求中的步驟次序。正如用于這里和附加的權(quán)利要求中的“一”、“一個(gè)”和“所述”，除非文中特別指明，包括一或多的含義。例如，“一個(gè)宿主細(xì)胞”的內(nèi)容包括了多個(gè)這種細(xì)胞的(例如培養(yǎng)物和群體)和類似情況。在任何情況下本專利都不能被解釋為限于這里具體公開的特殊例子或?qū)嵤┓桨?。在任何情況下本專利都不能被解釋為受限于專利和商標(biāo)管理局的任何審查員、官員或雇員的申明，除非這樣的申明被申請(qǐng)人特別地、無(wú)條件無(wú)保留地以書面形式表示采納。
所用術(shù)語(yǔ)和表達(dá)被用作描述性術(shù)語(yǔ)而非限制性術(shù)語(yǔ)，這里無(wú)意用這些術(shù)語(yǔ)和表達(dá)來(lái)將所展示和描述的特征的等同物或等同物的某部分排除在外，但是，正如所主張的，應(yīng)該認(rèn)可在本發(fā)明范圍內(nèi)的各種修改是可能的。這樣，雖然本發(fā)明通過(guò)優(yōu)選的實(shí)施方案和可選性特征被具體公開，本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員可能會(huì)謀求對(duì)這里公開的概念的修飾和改變，這樣的修飾和改變被認(rèn)為在本發(fā)明的涵蓋范圍內(nèi)，正如附加權(quán)利要求中所定義的那樣。
這里對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了寬泛地、一般性地描述，各種在本一般性公開范圍內(nèi)的較窄的和次一般性的描述也構(gòu)成本發(fā)明的一部分。這包括帶有附加條件或從上位概念中去除任何主題的否定性限制的本發(fā)明的一般性描述，無(wú)論被摘除的材料是否在此有具體敘述。
其他實(shí)施方案在以下的權(quán)利要求中。另外，當(dāng)本發(fā)明的特征或方面以Markush組來(lái)描述時(shí)，那些本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該意識(shí)到本發(fā)明也以Markush組的任何個(gè)體成員或亞組成員來(lái)描述。
序列表<110>美國(guó)政府衛(wèi)生及公眾服務(wù)部國(guó)家衛(wèi)生協(xié)會(huì)(National Institutes of Health)D.S.迪米特羅夫(Dimitrov，Dimiter S.)X.肖(Xiao，Xiaodong)<120>SARS冠狀病毒刺突糖蛋白的可溶性片段<130>1662.024W01<150>US 60/489,166<151>2003-07-21<150>US 60/524,642<151>2003-11-25<160>65<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>1255<212>PRT<213>SARS冠狀病毒<400>1Met Phe Ile Phe Leu Leu Phe Leu Thr Leu Thr Ser Gly Ser Asp Leu1 5 10 15Asp Arg Cys Thr Thr Phe Asp Asp Val Gln Ala Pro Asn Tyr Thr Gln20 25 30His Thr Ser Ser Met Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Glu Ile Phe Arg35 40 45Ser Asp Thr Leu Tyr Leu Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Tyr Ser
50 55 60Asn Val Thr Gly Phe His Thr Ile Asn His Thr Phe Gly Asn Pro Val65 70 75 80Ile Pro Phe Lys Asp Gly Ile Tyr Phe Ala Ala Thr Glu Iys Ser Asn85 90 95Val Val Arg Gly Trp Val Phe Gly Ser Thr Met Asn Asn Lys Ser Gln100 105 110Ser Val Ile Ile Ile Asn Asn Ser Thr Asn Val Val Ile Arg Ala Cys115 120 125Asn Phe Glu Leu Cys Asp Asn Pro Phe Phe Ala Val Ser Lys Pro Met130 135 140Gly Thr Gln Thr His Thr Met Ile Phe Asp Asn Ala Phe Asn Cys Thr145 150 155 160Phe Glu Tyr Ile Ser Asp Ala Phe Ser Leu Asp Val Ser Glu Lys Ser165 170 175Gly Asn Phe Lys His Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Lys Asp Gly180 185 190Phe Leu Tyr Val Tyr Lys Gly Tyr Gln Pro Ile Asp Val Val Arg Asp195 200 205Leu Pro Ser Gly Phe Asn Thr Leu Lys Pro Ile Phe Lys Leu Pro Leu210 215 220Gly Ile Asn Ile Thr Asn Phe Arg Ala Ile Leu Thr Ala Phe Ser Pro225 230 235 240Ala Gln Asp Ile Trp Gly Thr Ser Ala Ala Ala Tyr Phe Val Gly Tyr245 250 255Leu Lys Pro Thr Thr Phe Met Leu Lys Tyr Asp Glu Asn Gly Thr Ile260 265 270Thr Asp Ala Val Asp Cys Ser Gln Asn Pro Leu Ala Glu Leu Lys Cys275 280 285Ser Val Lys Ser Phe Glu Ile Asp Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn290 295 300Phe Arg Val Val Pro Ser Gly Asp Val Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr305 310 315 320Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Lys Phe Pro Ser325 330 335Val Tyr Ala Trp Glu Arg Lys Lys Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr340 345 350Ser Val Leu Tyr Asn Ser Thr Phe Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly355 360 365Val Ser Ala Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Ser Asn Val Tyr Ala
370 375 380Asp Ser Phe Val Val Lys Gly Asp Asp Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly385 390 395 400Gln Thr Gly Val Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe405 410 415Met Gly Cys Val Leu Ala Trp Asn Thr Arg Asn Ile Asp Ala Thr Ser420 425 430Thr Gly Asn Tyr Asn Tyr Lys Tyr Arg Tyr Leu Arg His Gly Lys Leu435 440 445Arg Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Asn Val Pro Phe Ser Pro Asp Gly450 455 460Lys Pro Cys Thr Pro Pro Ala Leu Asn Cys Tyr Trp Pro Leu Asn Asp465 470 475 480Tyr Gly Phe Tyr Thr Thr Thr Gly Ile Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val485 490 495Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu Asn Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly500 505 510Pro Lys Leu Ser Thr Asp Leu Ile Lys Asn Gln Cys Val Asn Phe Asn515 520 525Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Pro Ser Ser Lys Arg530 535 540Phe Gln Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Val Ser Asp Phe Thr Asp545 550 555 560Ser Val Arg Asp Pro Lys Thr Ser Glu Ile Leu Asp Ile Ser Pro Cys565 570 575Ala Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Ala Ser Ser580 585 590Glu Val Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Asp Val Ser Thr595 600 605Ala Ile His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Ala Trp Arg Ile Tyr Ser Thr610 615 620Gly Asn Asn Val Phe Gln Thr Gln Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu625 630 635 640His Val Asp Thr Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile645 650 655Cys Ala Ser Tyr His Thr Val Ser Leu Leu Arg Ser Thr Ser Gln Lys660 665 670Ser Ile Val Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Asp Ser Ser Ile Ala675 680 685Tyr Ser Asn Asn Thr Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Ser Ile Ser Ile690 695 700
Thr Thr Glu Val Met Pro Val Ser Met Ala Lys Thr Ser Val Asp Cys705 710 715 720Asn Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ala Asn Leu Leu Leu725 730 735Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Ser Gly Ile740 745 750Ala Ala Glu Gln Asp Arg Asn Thr Arg Glu Val Phe Ala Gln Val Lys755 760 765Gln Met Tyr Lys Thr Pro Thr Leu Lys Tyr Phe Gly Gly Phe Asn Phe770 775 780Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Leu Lys Pro Thr Lys Arg Ser Phe Ile785 790 795 800Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly Phe Met805 810 815Lys Gln Tyr Gly Glu Cys Leu Gly Asp Ile Asn Ala Arg Asp Leu Ile820 825 830Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu Leu Thr835 840 845Asp Asp Met Ile Ala Ala Tyr Thr Ala Ala Leu Val Ser Gly Thr Ala850 855 860Thr Ala Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile Pro Phe865 870 875 880Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr Gln Asn885 890 895Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Gln Ile Ala Asn Gln Phe Asn Lys Ala900 905 910Ile Ser Gln Ile Gln Glu Ser Leu Thr Thr Thr Ser Thr Ala Leu Gly915 920 925Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn Thr Leu930 935 940Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val Leu Asn945 950 955 960Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln Ile Asp965 970 975Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val Thr Gln980 985 990Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu Ala Ala995 10001005Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Val Asp Phe101010151020Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro Gln Ala Ala Pro His
1025103010351040Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ser Gln Glu Arg Asn104510501055Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Glu Gly Lys Ala Tyr Phe Pro106010651070Arg Glu Gly Val Phe Val Phe Asn Gly Thr Ser Trp Phe Ile Thr Gln107510801085Arg Asn Phe Phe Ser Pro Gln Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr Phe Val109010951100Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Ile Asn Asn Thr Val Tyr1105111011151120Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys112511301135Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser114011451150Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu115511601165Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu117011751180Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Val Trp Leu1185119011951200Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile Leu Leu120512101215Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Ala Cys Ser Cys122012251230Gly Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser Glu Pro Val Leu Lys123512401245Gly Val Lys Leu His Tyr Thr12501255<210>2<211>3768<212>DNA<213>SARS冠狀病毒<400>2atgtttattt tcttattatt tcttactctc actagtggta gtgaccttga ccggtgcacc60acttttgatg atgttcaagc tcctaattac actcaacata cttcatctat gaggggggtt120tactatcctg atgaaatttt tagatcagac actctttatt taactcagga tttatttctt180ccattttatt ctaatgttac agggtttcat actattaatc atacgtttgg caaccctgtc240atacctttta aggatggtat ttattttgct gccacagaga aatcaaatgt tgtccgtggt300
tgggtttttg gttctaccat gaacaacaag tcacagtcgg tgattattat taacaattct 360actaatgttg ttatacgagc atgtaacttt gaattgtgtg acaacccttt ctttgctgtt 420tctaaaccca tgggtacaca gacacatact atgatattcg ataatgcatt taattgcact 480ttcgagtaca tatctgatgc cttttcgctt gatgtttcag aaaagtcagg taattttaaa 540cacttacgag agtttgtgtt taaaaataaa gatgggtttc tctatgttta taagggctat 600caacctatag atgtagttcg tgatctacct tctggtttta acactttgaa acctattttt 660aagttgcctc ttggtattaa cattacaaat tttagagcca ttcttacagc cttttcacct 720gctcaagaca tttggggcac gtcagctgca gcctattttg ttggctattt aaagccaact 780acatttatgc tcaagtatga tgaaaatggt acaatcacag atgctgttga ttgttctcaa 840aatccacttg ctgaactcaa atgctctgtt aagagctttg agattgacaa aggaatttac 900cagacctcta atttcagggt tgttccctca ggagatgttg tgagattccc taatattaca 960aacttgtgtc cttttggaga ggtttttaat gctactaaat tcccttctgt ctatgcatgg1020gagagaaaaa aaatttctaa ttgtgttgct gattactctg tgctctacaa ctcaacattt1080ttttcaacct ttaagtgcta tggcgtttct gccactaagt tgaatgatct ttgcttctcc1140aatgtctatg cagattcttt tgtagtcaag ggagatgatg taagacaaat agcgccagga1200caaactggtg ttattgctga ttataattat aaattgccag atgatttcat gggttgtgtc1260cttgcttgga atactaggaa cattgatgct acttcaactg gtaattataa ttataaatat1320aggtatctta gacatggcaa gcttaggccc tttgagagag acatatctaa tgtgcctttc1380tcccctgatg gcaaaccttg caccccacct gctcttaatt gttattggcc attaaatgat1440tatggttttt acaccactac tggcattggc taccaacctt acagagttgt agtactttct1500tttgaacttt taaatgcacc ggccacggtt tgtggaccaa aattatccac tgaccttatt1560aagaaccagt gtgtcaattt taattttaat ggactcactg gtactggtgt gttaactcct1620tcttcaaaga gatttcaacc atttcaacaa tttggccgtg atgtttctga tttcactgat1680tccgttcgag atcctaaaac atctgaaata ttagacattt caccttgcgc ttttgggggt1740gtaagtgtaa ttacacctgg aacaaatgct tcatctgaag ttgctgttct atatcaagat1800gttaactgca ctgatgtttc tacagcaatt catgcagatc aactcacacc agcttggcgc1860atatattcta ctggaaacaa tgtattccag actcaagcag gctgtcttat aggagctgag1920catgtcgaca cttcttatga gtgcgacatt cctattggag ctggcatttg tgctagttac1980catacagttt ctttattacg tagtactagc caaaaatcta ttgtggctta tactatgtct2040ttaggtgctg atagttcaat tgcttactct aataacacca ttgctatacc tactaacttt2100tcaattagca ttactacaga agtaatgcct gtttctatgg ctaaaacctc cgtagattgt2160aatatgtaca tctgcggaga ttctactgaa tgtgctaatt tgcttctcca atatggtagc2220ttttgcacac aactaaatcg tgcactctca ggtattgctg ctgaacagga tcgcaacaca2280cgtgaagtgt tcgctcaagt caaacaaatg tacaaaaccc caactttgaa atattttggt2340ggttttaatt tttcacaaat attacctgac cctctaaagc caactaagag gtcttttatt2400gaggacttgc tctttaataa ggtgacactc gctgatgctg gcttcatgaa gcaatatggc2460gaatgcctag gtgatattaa tgctagagat ctcatttgtg cgcagaagtt caatggactt2520acagtgttgc cacctctgct cactgatgat atgattgctg cctacactgc tgctctagtt2580agtggtactg ccactgctgg atggacattt ggtgctggcg ctgctcttca aatacctttt2640gctatgcaaa tggcatatag gttcaatggc attggagtta cccaaaatgt tctctatgag2700aaccaaaaac aaatcgccaa ccaatttaac aaggcgatta gtcaaattca agaatcactt2760
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<223>合成引物<400>4ccatcagggg agaaaggcac 20<210>5
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<223>合成引物<400>5gtgcctttct cccctgatgg 20<210>6<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>合成引物
<400>8actgtctaga gttcgtttat gtgtaatg 28<210>9<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>合成引物<400>12actgtctaga ttgctcatat tttccc 26<210>13<211>740<212>PRT<213>SARS冠狀病毒<400>13Asp Arg Cys Thr Thr Phe Asp Asp Val Gln Ala Pro Asn Tyr Thr Gln1 5 10 15His Thr Ser Ser Met Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Glu Ile Phe Arg20 25 30Ser Asp Thr Leu Tyr Leu Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Tyr Ser35 40 45Asn Val Thr Gly Phe His Thr Ile Asn His Thr Phe Gly Asn Pro Val50 55 60Ile Pro Phe Lys Asp Gly Ile Tyr Phe Ala Ala Thr Glu Lys Ser Asn65 70 75 80Val Val Arg Gly Trp Val Phe Gly Ser Thr Met Asn Asn Lys Ser Gln85 90 95Ser Val Ile Ile Ile Asn Asn Ser Thr Asn Val Val Ile Arg Ala Cys100 105 110Asn Phe Glu Leu Cys Asp Asn Pro Phe Phe Ala Val Ser Lys Pro Met115 120 125Gly Thr Gln Thr His Thr Met Ile Phe Asp Asn Ala Phe Asn Cys Thr130 135 140Phe Glu Tyr Ile Ser Asp Ala Phe Ser Leu Asp Val Ser Glu Lys Ser145 150 155 160Gly Asn Phe Lys His Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Lys Asp Gly165 170 175Phe Leu Tyr Val Tyr Lys Gly Tyr Gln Pro Ile Asp Val Val Arg Asp180 185 190Leu Pro Ser Gly Phe Asn Thr Leu Lys Pro Ile Phe Lys Leu Pro Leu
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<223>合成的myc抗原表位<400>17Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu1 5 10<210>18<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成的組氨酸標(biāo)記物<400>18His His His His His His1 5<210>19<211>24
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物<400>19ctagctcgag caacagcatc tgtg 24<210>20<211>100<212>PRT<213>SARS冠狀病毒<400>20Met Phe Ile Phe Leu Leu Phe Leu Thr Leu Thr Ser Gly Ser Asp Leu1 5 10 15Asp Arg Cys Thr Thr Phe Asp Asp Val Gln Ala Pro Asn Tyr Thr Gln20 25 30His Thr Ser Ser Met Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Glu Ile Phe Arg35 40 45Ser Asp Thr Leu Tyr Leu Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Tyr Ser50 55 60Asn Val Thr Gly Phe His Thr Ile Asn His Thr Phe Gly Asn Pro Val65 70 75 80Ile Pro Phe Lys Asp Gly Ile Tyr Phe Ala Ala Thr Glu Lys Ser Asn85 90 95Val Val Arg Gly100<210>21<211>100<212>PRT<213>SARS冠狀病毒<400>21Trp Val Phe Gly Ser Thr Met Asn Asn Lys Ser Gln Ser Val Ile Ile1 5 10 15Ile Asn Asn Ser Thr Asn Val Val Ile Arg Ala Cys Asn Phe Glu Leu20 25 30
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Thr Asp Leu Ile Lys Asn Gln Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly Leu20 25 30Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Pro Ser Ser Lys Arg Phe Gln Pro Phe35 40 45Gln Gln Phe Gly Arg Asp Val Ser Asp Phe Thr Asp Ser Val Arg Asp50 55 60Pro Lys Thr Ser Glu Ile Leu Asp Ile Ser Pro Cys Ala Phe Gly Gly65 70 75 80Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Ala Ser Ser Glu Val Ala Val85 90 95Leu Tyr Gln Asp100<210>26<211>100<212>PRT<213>SARS冠狀病毒<400>26Val Asn Cys Thr Asp Val Ser Thr Ala Ile His Ala Asp Gln Leu Thr1 5 10 15Pro Ala Trp Arg Ile Tyr Ser Thr Gly Asn Asn Val Phe Gln Thr Gln20 25 30Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val Asp Thr Ser Tyr Glu Cys35 40 45Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala Ser Tyr His Thr Val Ser50 55 60Leu Leu Arg Ser Thr Ser Gln Lys Ser Ile Val Ala Tyr Thr Met Ser65 70 75 80Leu Gly Ala Asp Ser Ser Ile Ala Tyr Ser Asn Asn Thr Ile Ala Ile85 90 95Pro Thr Asn Phe100<210>27<211>100<212>PRT<213>SARS冠狀病毒<400>27Ser Ile Ser Ile Thr Thr Glu Val Met Pro Val Ser Met Ala Lys Thr
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<400>31Asn Thr Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Ile Asnl 5 10 15Asn Thr Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu20 25 30Glu Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu35 40 45Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu50 55 60Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile65 70 75 80Asp Leu Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln85 90<210>32<211>200<212>PRT<213>SARS冠狀病毒<400>32Met Phe Ile Phe Leu Leu Phe Leu Thr Leu Thr Ser Gly Ser Asp Leu1 5 10 15Asp Arg Cys Thr Thr Phe Asp Asp Val Gln Ala Pro Asn Tyr Thr Gln20 25 30His Thr Ser Ser Met Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Glu Ile Phe Arg35 40 45Ser Asp Thr Leu Tyr Leu Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Tyr Ser50 55 60Asn Val Thr Gly Phe His Thr Ile Asn His Thr Phe Gly Asn Pro Val65 70 75 80Ile Pro Phe Lys Asp Gly Ile Tyr Phe Ala Ala Thr Glu Lys Ser Asn85 90 95Val Val Arg Gly Trp Val Phe Gly Ser Thr Met Asn Asn Lys Ser Gln100 105 110Ser Val Ile Ile Ile Asn Asn Ser Thr Asn Val Val Ile Arg Ala Cys115 120 125Asn Phe Glu Leu Cys Asp Asn Pro Phe Phe Ala Val Ser Lys Pro Met130 135 140Gly Thr Gln Thr His Thr Met Ile Phe Asp Asn Ala Phe Asn Cys Thr145 150 155 160Phe Glu Tyr Ile Ser Asp Ala Phe Ser Leu Asp Val Ser Glu Lys Ser
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<213>人工序列<220>
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<223>合成的SEQ ID NO1的17-537位氨基酸序列外加小鼠K鏈前導(dǎo)序列N端以及myc抗原表位C端和多聚組氨酸標(biāo)記物
<400>55Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro1 5 10 15Gly Ser Thr Gly Asp Asp Arg Cys Thr Thr Phe Asp Asp Val Gln Ala20 25 30Pro Asn Tyr Thr Gln His Thr Ser Ser Met Arg Gly Val Tyr Tyr Pro35 40 45Asp Glu Ile Phe Arg Ser Asp Thr Leu Tyr Leu Thr Gln Asp Leu Phe50 55 60Leu Pro Phe Tyr Ser Asn Val Thr Gly Phe His Thr Ile Asn His Thr65 70 75 80Phe Gly Asn Pro Val Ile Pro Phe Lys Asp Gly Ile Tyr Phe Ala Ala85 90 95Thr Glu Lys Ser Asn Val Val Arg Gly Trp Val Phe Gly Ser Thr Met100 105 110Asn Asn Lys Ser Gln Ser Val Ile Ile Ile Asn Asn Ser Thr Asn Val115 120 125Val Ile Arg Ala Cys Asn Phe Glu Leu Cys Asp Asn Pro Phe Phe Ala130 135 140Val Ser Lys Pro Met Gly Thr Gln Thr His Thr Met Ile Phe Asp Asn145 150 155 160Ala Phe Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Ile Ser Asp Ala Phe Ser Leu Asp165 170 175Val Ser Glu Lys Ser Gly Asn Phe Lys His Leu Arg Glu Phe Val Phe180 185 190Lys Asn Lys Asp Gly Phe Leu Tyr Val Tyr Lys Gly Tyr Gln Pro Ile195 200 205Asp Val Val Arg Asp Leu Pro Ser Gly Phe Asn Thr Leu Lys Pro Ile210 215 220Phe Lys Leu Pro Leu Gly Ile Asn Ile Thr Asn Phe Arg Ala Ile Leu225 230 235 240Thr Ala Phe Ser Pro Ala Gln Asp Ile Trp Gly Thr Ser Ala Ala Ala245 250 255Tyr Phe Val Gly Tyr Leu Lys Pro Thr Thr Phe Met Leu Lys Tyr Asp260 265 270Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala Val Asp Cys Ser Gln Asn Pro Leu275 280 285Ala Glu Leu Lys Cys Ser Val Lys Ser Phe Glu Ile Asp Lys Gly Ile290 295 300Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val Val Pro Ser Gly Asp Val Val Arg
305 310 315 320Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala325 330 335Thr Lys Phe Pro Ser Val Tyr Ala Trp Glu Arg Lys Lys Ile Ser Asn340 345 350Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Thr Phe Phe Ser Thr355 360 365Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Ala Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe370 375 380Ser Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Val Lys Gly Asp Asp Val Arg385 390 395 400Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Val Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys405 410 415Leu Pro Asp Asp Phe Met Gly Cys Val Leu Ala Trp Asn Thr Arg Asn420 425 430Ile Asp Ala Thr Ser Thr Gly Asn Tyr Asn Tyr Lys Tyr Arg Tyr Leu435 440 445Arg His Gly Lys Leu Arg Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Asn Val Pro450 455 460Phe Ser Pro Asp Gly Lys Pro Cys Thr Pro Pro Ala Leu Asn Cys Tyr465 470 475 480Trp Pro Leu Asn Asp Tyr Gly Phe Tyr Thr Thr Thr Gly Ile Gly Tyr485 490 495Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu Asn Ala Pro500 505 510Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Leu Ser Thr Asp Leu Ile Lys Asn Gln515 520 525Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Glu Gln530 535 540Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu His His His His His His545 550 555<210>56<211>739<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成的SEQ ID NO1的17-756位氨基酸序列，N端沒(méi)有信號(hào)肽
<400>56Asp Arg Cys Thr Thr Phe Asp Asp Val Gln Ala Pro Asn Tyr Thr Gln1 5 10 15His Thr Ser Ser Met Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Glu Ile Phe Arg20 25 30Ser Asp Thr Leu Tyr Leu Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Tyr Ser35 40 45Asn Val Thr Gly Phe His Thr Ile Asn His Thr Phe Gly Asn Pro Val50 55 60Ile Pro Phe Lys Asp Gly Ile Tyr Phe Ala Ala Thr Glu Lys Ser Asn65 70 75 80Val Val Arg Gly Trp Val Phe Gly Ser Thr Met Asn Asn Lys Ser Gln85 90 95Ser Val Ile Ile Ile Asn Asn Ser Thr Asn Val Val Ile Arg Ala Cys100 105 110Asn Phe Glu Leu Cys Asp Asn Pro Phe Phe Ala Val Ser Lys Pro Met115 120 125Gly Thr Gln Thr His Thr Met Ile Phe Asp Asn Ala Phe Asn Cys Thr130 135 140Phe Glu Tyr Ile Ser Asp Ala Phe Ser Leu Asp Val Ser Glu Lys Ser145 150 155 160Gly Asn Phe Lys His Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Lys Asp Gly165 170 175Phe Leu Tyr Val Tyr Lys Gly Tyr Gln Pro Ile Asp Val Val Arg Asp180 185 190Leu Pro Ser Gly Phe Asn Thr Leu Lys Pro Ile Phe Lys Leu Pro Leu195 200 205Gly Ile Asn Ile Thr Asn Phe Arg Ala Ile Leu Thr Ala Phe Ser Pro210 215 220Ala Gln Asp Ile Trp Gly Thr Ser Ala Ala Ala Tyr Phe Val Gly Tyr225 230 235 240Leu Lys Pro Thr Thr Phe Met Leu Lys Tyr Asp Glu Asn Gly Thr Ile245 250 255Thr Asp Ala Val Asp Cys Ser Gln Asn Pro Leu Ala Glu Leu Lys Cys260 265 270Ser Val Lys Ser Phe Glu Ile Asp Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn275 280 285Phe Arg Val Val Pro Ser Gly Asp Val Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr290 295 300Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Lys Phe Pro Ser305 310 315 320
Val Tyr Ala Trp Glu Arg Lys Lys Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr325 330 335Ser Val Leu Tyr Asn Ser Thr Phe Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly340 345 350Val Ser Ala Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Ser Asn Val Tyr Ala355 360 365Asp Ser Phe Val Val Lys Gly Asp Asp Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly370 375 380Gln Thr Gly Val Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe385 390 395 400Met Gly Cys Val Leu Ala Trp Asn Thr Arg Asn Ile Asp Ala Thr Ser405 410 415Thr Gly Asn Tyr Asn Tyr Lys Tyr Arg Tyr Leu Arg His Gly Lys Leu420 425 430Arg Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Asn Val Pro Phe Ser Pro Asp Gly435 440 445Lys Pro Cys Thr Pro Pro Ala Leu Asn Cys Tyr Trp Pro Leu Asn Asp450 455 460Tyr Gly Phe Tyr Thr Thr Thr Gly Ile Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val465 470 475 480Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu Asn Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly485 490 495Pro Lys Leu Ser Thr Asp Leu Ile Lys Asn Gln Cys Val Asn Phe Asn500 505 510Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Pro Ser Ser Lys Arg515 520 525Phe Gln Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Val Ser Asp Phe Thr Asp530 535 540Ser Val Arg Asp Pro Lys Thr Ser Glu Ile Leu Asp Ile Ser Pro Cys545 550 555 560Ala Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Ala Ser Ser565 570 575Glu Val Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Asp Val Ser Thr580 585 590Ala Ile His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Ala Trp Arg Ile Tyr Ser Thr595 600 605Gly Asn Asn Val Phe Gln Thr Gln Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu610 615 620His Val Asp Thr Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile625 630 635 640Cys Ala Ser Tyr His Thr Val Ser Leu Leu Arg Ser Thr Ser Gln Lys
645 650 655Ser Ile Val Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Asp Ser Ser Ile Ala660 665 670Tyr Ser Asn Asn Thr Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Ser Ile Ser Ile675 680 685Thr Thr Glu Val Met Pro Val Ser Met Ala Lys Thr Ser Val Asp Cys690 695 700Asn Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ala Asn Leu Leu Leu705 710 715 720Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Ser Gly Ile725 730 735Ala Ala Glu<210>57<211>265<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成的SEQ ID NO1的272-537位氨基酸序列<400>57Ile Thr Asp Ala Val Asp Cys Ser Gln Asn Pro Leu Ala Glu Leu Lys1 5 10 15Cys Ser Val Lys Ser Phe Glu Ile Asp Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser20 25 30Asn Phe Arg Val Val Pro Ser Gly Asp Val Val Arg Phe Asn Ile Thr35 40 45Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Lys Phe Pro Ser50 55 60Val Tyr Ala Trp Glu Arg Lys Lys Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr65 70 75 80Ser Val Leu Tyr Asn Ser Thr Phe Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly85 90 95Val Ser Ala Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Ser Asn Val Tyr Ala100 105 110Asp Ser Phe Val Val Lys Gly Asp Asp Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly115 120 125Gln Thr Gly Val Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe130 135 140
Met Gly Cys Val Leu Ala Trp Asn Thr Arg Asn Ile Asp Ala Thr Ser145 150 155 160Thr Gly Asn Tyr Asn Tyr Lys Tyr Arg Tyr Leu Arg His Gly Lys Leu165 170 175Arg Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Asn Val Pro Phe Ser Pro Asp Gly180 185 190Lys Pro Cys Thr Pro Pro Ala Leu Asn Cys Tyr Trp Pro Leu Asn Asp195 200 205Tyr Gly Phe Tyr Thr Thr Thr Gly Ile Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val210 215 220Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu Asn Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly225 230 235 240Pro Lys Leu Ser Thr Asp Leu Ile Lys Asn Gln Cys Val Asn Phe Asn245 250 255Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val260 265<210>58<211>17<212>PRT<213>SARS冠狀病毒<400>58Asp Val Gln Ala Pro Asn Tyr Thr Gln His Thr Ser Ser Met Arg Gly1 5 10 15Cys<210>59<211>15<212>PRT<213>SARS冠狀病毒<400>59Pro Ser Ser Lys Arg Phe Gln Pro Gln Gln Phe Gly Arg Asp Cys1 5 10 15<210>60<211>16<212>PRT<213>SARS冠狀病毒
<400>60Met Phe Ile Phe Leu Leu Phe Leu Thr Leu Thr Ser Gly Ser Asp Leu1 5 10 15<210>61<211>235<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成的SEQ ID NO1的303-537位氨基酸序列，含有受體結(jié)合域<400>61Ser Asn Phe Arg Val Val Pro Ser Gly Asp Val Val Arg Phe Pro Asn1 5 10 15Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Lys Phe20 25 30Pro Ser Val Tyr Ala Trp Glu Arg Lys Lys Ile Ser Asn Cys Val Ala35 40 45Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Thr Phe Phe Ser Thr Phe Lys Cys50 55 60Tyr Gly Val Ser Ala Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Ser Asn Val65 70 75 80Tyr Ala Asp Ser Phe Val Val Lys Gly Asp Asp Val Arg Gln Ile Ala85 90 95Pro Gly Gln Thr Gly Val Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp100 105 110Asp Phe Met Gly Cys Val Leu Ala Trp Asn Thr Arg Asn Ile Asp Ala115 120 125Thr Ser Thr Gly Asn Tyr Asn Tyr Lys Tyr Arg Tyr Leu Arg His Gly130 135 140Lys Leu Arg Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Asn Val Pro Phe Ser Pro145 150 155 160Asp Gly Lys Pro Cys Thr Pro Pro Ala Leu Asn Cys Tyr Trp Pro Leu165 170 175Asn Asp Tyr Gly Phe Tyr Thr Thr Thr Gly Ile Gly Tyr Gln Pro Tyr180 185 190Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu Asn Ala Pro Ala Thr Val195 200 205
Cys Gly Pro Lys Leu Ser Thr Asp Leu Ile Lys Asn Gln Cys Val Asn210 215 220Phe Asn Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val225 230 235<210>62<211>199<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成的SEQ ID NO1的319-517位氨基酸序列，含有受體結(jié)合域<400>62Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn AIa Thr Lys Phe1 5 10 15Pro Ser Val Tyr Ala Trp Glu Arg Lys Lys Ile Ser Asn Cys Val Ala20 25 30Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Thr Phe Phe Ser Thr Phe Lys Cys35 40 45Tyr Gly Val Ser Ala Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Ser Asn Val50 55 60Tyr Ala Asp Ser Phe Val Val Lys Gly Asp Asp Val Arg Gln Ile Ala65 70 75 80Pro Gly Gln Thr Gly Val Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp85 90 95Asp Phe Met Gly Cys Val Leu Ala Trp Asn Thr Arg Asn Ile Asp Ala100 105 110Thr Ser Thr Gly Asn Tyr Asn Tyr Lys Tyr Arg Tyr Leu Arg His Gly115 120 125Lys Leu Arg Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Asn Val Pro Phe Ser Pro130 135 140Asp Gly Lys Pro Cys Thr Pro Pro Ala Leu Asn Cys Tyr Trp Pro Leu145 150 155 160Asn Asp Tyr Gly Phe Tyr Thr Thr Thr Gly Ile Gly Tyr Gln Pro Tyr165 170 175Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu Asn Ala Pro Ala Thr Val180 185 190Cys Gly Pro Lys Leu Ser Thr195
<210>63<211>200<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成的SEQ ID NO1的319-518位氨基酸序列，含有受體結(jié)合域<400>63Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Lys Phe1 5 10 15Pro Ser Val Tyr Ala Trp Glu Arg Lys Lys Ile Ser Asn Cys Val Ala20 25 30Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Thr Phe Phe Ser Thr Phe Lys Cys35 40 45Tyr Gly Val Ser Ala Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Ser Asn Val50 55 60Tyr Ala Asp Ser Phe Val Val Lys Gly Asp Asp Val Arg Gln Ile Ala65 70 75 80Pro Gly Gln Thr Gly Val Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp85 90 95Asp Phe Met Gly Cys Val Leu Ala Trp Asn Thr Arg Asn Ile Asp Ala100 105 110Thr Ser Thr Gly Asn Tyr Asn Tyr Lys Tyr Arg Tyr Leu Arg His Gly115 120 125Lys Leu Arg Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Asn Val Pro Phe Ser Pro130 135 140Asp Gly Lys Pro Cys Thr Pro Pro Ala Leu Asn Cys Tyr Trp Pro Leu145 150 155 160Asn Asp Tyr Gly Phe Tyr Thr Thr Thr Gly Ile Gly Tyr Gln Pro Tyr165 170 175Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu Asn Ala Pro Ala Thr Val180 185 190Cys Gly Pro Lys Leu Ser Thr Asp195 200<210>64<211>23<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>合成引物<400>64gatcggatcc ggtacaatca cag 23<210>65<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成引物<400>65gatcgggccc gacacactgg ttc 2權(quán)利要求
1.一種SEQ ID NO1的多肽片段或其保守性變異體，其中所述多肽當(dāng)用于接種動(dòng)物時(shí)可產(chǎn)生體液或細(xì)胞免疫反應(yīng)。
2.一種具有SEQ ID NO13、14、15、20-59、61-63中任何一個(gè)的多肽，其中所述多肽當(dāng)用于接種動(dòng)物時(shí)可產(chǎn)生體液或細(xì)胞免疫反應(yīng)。
3.一種具有SEQ ID NO13、14、15、25、34、46、51、52、56、57、58、59、61、62或63中任何一個(gè)的多肽，其中所述多肽當(dāng)用于接種動(dòng)物時(shí)可產(chǎn)生體液或細(xì)胞免疫反應(yīng)。
4.權(quán)利要求1、2或3的多肽，其中所述多肽在水溶液中可溶。
5.權(quán)利要求1、2或3的多肽，其中所述動(dòng)物為哺乳動(dòng)物。
6.權(quán)利要求5的多肽，其中所述哺乳動(dòng)物為人。
7.權(quán)利要求1、2或3的多肽，其中所述多肽是氨基端或羧基端封閉的。
8.一種偶聯(lián)蛋白，所述偶聯(lián)蛋白含有載體蛋白以及與之偶聯(lián)的具有(a)SEQ ID NO13、14、15、20-59、61-63；(b)SEQ ID NO1的肽片段；或(a)或(b)的保守性變異體中任何一個(gè)的第二多肽。
9.權(quán)利要求8的偶聯(lián)蛋白，其中所述載體蛋白在水溶液中可溶。
10.權(quán)利要求9的偶聯(lián)蛋白，其中所述載體蛋白選自牛血清白蛋白、匙孔血藍(lán)蛋白、卵白蛋白、小鼠血清白蛋白、兔血清白蛋白。
11.權(quán)利要求8的偶聯(lián)蛋白，其中所述偶聯(lián)蛋白當(dāng)用于接種動(dòng)物時(shí)能產(chǎn)生體液或細(xì)胞免疫反應(yīng)。
12.權(quán)利要求11的偶聯(lián)蛋白，其中所述動(dòng)物為哺乳動(dòng)物。
13.權(quán)利要求12的偶聯(lián)蛋白，其中所述哺乳動(dòng)物為人。
14.一種免疫肽，所述免疫肽含有具有(a)SEQ ID NO13、14、15、20-59、61-63；或(b)SEQ ID NO1的片段中任何一個(gè)的多肽以及與之偶聯(lián)的對(duì)氨基苯砷酸、對(duì)氨基苯磺酸、乙酰基或間三硝苯基。
15.權(quán)利要求14的免疫肽，其中所述免疫肽當(dāng)用于接種動(dòng)物時(shí)能產(chǎn)生體液或細(xì)胞免疫反應(yīng)。
16.權(quán)利要求15的免疫肽，其中所述動(dòng)物為哺乳動(dòng)物。
17.權(quán)利要求16的免疫肽，其中所述哺乳動(dòng)物為人。
18.一種免疫組合物，所述免疫組合物包含佐劑和具有SEQ IDNO13、14、15、20-59、61-63；或SEQ ID NO1的片段中任何一個(gè)的多肽。
19.權(quán)利要求18的免疫組合物，其中所述佐劑選自氫氧化鋁、脂質(zhì)A、滅活的細(xì)菌、多糖、礦物油、弗氏不完全佐劑、弗氏完全佐劑、磷酸鋁、鐵鹽、鋅鹽、鈣鹽、乙?；野彼?、乙?；恰㈥?yáng)離子衍生化的多糖、陰離子衍生化的多糖、聚磷腈、生物降解微球、單磷酰脂A和quil A。
20.權(quán)利要求18的免疫組合物，其中所述多肽是氨基端或羧基端封閉的。
21.一種氨基酸序列的肽模擬物，所述氨基酸序列具有(a)SEQID NO13、14、15、20-59、61-63；(b)SEQ ID NO1的片段，或(a)或(b)的保守性變異體中任何一個(gè)。
22.一種免疫組合物，所述免疫組合物包含佐劑和具有(a)SEQID NO13、14、15、20-59、61-63；(b)SEQ ID NO1的片段，或(a)或(b)的保守性變異體中任何一個(gè)的氨基酸序列的肽模擬物。
23.權(quán)利要求22的免疫組合物，其中所述佐劑選自氫氧化鋁、脂質(zhì)A、滅活的細(xì)菌、多糖、礦物油、弗氏不完全佐劑、弗氏完全佐劑、磷酸鋁、鐵鹽、鋅鹽、鈣鹽、乙?；野彼?、乙?；恰㈥?yáng)離子衍生化的多糖、陰離子衍生化的多糖、聚磷腈、生物降解微球、單磷酰脂A和quil A。
24.一種核酸片段，所述核酸片段編碼具有(a)SEQ ID NO13、14、15、20-59、61-63；(b)SEQ ID NO1的片段的肽，或(a)或(b)的保守性變異體中任何一個(gè)的多肽。
25.一種表達(dá)盒，所述表達(dá)盒包含被操作性地連接到編碼具有(a)SEQ ID NO13、14、15、20-59、61-63；(b)SEQ ID NO1的片段的肽，或(a)或(b)的保守性變異體中任何一個(gè)的多肽的核酸片段的啟動(dòng)子。
26.權(quán)利要求25的表達(dá)盒，其中所述啟動(dòng)子為組成型啟動(dòng)子或調(diào)節(jié)型啟動(dòng)子。
27.一種核酸構(gòu)建體，所述核酸構(gòu)建體含有載體和編碼(a)具有SEQ ID NO13、14、15、20-59、61-63中任何一個(gè)的多肽；(b)SEQ IDNO1的片段的肽；(c)(a)或(b)的保守性變異體的核酸片段；或權(quán)利要求25的表達(dá)盒。
28.權(quán)利要求27的核酸構(gòu)建體，其中所述載體選自質(zhì)粒、黏粒、酵母人工染色體、細(xì)菌人工染色體、F因子、病毒、表達(dá)載體和噬粒。
29.一種重組病毒，所述重組病毒含有病毒載體和編碼(a)具有SEQ ID NO13、14、15、20-59、61-63中任何一個(gè)的多肽；(b)SEQ IDNO1的片段的肽；(c)(a)或(b)的保守性變異體的核酸片段；或權(quán)利要求25的表達(dá)盒。
30.權(quán)利要求29的重組病毒，其中所述病毒載體選自牛痘病毒、金絲雀痘病毒、腺病毒和皰疹病毒。
31.一種組合物，所述組合物包含藥用載體和(a)具有SEQ IDNO13、14、15、20-59、61-63中任何一個(gè)的多肽；(b)SEQ ID NO1的片段的肽；或(c)(a)或(b)的保守性變異體。
32.權(quán)利要求31的組合物，其中所述組合物被制成治療SARS-CoV的制劑。
33.權(quán)利要求31的組合物，其中所述組合物被制成抑制SARS-CoV與哺乳動(dòng)物細(xì)胞融合或進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞的制劑。
34.一種組合物，所述組合物包含藥用載體和編碼(a)具有SEQID NO13、14、15、20-59、61-63中任何一個(gè)的多肽；(b)SEQ ID NO1的片段的肽；(c)(a)或(b)的保守性變異體的核酸片段；或權(quán)利要求30的表達(dá)盒。
35.權(quán)利要求34的組合物，其中所述組合物被制成治療SARS-CoV的制劑。
36.權(quán)利要求34的組合物，其中所述組合物被制成預(yù)防SARS-CoV與哺乳動(dòng)物細(xì)胞融合或進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞的制劑。
37.一種病毒性疫苗，所述病毒性疫苗包含藥用載體、病毒載體和編碼(a)具有SEQ ID NO13、14、15、20-59、61-63中任何一個(gè)的多肽；(b)SEQ ID NO1的片段的肽；(c)(a)或(b)的保守性變異體的核酸片段；或權(quán)利要求30的表達(dá)盒。
38.權(quán)利要求34的病毒性疫苗，其中所述病毒性疫苗被制成單位劑量形式。
39.一種肽疫苗，所述肽疫苗包含藥用載體和(a)具有SEQ IDNO13、14、15、20-59、61-63中任何一個(gè)的肽；(b)SEQ ID NO1的片段；(c)(a)或(b)的肽模擬物；或(d)(a)或(b)的保守性變異體。
40.權(quán)利要求39的肽疫苗，其中所述肽疫苗被制成單位劑量形式。
41.一種微生物疫苗，所述微生物疫苗包含藥用載體和表達(dá)(a)具有SEQ ID NO13、14、15、20-59、61-63中任何一個(gè)的肽；(b)SEQID NO1的片段；或(c)(a)或(b)的保守性變異體的微生物。
42.權(quán)利要求41的微生物疫苗，其中所述微生物選自沙門氏菌屬和單核細(xì)胞增生李斯特氏菌。
43.權(quán)利要求42的微生物疫苗，其中所述微生物疫苗被制成單位劑量形式。
44.一種DNA疫苗，所述DNA疫苗包含藥用載體和插入了編碼(a)SEQ ID NO13、14、15、20-59、61-63中任何一個(gè)所示的氨基酸序列；(b)SEQ ID NO1的片段；或(c)(a)或(b)的保守性變異體的核酸片段的載體。
45.權(quán)利要求44的DNA疫苗，其中所述載體選自質(zhì)粒、黏粒、酵母人工染色體、細(xì)菌人工染色體、F因子、病毒和噬粒。
46.權(quán)利要求44的DNA疫苗，其中所述DNA疫苗被制成單位劑量的形式。
47.權(quán)利要求46的DNA疫苗，其中所述DNA疫苗進(jìn)一步含有肌肉壞死劑。
48.權(quán)利要求47的DNA疫苗，其中所述肌肉壞死劑為布比卡因或心臟毒素。
49.一種抗體，所述抗體與SEQ ID NO13、14、15、20-59、61-63中任何一個(gè)所示的氨基酸序列；或SEQ ID NO1的片段結(jié)合。
50.權(quán)利要求49的抗體，其中所述抗體特異性地與SEQ ID NO13、14、15、20-59、61-63中任何一個(gè)所示的氨基酸序列；或SEQ IDNO1的片段結(jié)合。
51.權(quán)利要求49的抗體，其中所述抗體特異性地與S蛋白受體結(jié)合區(qū)結(jié)合。
52.權(quán)利要求49的抗體，其中所述抗體為單克隆抗體、多克隆抗體、單鏈抗體、抗原結(jié)合性的抗體片段或人源化抗體。
53.權(quán)利要求52的抗體，其中所述抗原結(jié)合性抗體片段是scFv、Fv、Fab′、Fab、雙鏈抗體、線性抗體或F(ab′)2。
54.權(quán)利要求49的抗體，其中所述抗體與檢測(cè)標(biāo)記物偶聯(lián)。
55.權(quán)利要求54的抗體，其中所述檢測(cè)標(biāo)記物是熒光蛋白、熒光標(biāo)記物、放射性標(biāo)記物、酶或親和標(biāo)記物。
56.權(quán)利要求49的抗體，其中所述抗體與毒素偶聯(lián)。
57.權(quán)利要求56的抗體，其中所述毒素是A鏈毒素、核糖體失活蛋白、α-帚曲霉素、白樹毒蛋白、曲霉菌素、局限毒素、核糖核酸酶、表鬼臼毒素、白喉毒素、綠膿桿菌外毒素、蓖麻毒素、多柔比星、柔紅霉素、紫杉醇、溴化乙錠、絲裂霉素、依托泊苷、表鬼臼噻吩糖苷、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春堿、秋水仙堿、二羥碳疽菌素二酮、放線菌素D、PE40、相思豆毒蛋白或糖皮質(zhì)激素。
58.一種藥用組合物，所述藥用組合物包含藥用載體和與SEQID NO13、14、15、20-59、61-63中任何一個(gè)所示的氨基酸序列；或SEQ ID NO1的片段結(jié)合的抗體。
59.一種免疫哺乳動(dòng)物以抗嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合征的方法，所述方法包括給予所述哺乳動(dòng)物治療有效量的與SEQ ID NO13、14、15、20-59、61-63中任何一個(gè)所示的氨基酸序列；或SEQ ID NO1的片段結(jié)合的抗體。
60.權(quán)利要求59的方法，其中所述抗體特異性地與SEQ ID NO13、14、15、20-59、61-63中任何一個(gè)所示的氨基酸序列；或SEQ IDNO1的片段結(jié)合。
61.權(quán)利要求59的方法，其中所述哺乳動(dòng)物為人。
62.一種治療哺乳動(dòng)物的嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合征的方法，所述方法包括給予所述哺乳動(dòng)物治療有效量的與SEQ ID NO13、14、15、20-59、61-63中任何一個(gè)所示的氨基酸序列；或SEQ ID NO1的片段結(jié)合的抗體。
63.權(quán)利要求62的方法，其中所述抗體特異性地與SEQ ID NO13、14、15、20-59、61-63中任何一個(gè)所示的氨基酸序列；或SEQ IDNO1的片段結(jié)合。
64.權(quán)利要求62的方法，其中所述哺乳動(dòng)物為人。
65.權(quán)利要求59或62的方法，其中所述抗體與藥用載體或稀釋劑制成制劑。
66.一種治療或抑制哺乳動(dòng)物嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合征的方法，所述方法包括給予所述哺乳動(dòng)物治療有效量的含有SEQ ID NO13、14、15、20-59、61-63中任何一個(gè)所示的氨基酸序列；或SEQ IDNO1的片段的S多肽。
67.一種在哺乳動(dòng)物體內(nèi)誘導(dǎo)抗SARS冠狀病毒刺突蛋白的免疫反應(yīng)的方法，所述方法包括給予治療有效量的含有SEQ ID NO13、14、15、20-59、61-63中任何一個(gè)所示的氨基酸序列；或SEQ IDNO1的片段的多肽。
68.權(quán)利要求67的方法，其中所述多肽含有SEQ ID NO13、14、15、25、34、51、52、56、57、58、59、61、62、63中任何一個(gè)所示的氨基酸序列；或SEQ ID NO1的片段。
69.權(quán)利要求67的方法，其中所述哺乳動(dòng)物為人。
70.一種診斷動(dòng)物嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合征的方法，所述方法包括(a)使獲取自動(dòng)物的生物樣品與SEQ ID NO13、14、15、20-59、61-63中任何一個(gè)所示的氨基酸序列；或SEQ ID NO1的片段結(jié)合的抗體接觸；(b)確定所述抗體是否與所述生物樣品結(jié)合。
71.權(quán)利要求70的方法，其中所述動(dòng)物為哺乳動(dòng)物。
72.權(quán)利要求70的方法，其中所述哺乳動(dòng)物為人。
73.一種制備抗體的方法，所述方法包括獲得被(a)具有SEQ IDNO1所示的氨基酸序列的多肽的肽片段；(b)具有SEQ ID NO13、14、15、20-59、61-63中任何一個(gè)所示的氨基酸序列的多肽；(c)(a)或(b)的肽模擬物，或(d)(a)或(b)的保守性變異體免疫的動(dòng)物；并分離與(a)結(jié)合的抗體。
74.一種制備抗體的方法，所述方法包括獲得被偶聯(lián)蛋白免疫的動(dòng)物，所述偶聯(lián)蛋白具有載體蛋白以及與之偶聯(lián)的(a)具有SEQ IDNO1所示的氨基酸序列的多肽的肽片段；(b)具有SEQ ID NO1、13、14、15、20-55中任何一個(gè)所示的氨基酸序列的多肽；(c)(a)或(b)的肽模擬物，或(d)(a)或(b)的保守性變異體；并分離與具有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列的多肽結(jié)合的抗體。
75.一種試劑盒，所述試劑盒含有包裝材料和與SEQ ID NO1、13、14、15、20-59、61-63中任何一個(gè)所示的氨基酸序列；或SEQ IDNO1片段結(jié)合的抗體或適體。
76.權(quán)利要求75的試劑盒，其中所述抗體與藥用載體或稀釋劑制成制劑。
77.權(quán)利要求75的試劑盒，進(jìn)一步包含注射器。
78.一種試劑盒，所述試劑盒含有包裝材料和治療有效量的含有SEQ ID NO13、14、15、20-59、61-63中任何一個(gè)所示的氨基酸序列；或SEQ ID NO1的片段的S多肽。
79.權(quán)利要求78的試劑盒，其中所述S多肽與藥用載體或稀釋劑制成制劑。
80.權(quán)利要求78的試劑盒，所述試劑盒進(jìn)一步包含注射器。
81.一種單克隆抗體，所述單克隆抗體特異性地與SEQ IDNO1、13、14、15、20-59、61-63中任何一個(gè)所示的氨基酸序列結(jié)合。
82.一種分離的多克隆抗體，所述多克隆抗體特異性地與SEQID NO1、13、14、15、20-59、61-63中任何一個(gè)所示的氨基酸序列結(jié)合。
83.一種適體，所述適體與SEQ ID NO1、13、14、15、20-59、61-63中任何一個(gè)所述的氨基酸序列；或SEQ ID NO1的片段結(jié)合。
84.一種藥用組合物，所述藥用組合物包含藥用載體和與SEQID NO1、13、14、15、20-59、61-63中任何一個(gè)所示的氨基酸序列；或SEQ ID NO1的片段結(jié)合的適體。
全文摘要
本發(fā)明總體涉及到與嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合征(SARS)病原學(xué)上相關(guān)的病毒的刺突蛋白；刺突蛋白的多肽和肽片段以及它們的保守性變異體；編碼刺突蛋白、刺突蛋白的多肽和肽片段、它們的保守性變異體和含有刺突蛋白或其部分的偶聯(lián)蛋白的核酸片段和構(gòu)建體；肽模擬物；疫苗；預(yù)防和治療嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合征的方法；抗體；適體；和含有與刺突蛋白結(jié)合的抗體和適體的試劑盒。
文檔編號(hào)A61K39/42GK1852921SQ200480027159
公開日2006年10月25日 申請(qǐng)日期2004年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月21日
發(fā)明者D·S·迪米特羅夫, X·肖 申請(qǐng)人:美國(guó)政府衛(wèi)生及公眾服務(wù)部國(guó)家衛(wèi)生協(xié)會(huì)